优化的协议<em&gt;麻风分枝杆菌</em&gt;应变管理:冷冻库存保持和维护在无胸腺裸鼠

摘要

麻风分枝杆菌，麻风病的病原体，不长在体外 。我们描述一个易于遵循的协议准备杆菌悬液，以确保大量M的保养麻风用于各种应用。协议通过鼠标脚垫接种，可行性评估，冻融杆菌股票的传播进行了详细的描述。

摘要

麻风病，引起麻风分枝杆菌，是一种重要的传染病，仍然是流行在世界各地的许多国家，包括巴西。目前用于生长分枝没有已知的方法麻风杆菌在体外 ，呈现在这种病原体在实验室的研究中的一大障碍。因此，M的维持和生长麻风杆菌菌株在无胸腺裸小鼠（NU-Foxn1 ^NU）优选执行。都是现成的，易于操作的实验室条件下使用鼠标，并允许标准和协议的发展为实现可重复的结果。在本报告中，我们描述了一个简单的协议，用于从使用胰蛋白酶，这将产生一个悬浮最小的细胞碎片和大量细菌生存能力指数裸鼠脚掌杆菌的净化处理，通过荧光显微镜来确定。的修改，对杆菌计数用抗酸标准方法染色和光镜也被证实。此外，我们描述了一种协议，用于冷冻和解冻杆菌种群为维护分枝的和存储的替代协议麻风杆菌菌株。

引言

麻风病，造成麻风分枝杆菌病，是在世界各地的^1,2许多国家的一个重要的公共卫生问题。尽管被称为一种传染性疾病，影响皮肤和周围神经，还有几个知识差距所涉及的疾病的免疫病理复杂的机制。

其中M的具有挑战性的特点麻风杆菌阻碍其研究是其不能在人工培养基和其相对较长的倍增时间（约14天^）3,4成长。使用M.最具实验性的程序麻风杆菌都设置了杆菌皮损麻风患者或实验动物模型，如犰狳和几个品系的小鼠^5,6纯化。

多年以来，研究人员一直依赖于M的净化从麻风皮损多菌LEPR的OSY患者在实验过程中使用。几个实验室条件下在体外培养活分枝的或维护麻风已经尝试，但到目前为止，动物模型中已被证明是用于研究目的的最合适。在20世纪60年代和70年代，研究人员开始利用老鼠和犰狳检测M.和评估麻风杆菌存活率，响应于抗分枝监测细菌的生长麻风药，并在分枝杆菌菌株^2,4的 ​​生长和维持。

动物模型有一定的局限性，尤其是在犰狳和非人灵长类动物，包括伦理问题，维护成本，需要对动物特别维护基础设施和结果的可重复性差，最终产量。目前，老鼠是首选的模型动物进行麻风病研究。在实验室条件下，使用鼠标随手可得，易于操作，并允许标准化协议 ^{7,8,9。裸鼠中M的维护已被用于杆菌菌株，因为即使具有低可行杆菌负载时，T细胞缺陷型免疫反应导致旺盛肉芽肿的形成和良好杆菌乘法。因此，这种动物模型中的麻风病研究领域获得了广泛的认可。}

在本报告中，我们描述了一个简单的协议，用于从裸鼠脚掌杆菌的酶纯化，用于制备M的麻风杆菌悬浮液以最小的细胞碎片和具有高细菌存活指数。生存能力是通过荧光显微镜，可以在实验室中被迅速地进行测定。我们还证明变形为杆菌计数由冷抗酸染色和光学显微镜的标准方法。此外，我们提出一个替代协议M.维护和贮存麻风杆菌菌株，使冷冻及杆菌ST解冻ocks。

研究方案

1。的麻风分支杆菌制剂暂停

1. 之前安乐死的无胸腺裸鼠（NU-Foxn1 ^NU），准备胰蛋白酶溶液和培养基（试剂协议-协议1，2，3）。安乐死裸鼠4-5个月后接种M.根据AVMA准则动物的安乐死麻风 :2013版^10（动物图像的实验和使用已获批准，并按照Faculdade德Odontologia去包鲁，USP的动物护理委员会的准则进行的）。内部用于处理动物，清洁整个鼠标用70％乙醇酒精的生物安全柜。
2. 用止血钳远端的跗关节握住后爪子。与下面的钳子剪刀剪爪关闭，将其浸入爪子在2％碘20分钟。然后，重复上述步骤为其他后足跖。
3. 转让爪子到清洁的生物安全柜为进一步开展工作。就拿爪子出2％的碘，用无菌纱布擦干，然后收集使用22号或23手术刀刀片两个脚垫，清除所有的软组织（真皮，表皮，肌腱和神经）接近骨头。取出跖骨骨骼和第1和第5趾骨。将材料在无菌培养皿中，并除去表皮，通过用解剖刀刀片刮它关闭。切割组织切成小块，用剪刀，并将它们转移到一个圆底管。重量的组织和加入1 ml Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。置于冰上管，以避免升温的样品。
4. 再加入1毫升的HBSS中，并用组织匀浆器匀化样品。
   1. 一是同质化周期:3个脉冲15秒，速度为4（14,450 RPM）。
   2. 将上清转移到无菌的50ml锥形管中，使它通过细胞过滤，以消除剩余的碎片。让溶液通过由政府一般收入帐目VITY。
   3. 增加额外的2毫升的HBSS中，并重复同质化周期（第1.4.1节），并再次通过样品通过细胞过滤。
   4. 通过加入HBSS使体积至9毫升冲洗过滤器。丢弃的细胞过滤。
5. 解冻的0.5％胰蛋白酶溶液的等分试样。加入1 ml的胰蛋白酶至9​​ ml的细胞悬浮液，得到最终浓度为0.05％的胰蛋白酶。倒掉剩余的解冻胰蛋白酶。在37℃水浴孵育60分钟。温育后，通过加入无菌生理盐水稀释胰蛋白酶使体积达40毫升
6. 离心机在1700×g离心30分钟，在4℃下
7. 通过仔细地颠倒离心管，弃上清。通过敲击管悬浮颗粒，然后加入1毫升无菌生理盐水。将悬液转移到一个新的锥形管测量悬浮液（计算收益率/克组织）的最终体积。
8. 用1米的均质杆菌悬液升胰岛素注射器用26号针头在传送悬浮到一个新的试管中。
9. 通过将它在各媒体2滴（50微升）进行悬浮微生物控制:7H9和改良罗氏培养基，并在37℃下30天，检测污染分枝杆菌。同样，接种脑心浸液（BHI）培养基中孵育24小时后，在37℃下，在污染性好氧菌的检测。
10. 分装成悬浮液管染色:35微升冷抗酸染色（协议2），和200微升的活力测定（协议3）。
11. 后抗酸染色（ZN），计算的抗酸杆菌/毫升（AFB /毫升）的数量。对于裸小鼠接种，准备1×10 ⁸ AFB /毫升的悬浮物;确保有足够的量接种30μL/脚垫/动物（协议5），并保持悬浮冷，直到接种。对于冻结，准备一个1×10 ⁷ AFB /毫升SUS退休金（协议4）。

2。冷抗酸染色

1. 在开始染色前，制备血清/苯酚溶液和ZN染色溶液（试剂的协议 - 协议4和5）。在使用免疫组化笔三个玻璃载玻片画三个圆（内部直径为10毫米）。确定滑动:（1）正常或不经稀释，（2）1:10，和（3）采用1:100的号码2铅笔（注:ZN染色后一些石墨变淡关闭）。
2. 稀释杆菌悬液（步骤1.10）到1:10和1:100连续稀释， 即加5微升未稀释的悬浮液和45微升生理盐水，然后取5微升1:10，加入45微升生理盐水。
3. 添加5微升的血清/苯酚溶液和10μl每圈杆菌悬浮液。均匀化和均匀分布与周围的一次性环路的把手的圆的面积。等待悬挂晾干就平整的表。
4. d时rying，通过传递滑道3倍本生灯（约20秒总^）11的蓝色火焰固定涂片。
5. 对于染色，盖上过滤抗酸carbofuchsine（约5毫升）滑动20分钟的整个表面上。
6. 在冲洗自来水（慢流量）的幻灯片。
7. 覆盖约20秒的10％酸酒精溶液的幻灯片。
8. 在自来水洗一遍幻灯片。
9. 覆盖5分钟亚甲基蓝溶液的幻灯片。
10. 在冲洗自来水幻灯片，让它在室温下晾干。
11. 使用100X油浸物镜计数20场/圈（共60场/幻灯片）。抗酸杆菌/毫升（AFB /毫升）的计算是如下，根据对麻风病¹²实验室技术的描述:
    AFB /场=在3个圈（60场）除以60发现杆菌的总数。
    AFB /毫升= AFB /域x恒圆（区×100除以物镜孔径的面积），并且如果计数稀释的悬浮液中，稀释倍数（10或100）相乘的AFB /毫升数。

3。活力测定

1. 在开始之前，请准备蒸压M。麻风杆菌悬液（试剂协议-协议7）。使用适当的工具包（见表试剂和设备）进行定性测定M的麻风杆菌存活率在悬浮液中。稀释的解决方案如下（所有程序都必须在昏暗的灯光下进行）:稀溶液A以10生理盐水的因素（1微升股票加9微升生理盐水），生理盐水稀释溶液B 20的一个因素（1微升股票加19μL生理盐水）。
2. 加入3.6微升的稀释液A和6微升的​​稀释液B至200微升杆菌悬液进行测试（步骤1.10）的。先前蒸压M。麻风杆菌悬浮液通常用作egative控制的可行性染色。
3. 孵育悬浮液15分钟，在室温下在黑暗中。
4. 离心管中以10,600×g离心5分钟，在4℃下
5. 弃上清，重悬沉淀在15微升10％的甘油。适用于8μl到一个干净的玻片的表面，用小盖玻片覆盖。分析使用荧光显微镜，含有适当的过滤器（见分子探针的建议）的幻灯片。通过比较祥发9（SY）染色，以碘化丙啶（PI）染色评估结果。
   注:SY污渍渗入或死或活细菌的100％，和PI染色渗透只与细菌细胞膜受损。在高压灭菌悬浮液（阴性对照）可以形成由于细胞碎片的存在下的细菌团块。用于活/死评价的半定量尺度变化从0到2 +; 0表明细胞少于30％是呈阳性PI染色，1 +表示30之间 -将50％细胞是阳性PI染色; 2 +是指细胞的50％以上是阳性PI染色。 0分被认为是最适当的使用。

4。冻结/解冻M。麻风悬架

1. 在开始之前，请准备冷冻介质（试剂协议 - 协议6）。对于冻结，请使用下面介绍的步骤:
   1. 加入150μl该悬浮液中含有1×10 ⁷ AFB /毫升，同时加入1ml冻存液的无菌离心管。
   2. 将离心管在冷冻容器中，该容器储存在-80℃下放置24小时。
   3. 冷冻小瓶转移到储藏箱，并将其储存于-80℃。
2. 对于解冻，使用下面介绍的步骤:
   1. 取出冻存管与冷冻悬液-80℃，并将其放置在37℃水浴中解冻开始停牌。
   2. 倒入悬浮液进含有20ml的无菌管生理盐水。混合悬浮液轻轻解冻之前完成。
   3. 离心悬浮液30分钟，在1700×g离心，在4°C。
   4. 弃去上清液，并加入足够的无菌盐水以达到所需的体积。通过一个注射器（步骤1.8）将其均质化的悬浮液。
   5. 对于ZN染色，活力的决心和接种，遵循协议2，3和5。

5。小鼠接种

1. 需要此过程两个人，一个抑制鼠标，另一个管理接种。被接种的动物应根据道德准则和法规的规定办理一切手续必须由机构动物护理和使用委员会批准。由颈背用爪子朝上抑制裸鼠。
2. 通过一个26号针头传递均质暂停。用1ml注射器，抽吸足够杆菌悬浮液接种到TE 2脚垫（30微升/脚垫）。
3. 握住后爪，清洁脚垫用70％乙醇的醇在注射前，用注射针的斜面引入针皮内朝上，从近端至足垫的远端侧。注入30微升悬浮液。足垫注射液可在麻醉的小鼠中进行。
4. 等待5秒后从皮肤抽出的针，以避免接种物的回流之前。老鼠应该被安置在柔软的被褥接种后，并下床活动和自残的迹象进行监测。

结果

该协议的成功可以通过三种方式进行评估。首先，将接种物的质量的评价是通过细胞碎片的量和存活菌在最终悬浮液所得到的百分比（参见方案3）来确定。 如图1和2所示，最终杆菌悬浮液含有非常少的细胞碎片和高存活率（得分0 +）;注意，大多数杆菌沾上祥发9绿色荧光染色（染色穿透死或活的细菌的100％， 图1），只有少数杆菌染色，红色的PI荧光染色（染色渗透仅受损的膜， 图2）的细菌。

图1。祥发9染色 麻风杆菌悬液。绿色荧光演示活着和死了M的存在麻风杆菌 。 400X。

图2。 M的PI染色显示少数死M的麻风杆菌停牌。红色荧光麻风杆菌 。 400X。

第二，具有较高的生存能力的接种会影响杆菌在动物的脚垫乘法接种后4-5个月后，用肉眼可见的病变发展，如视频（协议1）。第三种方式来评估该协议的成功是通过评估空军基地的生存和繁殖的接种已被冻结了不同时期杆菌鼠标脚垫（见协议4）。

"CELLSPACING ="0"> 实验（动物） 的空军基地/毫升冷冻的号码在第0天生存能力得分/天0 冻结期限（天） 冷冻后接种空军基地数冷冻后的生存能力得分的7个月后收回空军基地/毫升数 1（1） 1.0×10 ⁷个 0 + 60 1.7×10 ⁵个 1 + 2.3×10 ⁸个 1（2） 1.0×10 ⁷个 0 + 60 1.7×10 ⁵个 1 + 3.8×10 ⁷个 1（3） 1.0×10 ⁷个 0 + 60 1.7×10 ⁵个 1 + 8.5×10 ⁷个 1（4） 1.0×10 ⁷个 0 + 60 1.7×10 ⁵个 1 + 4.6×10 ⁷个 2（1） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 4.2×10 ⁵个 1 + 1.7×10 ⁷个 2（2） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 4.2×10 ⁵个 1 + 4.8×10 ⁶个 2（3） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 4.2×10 ⁵个 1 + 8.6×10 ⁶个 3（1） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 1.7×10 ⁵个 1 + 1.2×10 ⁷个 3（2） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 1.7×10 ⁵个 1 + 1.8×10 ⁷ 3（3） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 1.7×10 ⁵个 1 + 1.8×10 ⁷ 3（4） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 1.7×10 ⁵个 1 + 2.6×10 ⁷个 3（5） 1.0×10 ⁷个 0 + 15 1.7×10 ⁵个 1 + 3.7×10 ⁶个

表1中。 M的结果麻风杆菌繁殖用冷冻后的悬浮液。

表1描述了M的结果麻风杆菌生长用悬浮液冷冻后。解冻后的悬浮液的可行性比分是1 +。冻结协议被执行了三个独立的实验来测试不同的冻结期。在这两个实验接种冻结15天或60天，结果是相似的，对冷冻后ropagation产生从每个脚垫7个月后接种（ 表1）中回收的空军基地数量10-1000倍。因此，M的冷冻麻风杆菌悬浮在7H9培养基中OADC（油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢 ​​酶），导致维修可行性。

三个接种物用来评价M.后两个不同的冻结期（15和60天） 麻风杆菌繁殖。 7个月后，杆菌是从接种小鼠的脚掌恢复和抗酸染色后计数。半定量存活比例:0表示缺席高达PI染色的细胞的30​​％; 1 +表示之间的PI染色的细胞的30​​-50％; 2 +表示PI染色的细胞的50％以上。 AFB:抗酸杆菌。

讨论

一个图文并茂，成功的协议，用于M的传播的详细说明麻风杆菌是非常需要的。我们的研究表明，接种物制备的过滤和胰蛋白酶消化的协议允许用很少的细胞碎片，并与杆菌的高存活率得到的接种物（得分0 +）。氢氧化钠已被用来分解该组织为杆菌⁶的纯化。使用氢氧化钠为分枝的纯化在我们的实验室中进行的研究麻风杆菌导致形成杆菌的团块，阻碍了暂停活力的决心和动物接种（数据未显示）的同质化。

与接种准备通过过滤和胰蛋白酶消化遇到的潜在问题包括大量的细胞与细菌或真菌剂接种的杂物和污染。若大量细胞DEBR的已被纯化后观察到的，无论是胰蛋白酶不再是活动的或有生物材料的过量。胰蛋白酶原液的酶的活性，必须进行评估。如果初始生物材料过量怀疑，该材料应该分成等份并且协议应分批进行。为了避免与细菌或真菌剂的种菌的污染，必须小心，以处理在无菌条件下的材料。如果真菌和/或细菌污染所检测出的悬浮液应该被丢弃。

本协议的限制是可行的评价使用上述半定量方法的主观性。可行性评估的半定量比较实用，虽然比公布的定量方法⁶不太精确。 0 +和1 +生存能力得分均令人满意，维修传播和冻结麻风杆菌。拉希里等人 。已经表明，接种80-90％可行的接种裸鼠，导致适合于4-5个月接种收获（高生存能力杆菌）脚垫。因此，早期感染（约4个月）是最佳的收获时间。收获冷冻接种后，小鼠，本协议在维持接种的时间较长（6个月），以保证生长曲线。一个关键的步骤，以确保有足够的活力是使用新鲜杆菌悬浮液，优选在收集生物材料从主机和处理后24小时。此外，所用试剂的质量，新鲜制备的稀释胰蛋白酶和活力染色的解决方案，是必要的，以保证可重复的结果。

此协议的另一个限制是，最终的分枝麻风杆菌悬挂是不是免费的宿主DNA，RNA，蛋白质， 等 。因此，其它纯化步骤，必须加入叔Ø获得M。麻风杆菌悬挂自由宿主细胞成分。

一种用于冷冻M的整个组织标本保持存活菌方法麻风病变已经报道^9。然而，这项研究由Portaels 等 。证明显著亏损生存能力，之间65-97％不等冻结和M的解冻后麻风杆菌感染的犰狳⁹获得组织标本。我们的协议表明，在M中观察到的存活指数时相比，并没有被冻结（ 表1）的等分试样冷冻和解冻后麻风杆菌悬浮液丢弃。事实上，冻结M。麻风杆菌悬浮冻结的媒体产生了活力，从50-70％，具有活力得分，1 +，而生存能力得分0 +是在解冻停牌获得。然而，M的乘法麻风杆菌是令人满意的7个月后接种后的裸鼠（ 表1）。裸鼠接种溶，样品保持冷冻60天导致杆菌数平均100倍的增幅相比初始接种。似乎冻结M.麻风杆菌悬浮液代替感染组织标本在冷冻介质，是更有效的。我们的协议的一个关键步骤是在空军基地的慢速冷冻的冷冻集装箱，就要保持杆菌可行，具体表现为科尔斯顿和Hilson的^8。未来的实验将进行较长后，冻结期间，评估杆菌的生存能力。

综上所述，由于M。麻风杆菌不能在体外生长，我们的协议允许快速和容易的替代维护可行的接种物，并成功冻结一步成为可能菌株的维护，无需连续传代的动物，从而使建立定义菌株的一家银行。

本节包含准备试剂执行该协议的指令。

1。胰蛋白酶

胰蛋白酶	0.5克
蒸馏水	至100ml

过滤消毒。储存在-20℃。

2。 7H9

7H9肉汤基地	4.7克
40％甘油	5毫升
蒸馏水	达900毫升

与水混合基再加入甘油，边搅拌边。在高压灭菌121℃20分钟灭菌。贮存于4℃。

3。脑心脏浸液（BHI）

BHI	37克
蒸馏水	达千毫升

高压灭菌121℃，15分钟灭菌。贮存于4℃。

4。苯酚血清

4.1）5％苯酚

苯酚	5毫升
蒸馏水	至100ml

4.2）血清酚

胎牛血清	2毫升
5％苯酚	98毫升

贮存于4℃。

5。冷抗酸染色解决方案

5.1）CarboFuchsin

品红	1克
苯酚晶体融合至60℃	5毫升
纯乙醇	10毫升
蒸馏水	至100ml

每次使用前进行筛选。

5.2），亚甲基蓝基地

亚甲基蓝	3克
95％乙醇	最多至200 ml

5.3）醇酸

70％酒精	990毫升
chloridric酸	10毫升

6。介质冻结:

OADC	10毫升
甘油	20毫升
7H9培养基	至100ml

使用前高压灭菌甘油和经过滤消毒OADC。

7。蒸压M。麻风杆菌悬液

在高压灭菌121℃20分钟。储存在-20℃。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo1°C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova INC	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079