Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

Resumen

La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.

Resumen

La explosión respiratoria de los fagocitos es parte de la respuesta inmune innata a la infección por patógenos e implica la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS son tóxicos y funciona para matar los microorganismos fagocitadas. En la cuantificación in vivo de fagocito-ROS derivados proporciona información con respecto a la capacidad de un organismo para montar una respuesta inmune innata robusta. Aquí se describe un protocolo para cuantificar y comparar ROS en embriones de pez cebra enteros tras la inducción química de la explosión respiratoria de los fagocitos. Este método hace uso de un compuesto no fluorescente que se vuelve fluorescente tras la oxidación por ROS. Individuales embriones de pez cebra se pipetean en los pocillos de una microplaca y se incubaron en este sustrato fluorogénico con o sin un inductor químico de la explosión respiratoria. La fluorescencia en cada pocillo se cuantifica en puntos de tiempo deseado utilizando un lector de microplacas. Las lecturas de fluorescencia se ajustan para eliminar la fluorescencia de fondo y después se compared usando una prueba t no pareada. Este método permite la comparación del potencial de explosión respiratoria de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo y en respuesta a manipulaciones experimentales tales como la precipitación de proteínas, la sobreexpresión, o tratamiento con agentes farmacológicos. Este método también puede ser usado para monitorear la respuesta de estallido respiratorio en los riñones disecados enteras o preparaciones de células de riñones de adultos de pez cebra y algunas otras especies de peces. Creemos que la relativa simplicidad y adaptabilidad de este protocolo se complementan los protocolos existentes y serán de interés para los investigadores que buscan comprender mejor la respuesta inmune innata.

Introducción

El sistema inmune está compuesto por dos ramas: la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es evolutivamente más antigua que la inmunidad adaptativa. Los invertebrados se cree actualmente que sólo tienen inmunidad innata, mientras que los vertebrados poseen tanto las ramas innata y adaptativa. Mientras que la inmunidad adaptativa confiere inmunidad específica y duradera a ciertos agentes patógenos, la inmunidad innata es una respuesta inmediata a las bacterias invasoras, virus y hongos. Un aspecto crucial de la respuesta inmune innata implica la liberación de citocinas y quimiocinas, lo que resulta en la inflamación y el reclutamiento de fagocitos (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos) para engullir y destruir los invasores extraños.

La respuesta inmune innata exitosos involucran: (1) el reconocimiento de microorganismos invasores; (2) la inducción de las cascadas de señalización apropiados (por ejemplo, liberación de citocinas y quimiocinas); (3) de desarrollo adecuado / números adecuados de células fagocíticas; (4) La migración de los fagocitos a sitios de infección; (5) inmersión de patógenos, y (6) la destrucción de microorganismos envueltos. Una deficiencia en cualquiera de estos pasos podría dar lugar al huésped que está siendo abrumado por, y sucumbir a la infección. Una respuesta inmune innata robusta es vital para la salud de los organismos, ya que es la primera línea de defensa contra los patógenos en todas las plantas y animales. En los vertebrados, sino que también potencia la respuesta inmune adaptativa ^1. Por lo tanto, es fundamental que seamos capaces de evaluar todos los aspectos de la respuesta inmune innata, a fin de comprender mejor y optimizar su función.

Muchos organismos modelo se utilizan para estudiar la inmunidad innata, que van desde Arabidopsis a C. elegans a Drosophila a ratones a células humanas cultivadas. Una ventaja de utilizar el pez cebra (Danio rerio) sistema modelo para estudiar la inmunidad innata es que el pez cebra es un vertebrado, con im tanto innata y adaptativadad, sin embargo, el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa están temporalmente separados. El pez cebra se basan únicamente en la inmunidad innata para la protección contra la infección hasta que la inmunidad adaptativa sea plenamente funcional, que produce alrededor de 4-6 semanas después de la fecundación ^2. Además de las herramientas para la manipulación genética, la claridad óptica y rápido desarrollo, externa, la inmunidad innata como el modo de principio de defensa en embriones de pez cebra ofrece un modelo simplificado en el que para estudiar la complejidad de la respuesta inmune innata en vivo.

Múltiples protocolos han sido desarrollados para evaluar las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra. Microarrays y RNAseq han validado que los perfiles de citoquinas producidas por la respuesta inmune innata de pez cebra son similares a la de los seres humanos y también han sugerido la implicación de los genes inesperados en la inmunidad innata ^3,4. La transparencia del embrión de pez cebra y fluorescente, transgenic cepas de patógenos y pez cebra permiten la visualización de las interacciones huésped-patógeno dinámicas in vivo en tiempo real. Embriones de pez cebra transgénicos que expresan GFP bajo el control del promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos-específica ^5,6 o el promotor específico de macrófagos MPEG1 ⁷ han hecho posible para visualizar y cuantificar la migración de fagocitos a los sitios de infecciones localizadas ^8, así como para visualizar la fagocitosis y la destrucción de marcado con fluorescencia patógenos ^8,9. Embriones de pez cebra también son susceptibles a la generación de ensayos de alto rendimiento y pantallas químicos. En consecuencia, recientemente se han desarrollado métodos de alto rendimiento de análisis del transcriptoma después de la infección ¹⁰ y fagocitos migración a los sitios de lesión inducida químicamente ^11.

De las técnicas mencionadas anteriormente, ninguno evaluar cuantitativamente la etapa final de la destrucción de patógenos por los fagocitos. Esta etapa finalimplica un estallido respiratorio (es decir, la producción de ROS y otros compuestos tóxicos), que mata a los patógenos envueltos. La enzima NADPH oxidasa es una fuente importante de ROS en células fagocíticas. Asamblea de las subunidades de la NADPH oxidasa resultados de la enzima en la transferencia de electrones al oxígeno, la generación de aniones superóxido. A través de reacciones enzimáticas posteriores, superóxido a continuación, puede ser convertido en peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (Figura 1A). Es la explosión respiratoria de los fagocitos que mata a los patógenos y, por tanto, la cuantificación de la potencial explosión respiratoria de los embriones de pez cebra es indicativo de la salud inmune innato general. Hemos desarrollado un ensayo basado en la fluorescencia para cuantificar el estallido respiratorio en grupos de embriones de pez cebra individuales ^12. Este ensayo utiliza la no fluorescente, forma reducida de un colorante permeable a las células disponibles comercialmente. Este colorante, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), se convierte en el fluorescentecompuesto ciento, 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCF), tras la oxidación. Los diversos ROS generados por el estallido respiratorio de fagocitos pueden oxidar H2DCFDA y generar fluorescencia ^24. La aparición de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar y comparar la respuesta de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. El acetato de miristato de forbol agonista de la proteína quinasa C (PMA) se utiliza para inducir químicamente NADPH oxidasa para producir ROS y por lo tanto aumentar lecturas de fluorescencia (Figura 1B). Aquí, ofrecemos un protocolo detallado de una versión modificada y optimizada de este embrión ensayo estallido respiratorio de pez cebra. Este ensayo se puede usar para comparar el estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales en el tiempo y / o en respuesta a las manipulaciones experimentales (por ejemplo, morfolino mediada desmontables de proteínas). El uso de este método, en conjunción con otros ensayos de inmunidad innata de pez cebra, proporcionará una imagen más completa de la compleja y críticarespuesta inmune innata.

Protocolo

1. Cuidado y mantenimiento de pez cebra

1. Ganadería: spawn Misa adultos de pez cebra como se ha descrito previamente ^13. Recoger los embriones generados como se ha descrito previamente ^14.
2. La microinyección (si se desea): microinject 1-4 etapa de célula embriones de pez cebra con oligonucleótidos de morfolino a desmontables productos de genes o de ARNm para sobreexpresar productos de genes como se ha descrito previamente ^15.
   1. Mantener un número adecuado de simulacro controles inyectados (por lo menos 48 Viviendo, maqueta inyecta peces de control y 48 Viviendo, pescado manipulado experimentalmente se necesitan para llenar un pozo de microplacas 96).
3. Mantener embriones: Crecer embriones en placas de Petri de profundidad a 28 ° C en agua de huevo (60 g / ml instantánea del mar del océano de la sal en el agua destilada en autoclave-) hasta la etapa de desarrollo que desee (una respuesta estallido respiratorio no es detectable mediante este protocolo en embriones de pez cebra menores de 2 días después de la fertilización ^12). Nota: Ha sido observed que la prevención de la pigmentación en embriones de pez cebra a través de ya sea el uso de 1-fenil 2-tiourea (PTU) o el pez cebra mutante golden/slc24a5 no altera significativamente la inducción de la fluorescencia por PMA (datos no publicados, los embriones a las 48, 72, y 96 HPF).
   1. Retire embriones muertos a diario con una pipeta de transferencia de plástico.
   2. Decantar cuidadosamente el agua del huevo de edad y reponer con agua nueva diaria de huevos.
4. Embriones Dechorionate: En el día del experimento, los embriones dechorionate (si los embriones se encuentran todavía en sus chorions) como se describió anteriormente utilizando dos pinzas finas ¹⁴ (este ensayo estallido respiratorio también se puede realizar en los riñones disecados de adultos de pez cebra ¹² y los protocolos detallados para los riñones la disección de adultos de pez cebra se han descrito anteriormente ^16,17).

2. Preparación de la Solución

1. Preparar una solución madre de H2DCFDA: Pesar 1 mg de H2DCFDA.
   1. Dissolve 1 mg de H2DCFDA en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución de 1 mg / ml.
   2. Hacer 22 alícuotas de esta solución madre en 1,7 ml tubos de microcentrífuga.
   3. Envuelva las alícuotas de H2DCFDA solución madre en papel de aluminio y guardar en la oscuridad siempre que sea posible, porque H2DCFDA es sensible a la luz.
   4. Alícuotas tienda H2DCFDA a -20 ° C hasta por 3 meses.
2. PRECAUCIÓN - Preparar una solución madre de acetato miristato de forbol (PMA): Pesar 1 mg de PMA utilizando el equipo adecuado de protección personal (por ejemplo, guantes, gafas y mascarilla).
   1. Disolver la PMA en 1 ml de DMSO para obtener una solución madre de 1 mg / ml.
   2. Hacer 11 alícuotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga.
   3. Tienda alícuotas de PMA solución madre a -80 ° C durante un máximo de 3 meses.
3. Prepare una solución de trabajo de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo H2DCFDA añadiendo 1 parte de solución H2DCFDA acciones a 1DMSO parte (concentración final de 500 mg / ml H2DCFDA). Por ejemplo, añadir 20 l de solución madre H2DCFDA y 20 l de DMSO a una lámina envuelto 1,7 ml tubo de microcentrífuga.
4. Prepare una solución de trabajo de PMA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo PMA mediante la adición de 1 parte de solución de PMA acciones a 49 partes por nucleasa libre de agua (concentración final de 20 mg / ml de PMA). Por ejemplo, diluir 10 l PMA solución madre en 490 l de nucleasa libre de agua en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
5. Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de dosificación H2DCFDA con una concentración final de 1 mg / ml en agua H2DCFDA huevo. Los volúmenes preparados de las soluciones de dosificación se pueden modificar si lo desea, pero asegúrese de que se mantienen las concentraciones finales de los reactivos. Para los riñones, en lugar de agua de huevo, usar el mismo volumen de medium/F-12 de Dulbecco modificado de Eagle (50% de DMEM, 50% de F-12, sin rojo de fenol). Para hacer 5 ml de H2DCFDAdosificación de solución, utilice un 5 ml pipeta serológica para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un 15 ml tubo de centrífuga cónico envuelto en papel de aluminio y etiquetado 'H'.
   1. Retire 10 l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como 'H' y descarte.
   2. Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA en el tubo cónico de 15 ml etiquetado 'H' y agitar para mezclar (en este volumen es suficiente para 48 embriones o muestras de riñón (la mitad de un muy bien microplaca 96) y estos pozos suministrarán mediciones de nivel de la fluorescencia de fondo).
6. Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA + PMA: En el día del experimento, hacer una solución H2DCFDA + PMA de dosificación con concentraciones finales de: H2DCFDA - 1 g / ml y PMA - 400 ng / ml. Para hacer 5 ml de solución de dosificación H2DCFDA + PMA, utilizar una pipeta serológica de 5 ml para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un nuevo tubo cónico de 15 ml etiquetados 'H + P'.
   1. Retire 110 _6; l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como 'H + P' y descarte.
   2. Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA, a continuación, añadir 100 l de solución de trabajo de PMA en el tubo cónico de 15 ml etiquetados 'H + P' y mezclar en vórtex (este volumen es suficiente para 48 muestras o el otro medio de un completo así microplaca de 96 ).
7. Mantenga las soluciones de dosificación en el hielo.

3. Lector de microplacas Programación

1. Preparar el instrumento: Encienda el lector de microplacas.
   1. Calentar la fuente de luz.
   2. Establecer un programa para leer la fluorescencia: por ejemplo, excitación: 485 nm; emisión: 528 nm; Óptica Posición: top 510 nm; Sensibilidad: 65, con un temblor paso 5 segundos antes de la lectura.

4. 96 Bueno microplacas Set Up (ver Figura 2)

1. Reúna los materiales: Obtenga platos con embriones dechorionated, negro microplaca 96, pipeta p200 yconsejos, cubo de hielo con H2DCFDA y soluciones de dosificación H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipeta, dos depósitos de estériles, papel de aluminio y tijeras.
2. Transferencia de un embrión en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos: Utilice unas tijeras para cortar una punta de pipeta de tal manera que los embriones o los riñones en forma a través de la abertura.
   1. Establecer una pipeta p200 a 100 l y transferir un embrión junto con el agua de huevo (o DMEM/F-12) en la mayor cantidad de los pocillos de una microplaca de 96 negro así lo desea (no es necesario cambiar la punta de la pipeta para cada diferente muestra embrión dentro de una condición experimental, pero puede ser necesario cambiar las puntas entre las condiciones experimentales). Asegúrese de evitar la transferencia de chorions residuales, ya que estos tienden a sesgar los datos recogidos. Para la transferencia de los riñones, una pipeta de volumen grande (ajustado a 100 l) se puede utilizar y puntas de pipeta puede ser cortado para obtener un tamaño de diámetro más grande, si es necesario. Puede ser necesario incorporar pocillos sin muestras de embriones o renales, pero conlas soluciones de dosificación para controlar para algunas manipulaciones experimentales.
3. Añadir soluciones de dosificación: Verter solución de dosificación H2DCFDA en un estéril 25 ml depósito.
   1. Utilizar una pipeta multicanal y p200 ocho consejos para pipetear simultáneamente 100 l de solución de dosificación H2DCFDA en una columna en la microplaca de 96 pocillos (concentración final 500 ng / ml de H2DCFDA).
   2. Repita este (cambiando las propinas no es necesario) para tantas columnas como se desee (normalmente seis columnas o 48 pozos si llenar toda una microplaca de 96 pocillos). Añadir esta solución a la mitad de las muestras de embriones de control y la mitad de las muestras de embriones manipulados experimentalmente (un ejemplo de 96 pocillos de microplacas configurado se muestra en la figura 2, estos pozos (de color naranja) proporcionará los datos de fluorescencia de fondo en las muestras no inducidas con PMA) .
   3. Verter la solución de dosificación H2DCFDA + PMA en una nueva, depósito de 25 ml estéril.
   4. Use una pipeta multicanal p200 y ocho consejos para simultaneously pipetear 100 l de solución de dosificación H2DCFDA + PMA en las columnas restantes (rojo de color en la figura 2) de la microplaca 96 (de cambiar las boquillas no es necesario, las concentraciones finales de 500 ng H2DCFDA-/ ml y PMA-200 ng / ml) .
4. Cubrir la placa con papel de aluminio.
5. Agite la microplaca durante aproximadamente 20 segundos a 150 rpm para homogeneizar las soluciones en cada pocillo.
6. Incubar la microplaca a 28 ° C cuando no se está leyendo.

5. La cuantificación de la fluorescencia

1. Leer la microplaca en el tiempo = 0 h después de la adición de PMA utilizando los parámetros descritos en el paso 3.1.2.
   1. Siga tomando mediciones cada pocos minutos para el intervalo de tiempo deseado o se incuba la microplaca lámina envuelto a 28 ° C hasta un momento posterior y luego tomar una medición de punto final a una hora determinada (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA).
2. Utilice un plástico transfer pipeta para recuperar los embriones procedentes de los pozos.
3. La eutanasia a los embriones de acuerdo a su cuidado de los animales y el protocolo de uso, por ejemplo, la inmersión en MS222 tricaína.
4. Deshágase de la microplaca y otros materiales desechables en el recipiente para residuos biológicos peligrosos.

6. Análisis de Datos

1. Decidir sobre el punto de tiempo en el que usted desea comparar los valores de fluorescencia (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA, Tabla 1).
2. Restar valor de fluorescencia del grupo de control-inducida ONU promedio de los valores de fluorescencia del grupo de control inducida por PMA individual.
3. Repita esto para el grupo experimental con y sin PMA.
4. Guarde estos valores de fluorescencia normalizados en dos columnas, el grupo de control + PMA y el grupo experimental + PMA (Tabla 2).
5. Calcular las medias y las desviaciones estándar para los valores de fluorescencia normalizados del control + Grou PMAP y el grupo experimental + PMA.
6. Comparar los valores de fluorescencia normalizados usando un test t no apareado para determinar la significancia estadística (Tabla 2).
7. Gráfico de los medios de control + grupo de PMA y el grupo experimental + PMA con barras de error reflejan las desviaciones estándar correspondientes.
8. Anote el nivel de significación en el gráfico y en la leyenda de la figura (Figura 2).

Resultados

Aquí, ofrecemos datos que comparan la respuesta estallido respiratorio en los embriones de pez cebra (de tipo silvestre, AB fondo) a 48 y 72 horas después de la fecundación (HPF). Los 48 embriones HPF actuado como nuestro grupo de control y los 72 HPF embriones como nuestro grupo experimental. El tamaño de la muestra utilizada fue de 24 embriones inducidos por la ONU-y 24 embriones PMA inducida por la etapa de desarrollo. Las lecturas de fluorescencia en bruto (en unidades de fluorescencia relativa (RFU)) se obtuvie...

Discusión

La función primaria de los fagocitos es detectar, engullir, y destruir patógenos. La capacidad de los fagocitos para producir una explosión respiratoria adecuada es crítica para esta función. Por lo tanto, la cuantificación de la respuesta de la explosión respiratoria es un método para permitir la comparación de la salud inmune innata y las funciones generales entre los grupos de personas y / o en respuesta a manipulaciones experimentales. Aquí se describe un protocolo para inducir, cuantificar y comparar la r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478