신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

요약

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

초록

병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에​​ 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다.

여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수​​있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다.

이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.

서문

심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 ^{2 +에} 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca ^{2 +의} 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실행 가능한 심근 세포의 분리는 완전히 심장 질환의 병태 생리를 이해하고 새로운 치료 방법을 확인하는 것이 필수적이다.

심방 부속기는 종종 수술 과정에서 폐기 될 때 인간의 심방 조직을 쉽게 사용할 수 있습니다. 성인의 심장 활동 전위와 이온 CU의 초기 양적 연구rrents는 효소 고립 심방 세포 ^1-4을 채택했다. 활동 전위 또는 격리 된 성인의 심실 세포에서 전류의 기록은 이후 ^{3,5-10을보고되었습니다.} 이러한 연구의 대부분은 외식 마음에서 얻은 고립 된 세포를 얻기 위해 콜라하는 관상 동맥 세그먼트 또는 절제된 조직의 상대적으로 많은 양의 노출의 콜라게나 제 관류 중 하나를 활용 한 세포를 사용했습니다. 이러한 연구는 건강한 마음에서 인간의 심실의 심근에서 터미널 심부전 환자에서 횡단 이온 전류의 수의 상세한 특성을 허용했다. L 형의 기록은 칼슘 ^{2 +} 전류 (I _CA-L) ^5-7, 일시적인 외부 칼륨 전류 _(I가) ^8, 정류기의 칼륨 내향 전류 (I가 _κ1) ^8, 지연 정류기의 칼륨 전류의 다른 구성 요소는 (나는 _κ ) ^{9가보고되었습니다.} 발전 및 정제분리 절차 ^(10)는, 활동 전위 연장 ^(11)를 포함하는 단말기 심장 마비의 증가 부정맥 가능성의 이온 기준의 명확한 특성을 허용 depolarizations ¹² 후 지연 및 이완기 탈분극과 조기 박동을 선도 재미 현재 ¹³ 증가.

성인 심장 근육 세포는 일반적으로 다양한 효소 혼합물과 온 마음, 칼슘 ^{2 +} 허용 전지 ^(14)의 높은 수율을 생산하는 기술의 역 행성 관류 작은 동물에서 격리됩니다. 조직의 파편에서 심장 근육 세포의 분리는 아마 때문에 관상 동맥의 관류에 의해 달성과 비교하여 각각의 근육 세포에 효소의 제한된 액세스의 본질적으로 덜 성공합니다. 인해 미사용 도너 하트 매우 제한된 가용성, 정기적으로 통상의 인간 심실 세포를 얻는 유일한 실용적인 방법은 효소 digestio입니다선택적 수술 중에 절제 종종 매우 작은 조직 조각의 명. 철저하게 세포 수준에서 특징으로 한 인간 질병 모델은 이식 마음에 접근성으로 인해 터미널 심장 마비입니다. 그러나 터미널 심장 마비 환자의 소수에서 발생하고 종종 근본적인 원인 ^(15)의 상대적으로 독립적 인 심근 세포의 심한 개조의 일반적인 경로를 포함한다. 질병의 초기 단계에서 비 실패한 환자에서 단일 심장 근세포의 기능을 평가하는 능력은 다른 상속 또는 취득 조건의 구체적인 기전을 이해하는 것이 중요하다. 비후성 심근증 (HCM)는 말하고 예입니다. HCM은 일반 (1 / 500 개인) 심장 비대 특징으로 상속 심장 조건으로 인해 유출로 협착 및 이완기 기능 장애 ¹⁶ 부정맥 위험과 수축 변경을 증가합니다. HCM의 마음에서 심근 U셀 구조의 변화 (비대, 근원 섬유 혼란)과 EC-커플 링 ^(17)을 포함하는 복잡한 리모델링 프로세스를 ndergo. 그러나, HCM의 심장 세포 기능 장애의 대부분의 정보는 형질 전환 동물 모델에서왔다. HCM 환자의 소수에 불과 터미널 심부전으로 발전과 심장 이식을 필요로하기 때문에, HCM 마음은 표준 방법과 세포의 분리에 매우 드물게 사용할 수 있습니다. 그러나, HCM 환자의 30 % 이상은 수축기 (HCM) ^18시 대규모 중격 비대 바꾸는 유출 요로 혈액의 흐름에 의한 폐색 증상을 개발할 수 있습니다. HCM에 방해의 기복을위한 가장 효과적인 가능한 치료 옵션은 수술 중격 절제술​​입니다 :이 수술하는 동안, 상단 격막의 변수 크기의 부분은 트랜스 대동맥 접근 방식에 의해 제거된다. 비대 격막의이 부분은 신선한 조직에서 세포 분리를위한 따라서 사용할 수 있습니다.

인간 ventricula의 분리를위한 방법R 하나의 작은 경정맥 심 내막 심근 생검 조직에서 근육 세포는 이전에 개발 된 ^19를 발표하고있다. 우리는 중격 절제술​​ 및 밸브 교체 절차를받은 환자를받은 HCM 환자를 포함하여 심장 수술을받은 환자에서 심실의 심근 샘플에서 단일 중격 근육 세포를 분리하는 방법을 구현했습니다. 분리 프로토콜, 대표적인 전기 생리학 및 CA ^{2 +} 형광에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 측정은 고립 된 인간의 심실의 심근 세포의 생존 및 패치 클램프 및 세포 내 칼슘 ^{2 +} 연구의 가능성을 보여되게됩니다.

프로토콜

인체 조직에 대한 실험 프로토콜은 Careggi 대학 병원 (, 2009 년 갱신 2006 / 0024713)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 각 환자는 서면 동의서를 주었다.

1. 솔루션 및 장비 제조

용액은 표 1에 기재되어있다. 세포 격리 절차의 간략화 흐름도는도 1에서 발견된다.

해결		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
시약 (MM)	KH 2 PO 4	(50)
	망초	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	아데노신	5
	포도당	(140)	10	(20)	10		10	10
	만니톨	(100)
	타우린	10	(20)	5			(20)	(20)
	염화나트륨		113		136		113	113
	의 KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl2를				1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	(30)			0.6	0.6
	나 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	탄산 수소 나트륨		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	NA-피루 베이트		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	숙신산			5
	EGTA			0.5
	K 2 - ATP			2
	피루브산			5
	크레아틴			5
	KMES					115
효소 (U / ㎖)	콜라게나 유형 V						250	(250)
	단백질 분해 효소 타입 XXIV						4
pH를		7.4 KOH	7.3의 NaOH	7.1 KOH	7.35의 NaOH	7.2 KOH	7.3의 NaOH	7.3의 NaOH

.. 표 1 표본 수집, 세포 분리 및 근육 세포의 기능 특성 CP = 심정지 솔루션에 사용되는 솔루션; DB = 해리 버퍼; KB는 = 크래프트 - Bruhe 솔루션; TB = 타이로드 버퍼; PS = 피펫 솔루션; EB1 = 효소 버퍼 1; EB2 = 효소 완충액 2.

1. 심정지 (CP) 솔루션을 준비합니다. CP 솔루션은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 칼슘 ^{2 +} 무료 해리 버퍼 (DB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다.
3. 크래프트 - Bruhe (KB) 솔루션을 준비합니다. KB 솔루션은 최대 1 잠깐 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다K.
4. 칼슘 ^{2 +} 무료 타이로드 버퍼 (TB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다.
5. 사용 전에 주사기 필터를 사용하여 모든 해법 필터.
6. 소화 장치 (그림 2), 전기 모터에 의해 회전 중 하나는 실리콘 엘라스토머의 마주 보는 두 브러쉬, 만든 긁는 용기를 준비합니다. 소화 장치가 정의되어 있습니다. 소화 장치에 대한 세부 사항은 그림 8에있다; 장치의 이미지는 그림 2 C 및 2D에 있습니다. 70 %의 에탄올과 물과 조직 챔버를 씻으십시오.

심근 샘플 2. 수집 및 처리

1. 50 ML 튜브에 cardiplegic (CP) 용액 40 ㎖를 붓고는 세포 격리 실험실에 수술 방에서 표본 교통 얼음에 저장합니다.
2. 얼음 추위로 씻어, 즉시 절제 후 수술 방에서 심실 심근 표본을 수집CP 솔루션과 튜브에 저장합니다. 심장 수술시 상단 간 심실 중격, 가중치> 100 밀리그램 절제 심 내막 표본을 사용합니다.
3. 급속 랩 영역으로 시험편을 전송; 시편 절단에서 10 분 이내에 시료 처리를 시작합니다.
4. 아이스 콜드 CP 버퍼의 표본을 유지하면서, 신중하게 실체 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 심 내막 섬유 성 층을 제거; 그 후, 작은 조각 (긴 2-3mm)에 심근 조직을 잘라. 조직 샘플의 크기에 따라, 각각의 분리를 위해 100 밀리그램 1g 사이의 심실의 심근의 총 금액을 잘라.
5. 조직 닦지 완료되면 깨끗한 얼음 차가운 CP 솔루션, 소화 장치에 심근 청크를 전송합니다. 더 이상 전체 조직의 1g 이상을 사용하지 않고, 심근 덩어리 두 개의 실리콘 브러쉬의 전체 볼륨 (3-4 ㎖)에 작성하지 마십시오.

3. 세탁 및 심근 덩어리의 소화

1. 선미덩어리가 소화 장치의 스크 레이 핑 챔버로 전송 어, 차가운 칼슘 ^{2 +} 무료 해리 버퍼 (DB)와 챔버의 CP 버퍼를 변경합니다.
2. 욕조에서 가열 된 물 (그림 1)과 접촉 될 수있는 챔버에 대한 위해, 온도 조절 욕조에 소화 장치를 놓습니다. 37.5 ° C로 목욕을 설정하고 천천히 조직 챔버의 온도를 올리기 위하여, 전원을 켜십시오. 1 회전 / 초에 회전 속도를 설정, 소화 장치의 모터의 전원을 켭니다.
3. 매 8 분 깨끗한 DB와 챔버 내의 용액을 변경 DB로 3 회 세척을 수행한다. DB는 (37 ° C에서)를 따뜻하게하고 산소가 심근 덩어리와 접촉 얻기 전에 포화 상태입니다.
4. DB 솔루션에 콜라게나 유형 V와 4 U / ㎖ 프로테아제 유형 XXIV 250 U / ㎖를 추가하여 효소 버퍼 1 (EB1)를 준비합니다. DB 솔루션에 250 U / ㎖의 콜라게나 제 유형 V를 추가하여 효소 버퍼 2 (EB2)을 준비합니다. (37 ℃)과 oxygenat 워밍업전자 EB1과 EB2.
5. (37 ° C에서) 100 % 산소 EB1으로 회전 소화 장치에서 소화의 두 12 분주기를 수행합니다. 각주기에서 EB1의 ~ 3 ㎖를 사용합니다. 피펫 흡인하여 솔루션을 제거하고 각 사이클 후 폐기합니다.
6. 세포 수집 및 ~ 버퍼를 용출 감기 (4 ° C) KB 용액 80 ㎖를 위해 6 ~ 15 ML 튜브를 준비합니다.
7. 37 ℃에서 3 ㎖ 100 % 산소 EB2로 처음 15 분 소화주기를 수행 소화 사이클 후, 15 ㎖의 튜브에서 제 해리 근세포를 포함하는 용액을 수집하고 12 ml의 차가운 KB 용액으로 세포 현탁액을 희석. 실온에서 튜브를 보관.
8. 다음 소화 사이클 동안 콜라게나 V의 농도를 반감하기 위해 DB의 동일한 양으로 잔존 EB2 용액을 희석.
9. 37 ° C에서 3 ㎖의 EB2와 다른 5 12 분 소화주기를 수행; 각각 후 15 ML 원뿔 튜브에 버퍼를 포함하는 심근 세포의 수집12 ML의 KB 솔루션을 희석. 실온에서 30 분 동안 6 셀 함유 튜브를 저장한다.

4. 셀의 재 부상과 칼슘 ^{2 +} Readaptation

1. 20 ㎖ 칼슘 ^{2 +} 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)를 추가합니다. 솔루션을 필터링합니다.
2. 해결하는 심근 세포를 강제로 5 분 100 XG에 여섯 심근 포함하는 원뿔 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 실온에서 TB를 포함하는 BSA의 (수율에 따라 1-3 ML) 변수 양의 각각의 튜브에 세포를 재현 탁.
3. 점차적으로 100 밀리몰 / L의 _염화칼슘 용액을 작은 분량 씩 추가하여 셀이 포함 버퍼에 칼슘 ^{2 +} 농도를 증가시킨다. 제 1 및 제 2 단계에서 칼슘 ^{2 +} 농도는 각각 50 μmol / L, 100 μmol / L까지 발생합니다. 다음 칼슘 ^{2 +} 추가 단계는 5 분마다 수행하고 농도는 각 단계 t에서 100 μmol / L에 의해 발생합니다0.9 밀리몰 / L의 OA 최종 농도
4. 분리 과정의 수율을 평가. 현미경의 유리 바닥 챔버에 심근 함유 용액 0.5 ㎖를 전송합니다. 10 배 목표 배율에서 15 현미경 필드를 평가하고 (클리어 줄무늬와 유의 흠 예를 들어, 막대 모양의 세포, 그림 2) 건강한 심근 세포의 비율을 계산합니다. 예상 수익률은 약 20 %이다.

고립 된 심근 5. 기능 평가.

다음 프로토콜은 활동 전위와 세포 내 ^칼슘 이온 플럭스의 동시 등을 포함하여 인간의 심근 세포 기능 평가의 예입니다.

1. 천공 패치 구성의 패치 클램프 실험을 위해 피펫 솔루션 (PS)을 준비합니다. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 칼슘 ^{2 +} 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1.8 밀리몰 / L의 _{염화칼슘을} 추가합니다. 유SE 패치 클램프 / 형광 실험 도중 심근 superfusion이 솔루션입니다.
3. 1.5 ML 튜브로 전송 세포 현탁액 1 ㎖를 10 μmol / L Fluoforte 10 μL의 Powerload 집중을 추가합니다. RT에서 30 분 동안 품어. 그 후, 수직으로 튜브를 설정하고 5 분 동안 정착 셀을 떠나; 캘리포니아에있는 세포를 재현 탁 ^{2 +} TB를 포함.
4. (: 37 ± 0.5 ° C의 온도)의 작은 (0.5 ㎖)에 세포 현탁액 0.25 ㎖의 전송, 온도 조절 현미경은 0.3 ㎖ / 분의 유속으로 가열 microperfusor 시스템 중력 superfused 기록 챔버를 탑재.
5. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3 ~ 5 ㎛의 팁 직경 PS 가득 3 M 4.5에의 저항으로 패치 클램프 피펫을 준비합니다.
6. PS (250 ㎍ / ㎖)의 배치에 암포 테리 신 B를 추가하고 전극을 채우기 위해 사용합니다.
7. 흠없는 명확한 줄무늬가있는 막대 모양의 세포, FO를 선택접속 저항이 20 MΩ을 떨어질 때까지 RM, 5 ~ 10 분 기가 씰을 기다립니다.
8. 자극의 상이한 주파수 (Hz에서 0.2, 0.5 Hz에서 1 Hz의 각 주파수에서 1 분)에서 짧은 펄스 (<3 밀리 초)를 사용하여 전류 클램프 모드에서 활동 전위를 유도. 녹음 단계에서 492 ± 3 nm의 시야 조명을 켜고 505-520 nm에서 Fluoforte 형광을 감지합니다. 형광을 획득하고 Digidata 1440A와 pClamp 10.0 소프트웨어를 사용하여 잠재적 인 신호를 멤브레인. 필요한 경우 기록 순서를 여러 번 반복; 그러나, 각 셀에 대한 15 분 아래의 총 녹화 시간을 유지.

결과

비 실패한 비 비후성 수술 환자 ^(21)와 비교하여 상술 한 방법은, 조작 절제술을 시행 비대성 심근증 (HCM)를 가진 환자의 심실 중격으로부터 격리 심근의 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용 하였다. 이 섹션에 포함 된 결과를 해당 워크 ^{(21)로부터} 유도되며이 기술은 심장 질환 조건에서 심근 세포 기능의 변화를 특성화하는 데 사용될 수있는 방법의 예로서 여기에 도시되어있다. <...

토론

우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 ^8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.