Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Zusammenfassung

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren haben sich Antikörper gegen Oberflächenproteine ​​und Konformationsänderungen in der Neurotransmission im ZNS Autoimmunerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen nachgewiesen. Diese Antikörper wurden verwendet, um die Diagnose und Behandlung zu führen. Zellbasierte Assays zum Nachweis von Antikörpern in Patientenserum verbessert. Sie werden auf der Oberflächenexpression von Gehirn-Antigene auf eukaryotische Zellen, die dann mit verdünntem Patientenserum, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert basiert. Nach dem Waschen wird sekundären Antikörperbindung dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Unsere Gruppe hat ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie Live zellbasierten Assay entwickelt, um Antikörper gegen bestimmte zuverlässig erkennen Neurotransmitter-Rezeptoren. Diese Durchflusszytometrie Verfahren ist unkompliziert, quantitative, effizient, und die Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer System ermöglicht vielen Patienten auf einfache Weise in kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem ist diese Zellbasis alssagen kann leicht angepasst, um Antikörper gegen verschiedene antigene Ziele zu erfassen, die beide aus dem zentralen Nervensystem und der Peripherie werden. Entdecken zusätzliche neue Antikörper Biomarker ermöglicht die schnelle und genaue Diagnose und Behandlung zu verbessern von immunvermittelten Erkrankungen.

Einleitung

In den letzten Jahren haben die Autoimmun Formen des zentralen Nervensystems (ZNS) identifiziert worden. Es hat sich gezeigt, dass diese Krankheiten assoziiert sind und durch die Anwesenheit von Autoantikörpern definiert. Diese Antikörper binden an neuronale Rezeptoren oder synaptische Proteine ​​in ^1,2 Neurotransmission beteiligt ist. Unterschiedliche Antigene erkannt wurden, wie N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) ^3-5, γ-Aminobuttersäure-Rezeptor _{(GABA)-Rezeptor} ^6, α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic (AMPA)-Rezeptor ^7, spannungsabhängigen Kaliumkanals (VGKC) assoziierte Proteine: Leucin-reichen Gliom-aktivierte Protein-1 (LGL-1) und Contactin-assoziiertes Protein 2 (capsr2) ^8,9-, Glutamat-Rezeptor ^5,10 und Dopamin-2-Rezeptor (D2R) ^11. In der Vergangenheit waren diese Autoimmun ZNS-Störungen (vor allem genannt Enzephalitis) oft nicht diagnostiziert und unbehandelt. Diese neuartigen Antikörper Biomarker, z. B.NMDAR Antikörper oder Antikörper D2R, haben wesentlich verbesserte Diagnose und Bewusstsein und haben die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten eröffnet. In der Tat ist eine frühzeitige Behandlung mit Immuntherapien mit verbesserten Ergebnis ^11,12 verbunden.

Traditionelle Verfahren, um Antikörper, wie Enzym-Immunoassay (ELISA) und Western-Blot erkennen sind zum Nachweis von Antikörpern in Seren eingesetzt. Sie sind jedoch nicht ohne weiteres zu ermöglichen Erkennung von extrazellulären Oberfläche oder Epitope und vielmehr kann die Immunreaktivität gegen ein intrazelluläres Epitop zeigen. Weiterhin Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne von wichtigen Proteinen bei der Neurotransmission beteiligt sind, binden wahrscheinlich pathogenen ^2,3,7,13,14 sein. Daher ist die Entwicklung von genauen und empfindlichen Assays zu relevanten Zelloberfläche oder der extrazellulären Antikörperzielen bei Patienten entdecken, von größter Bedeutung. Der Goldstandard-Methode im Bereich basiert auf der Verwendung von lebenden Zellen basieren, in so genannten "Zelle-based-Tests ". Dieses Verfahren umfasst die Expression eines Antigens auf der Oberfläche von Säugerzellen (meistens menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293-Zellen)) in seiner nativen Form durch Transfektion von Vektoren, die die vollständige cDNA-Sequenz des Antigens von Interesse. Live nonpermeabilized Zellen werden dann mit verdünntem Patientenserum inkubiert, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Immunglobulin (Ig)-sekundären Antikörper. Die Intensität oder Fluoreszenzgrad wird dann festgestellt und in der Ebene der Autoantikörper-Bindung verbunden sind. Dieses Verfahren ist spezifisch, da nur ein Antigen in Zellen überexprimiert. Die am weitesten verbreitete "read-out" hat nach Immunzytochemie ^4,5,8-10 gewesen konfokalen Mikroskopie-Analyse. Jedoch Durchflusszytometrie zellbasierten Assays wurden erfolgreich verwendet, um Antikörper in Patienten mit demyelinisierenden Erkrankungen ^15-17 erfassen. Insbesondere Waters et al. ¹⁵ Vergleich der Antikörpernachweis unter Verwendung einer Pfanneel des Antikörper-Nachweistechniken, einschließlich Tests auf Zellbasis, gefolgt von Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert, und hat gezeigt, Durchflusszytometrie Assay auf Zellbasis, um die empfindlichen, genauen und zuverlässigen Methode. Daher ist die Durchflusszytometrie zellbasierten Assay vorteilhaft, wie es ist quantitativ, nicht Prüfer abhängig, und jede Verwendung von radioaktivem Material nicht um. Es ist auch praktisch, da es ermöglicht vielen Patienten, in einer kurzen Zeit untersucht werden.

In jüngerer Zeit haben wir ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-Assay auf Zellbasis, um NMDAR Antikörper und D2R-Antikörper in Patienten mit Autoimmunerkrankungen CNS ¹¹ zu erfassen optimiert. Unsere Gruppe vor kurzem erkannt NMDAR Antikörper in Patientenproben mit Durchflusszytometrie zellbasierte Assays. Diese NMDAR Antikörper-positiven Seren wurden zuvor mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und ebenfalls als positive ¹¹ zu sein. Dieses Protokoll beschreibt einen Durchflusszytometrie Zellen basierender Test für den Nachweis von conformation empfindlichen ZNS-Antikörper in Patientenserum Verwendung eines automatisierten Hochdurchsatz-Sampler.

Protokoll

1. Subklonierung Strategie zur pIRES2-EGFP Vektor Encoding D2R oder NMDAR Construct

1. Erhalten vollständigen cDNA-Klon des menschlichen D2R oder NMDAR-Untereinheit 1 (NR1).
2. Wähle einen Expressionsvektor, wie pIRES2-EGFP, die für die Expression des Transmembranproteine ​​mit Enhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-Reporter unter der Kontrolle einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), so dass die beiden Antigene und GFP in koexprimiert werden Zellen getrennt.
3. Subklonieren menschlichen cDNA innerhalb pIRES2-EGFP-Vektor.
   1. Um subklonieren cDNA, entsprechende Restriktionsenzymen (zB NheI und XhoI Menschen D2R cDNA).
   2. Ligats Schnitt cDNA-Insert in eingeschränkten pIRES2-EGFP-Vektor.
   3. Sequenz ligiert pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor zu überprüfen, ob der Vektor der richtigen Reihenfolge enthält.
   4. Entschlacken und verstärken pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor für die spätere Verwendung in der Transfektion.

itel "> 2. HEK293 Zelltransfektion für Expression neuronaler Antigen

1. Kultur HEK293-Zellen in Gewebekulturflaschen mit frischem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (1 ×) (DMEM) komplett mit 4,5 g / l D-Glucose, L-Glutamin und 110 mg / l Natriumpyruvat, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mM Glutamax und 50 ug / ml Gentamicin.
2. Nehmen HEK293-Zellen unter Verwendung von Trypsin und Transfer zu einem konischen Rohr.
   1. Waschen Zellen durch Zentrifugieren bei 250 g für 6 min und Zellpellet in frischem Komplett DMEM.
3. Zählen Sie die Zellen und Saatgut 6-Well-Platten bei etwa 8 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung und die Kultur über Nacht in 2 ml DMEM bei 37 ° C und 5% CO ₂ im Brutschrank.
4. Nachdem sie etwa 70% Konfluenz erreicht haben, zu transfizieren die HEK293-Zellen mit pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +-Zellen),} pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +-Zellen)} und pIRES2-EGFP (HEK293 ^CTL-Zellen; Vektorregelung) wie folgt.Halten Sie einige nicht-transfizierten HEK293-Zellen für die Entschädigung später.
   1. Bereiten Sie das erforderliche Volumen der Transfektion Mischung, die 2,5 ug DNA wurden 200 ul 0,9% Natriumchlorid und 4 g / ml Polyethylenimin / gut (jeweils 2 ml frisches Voll DMEM).
   2. Unmittelbar verwirbeln die Mischung für 10 sec und bei Raumtemperatur (RT) für 10 min, bevor Volumen der Transfektion Mischung in die entsprechenden Vertiefungen.
   3. Die Platte, wickeln Sie die Seiten mit Parafilm und Zentrifugieren bei 280 g für 5 min zur Transfektion von Zellen unterstützen.
   4. Entfernen der Parafilm und dann im Inkubator setzen die Kultur bei 37 ° C.
   5. 18 Stunden später ersetzen Kulturmedien mit frischen kompletten DMEM und pflegen in einer anderen Kultur für 72 Stunden.
   6. Optional: 72 Stunden nach der Transfektion transfiziert Zellen durch Kultur in komplettem DMEM mit 250 ug / ml Geneticin ergänzt ausgewählt werden, um einen polyklonalen stabilen Transfektanten zu erhalten.

3. Durchflusszytometrie zellbasierten Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen neuronale Antigene Oberflächen

1. Lösen HEK293 ^{NMDAR +} HEK293 ^{+ D2R} und HEK293 ^CTL-Zellen durch Inkubation mit 500 &mgr; l / Vertiefung Versene für ca. 5 min bei 37 ° C.
   1. Resuspendieren in 2ml/well PBS ^{(Ca-2 +} / Mg ^{2 +)} mit 2% FBS (PBS / FBS) und die Lösung in einen 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen ergänzt.
   2. Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 6 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 15-50 ml PBS / FBS. Wiederholen Wasch 2x.
   3. Zählen Sie die Zellen und dann in PBS / FBS Resuspendieren in 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
2. Entwerfen Sie die 96-Loch-Vorlage für die Durchflusszytometrie Erwerb, bedenkt, dass HEK293 ^{D2R +} oder HEK293 ^{NMDAR +} Zellen sowie HEK293 ^CTL-Zellen müssen mit jeder Patientenprobe oder primären Antikörper inkubiert werden.
3. Samenzellen in einem V-Boden, Platte mit 96 Vertiefungen mit 50.000 Zellen / well nach der Durchflusszytometrie Erfassungsschablone.
4. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren der 96-Well-Platte bei 450 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit Hilfe eines elektronischen oder manuellen Mehrkanalpipette, Kippen der Platte auf einem Winkel und kümmert sich nicht um das Zellpellet abzusaugen.
5. Inkubieren HEK293 ^{D2R +} HEK293 ^{+ NMDAR} und HEK293-Zellen, ^CTL für 1 h bei RT im Dunkeln mit:
   1. Serielle Verdünnungen des primären Antikörpers, um Antigen-Oberflächenexpression zu beurteilen.
   2. Patientenproben, um Antikörper zu erkennen.
6. Verwenden Sie geeignete Durchflusszytometrie Kompensationskontrollen, zB. ungefärbten transfizierten HEK293-Zellen, HEK293-Zellen GFP ⁺ (AF647 ^-) und nicht-transfizierte HEK293-Zellen AF647 ⁺ (GFP).
7. Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 170 &mgr; l PBS / FBS. Wiederholen Waschschritt noch zweimal.
8. Zellen Inkubation für 1 hr bei RT im Dunkeln mit 1:100-Verdünnung von AF647-konjugierten sekundären Antikörper (Anti-Human-IgG für Patientenserum und Anti-Maus-IgG-anti-NR1-oder Anti-D2R primäre Antikörper).
9. Dreimal Waschen Sie die Zellen, wie in Schritt 3.7, und resuspendieren in 35 ul PBS / FBS für die Durchflusszytometrie Zell Akquisition.
10. Die Hochdurchsatz-Sampler (HTS) auf dem Durchflusszytometer (BDLSRII) ein.
11. Erwerben 10.000 Events / Well nach der Durchflusszytometrie Erwerb Vorlage.
12. Export und Analyse von Daten für die Analyse unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-Software-Paket, wie FlowJo v7.5:
    1. Zunächst Tor die Live-HEK293-Zellen auf Basis von vorne (Größe) und Seite (Granularität), der zerstreut.
    2. Weitere Live-Gate HEK293-Zellen auf der Grundlage hoher GFP-Positivität, nur die transfizierten Zellen zu analysieren.
    3. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der AF647 Kanal innerhalb der Live GFP-positiven Zellen.
    4. Exportieren von Daten in Excel oder Prism für die Analyse:
       1. Grundstück concentrations des primären Antikörpers (anti-NMDAR oder Anti D2R-Antikörper) gegen den MFI erhalten aus den Zellen mit diesen Antikörpern inkubiert.
       2. Für jeden Patienten und Kontrollprobe, bestimmen die ΔMFI durch Subtrahieren der MFI des ^CTL HEK293 Zellen aus der MFI des HEK293 ^{D2R + + NMDAR} oder HEK293 Zellen.
       3. Berechnen Sie die Schwelle von Antikörper-Positivität von über dem Mittelwert ΔMFI des Steuer Kohorte um drei Standardabweichungen.
       4. Grundstück einzelnen Proben nach ihren Serum Typ gruppiert in einem Diagramm darstellen und die Schwelle als eine Zeile.

Ergebnisse

Leben HEK293 ^{D2R + CTL} und HEK293-Zellen wurden mit dem Durchflußzytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erworben. Bei der Analyse wurden die Zellen auf Basis von Vorwärtsstreuung (Größe) und Seitenstreuung (Granularität) Parameter (1A und 1D) verknüpft. HEK293-Zellen das Reportermolekül, GFP, im Zytoplasma und nicht transfizierten Zellen wurden von der Analyse (Fig. 1B und 1E) ausgeschlossen. Innerhalb der GFP

Diskussion

Dieser Aufsatz beschreibt eine neuartige Anwendung der Durchflusszytometrie Live-Assay auf Zellbasis, um Antikörper, die gegen spezifische Zelloberflächen neuronale Proteine ​​unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erfassen. Mit dieser Technik berichten wir, dass eine Untergruppe von Patienten mit Autoimmun ZNS-Erkrankungen betroffen sind, Serum-Antikörper an die Oberfläche oder in Oberflächen NMDAR D2R.

Wesentliche Schritte für eine optimale Antikörpernachweis unter Ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180