Fare Siyatik Sinir Vivo elektrofizyolojik ölçümlerde

Özet

In vivo sinir iletim özelliklerinin ölçümleri nöromüsküler hastalıkların çeşitli hayvan modelleri karakterize etmek için güçlü bir araç örneklemektedir. Burada, biz anestezi farelerin siyatik sinirlerin elektrofizyolojik analizi yapılabilir hangi ile kolay ve güvenilir bir protokol mevcut.

Özet

Elektrofizyolojik çalışmalar patofizyoloji ¹ anlayış, birlikte nöropatolojik teknikleri ile çeşitli nöromüsküler hastalıklar rasyonel bir sınıflandırma izin ve yardım vardır. Burada in vivo fare siyatik sinirlerin elektrofizyolojik çalışmalar gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Hayvanlar, test edilen fareler için analjezi sağlamak amacıyla izofluran ile anestezi uygulandı ve yaklaşık 30 dakika / hayvan almak ölçümler sırasında çalışma ortamı engellenmez. 37 ° C'lik bir sabit vücut sıcaklığı bir ısıtma plakası ile tutulur ve bir termo rektal sonda ² ile ölçülür. Buna ek olarak, bir elektrokardiyogram (EKG) rutin olarak sürekli olarak incelenen hayvanların fizyolojik durumunu izlemek amacıyla, ölçümler sırasında kaydedilir.

Elektrofizyolojik kayıtlar siyatik sinir th en büyük sinir yapılmaktadırmotorik ve duyusal hem de elyaf yolları ile fare arka uzuv temin e periferik sinir sistemi (PNS),. Protokolde, siyatik sinirler yerinde kalır ve bu nedenle ekstre veya maruz zorunda değilsiniz, gerçek kayıtları ile birlikte herhangi bir olumsuz sinir tahriş olmadan ölçümler sağlar. Uygun iğne elektrotlar ³ kullanma biz gastrokinemius kaslara algılama elektrotlar ile iletilen potansiyelleri kayıt, yakın ve uzak sinir uyaranları hem de gerçekleştirin. Veri işleme, güvenilir ve sinir iletim hızı (NCV) ve bileşik motor aksiyon potansiyeli (CMAP) için son derece tutarlı değerler, brüt periferik sinir işleyişi ölçümü için anahtar parametreler, elde edilebilir sonra.

Giriş

Elektrofizyolojik ölçümler klinik ve laboratuvar ortamında hem de periferik sinirlerin fonksiyonel bütünlüğünü araştırmak için vazgeçilmez bir araç bulunmaktadır. İnsanlarda, nöromüsküler bozukluklar ve nöropatilerin, çok sayıda teşhis elektrofizyolojik ölçümlere dayanmaktadır. Iletim hızı ya da sinyal amplitüdleri potansiyel olarak sinir özellikleri ölçerek, periferik sinir hastalıkları kaba kökenini karakterize etmek mümkündür.

Sinir iletim hızı miyelinasyonda tarafından etkin, hızlı sinyal yayılması son derece bağlıdır. Bu nedenle, demiyelinizan süreçleri genellikle iletim hızları ⁴ azalma göstermektedir. Bileşik motor aksiyon potansiyeli (CMAP) - fonksiyonel akson sayısı ile ilişkilendirilmesi - anlamlı ⁵ azaltılmış aksonal hasar için bir göstergedir.

Bu nedenle, elektrofizyolojik yöntemler vasıtasıyla periferik sinir hasarı etyolojisiörneğin kalıtsal nöropatiler ^6,7, diyabetik nöropati ^8,9, kronik enflamatuvar demiyelinizan polinöropatiler (CIDP) ¹⁰ ya da metabolik nöropatiler ¹¹ için olduğu gibi, ayırt edilebilir.

Normalde, insan uygulamasında sural veya ulnar sinire invaziv kayıtları tercih edilir. Ve motorik ve duyu sisteminin küçük kalibreli aksonlar - Farelerde, siyatik sinirlerin sinir özellikleri, büyük hem de içeren periferal sinir sisteminin (PNS) en büyük sinir analiz basittir.

Burada gösterildiği gibi prosedür sağlam fare periferik sinirler elektrofizyoloji hakkında tüm standart değerlerini ölçmek için hızlı, kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Korunmuş bir organizmadan kayıtları alarak, sinir ortamının fizyolojik koşulları garanti edilir.

Protokol

Bu çalışma Almanya Federal Cumhuriyeti (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) Hayvanlar Yasası Korunmasına göre yapıldı ve Gıda Güvenliği ve Tüketiciyi Koruma (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) için Thüringen Eyalet Dairesi tarafından onaylandı.

1.. Ölçümleri Kurma

1. Izofluran / O ₂ inhalasyon yoluyla fareler anestezi - anestezi% 3 başlatılması için,% 100 oksijen bakım izofluran% 2 (Şekil 1). Böyle hareket refleksleri ve düşük-dereceli ağrı duyarlılık testleri gibi basit reflekslerinin testi ile yeterli anestezi onaylayın. Prosedür genellikle toplam sadece 30 dakika / hayvan sürer, çünkü anestezi sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanılması önerilir, ancak vazgeçilmez değil. Sağkalım deneylerde durumunda, ameliyat sonrası ağrı yönetmek için zamanında uzun etkili analjezikler yönetmek.
2. Elektrikli ustura ile arka bacaklarda kaplayan kürk tıraş ve hayvanlar analjezi altında zaten ise piyasada mevcut saç dökücü krem ​​ile epilasyon gerçekleştirin. Prosedür boyunca patojen-serbest statülerini korumak için, aseptik eldiven giyin ve her zaman dikkatli bir şekilde% 70 etanol ile temizlenmiş araçlarını kullanın.
3. Bir geri besleme kontrollü ısıtma plakası ve rektal ısı probu (Şekil 2) ile kontrol vücut ısısı kararlılığı. Eğer gerekli ise, steril bir deney ortamı tutmak için hayvanlar arasında, ısıtma plakası karşılamak için steril bir örtü kullanın. Ayrıca, elektronik olarak doku hasarını önlemek için 40 ° C ≤ için ısıtma sıcaklığı sınırlamak için entegre bir sensör ile kontrol edilir, bir ısıtma levhası, kullanımı tavsiye edilir.
   
   Şekil 1. Exptıraşlı arka uzuvları ile bir anestezi fare gösteren erimental kurulum.
4. (EKG) kayıtları hayati bir parametre olarak kalp atışlarının izlenmesi için elektrokardiyografi çekmek. Boyun bölgesinde deri altında, her ön ayakları ve bir elektrot deri altında bir elektrot aşağıdaki gibidir: ECG kayıtları için üç elektrotlar yükleyin.
5. Optimum iletkenlik / transfer direnci için iletişim jel kullanarak Sıra halka elektrotlar. (Siyah etiketli) algılama elektrodu gastrokinemius kası maksimum çapa sahip pozisyonda yerleştirilir. (Kırmızı ile gösterilen) referans elektrot sadece algılama elektrodu altındaki yerleştirilir.
   Not: donanım detayları için 'Material tablo' bakınız.
6. Proksimal ve distal siyatik sinir uyarımı ve kurşun elektrot arasında önceden tespit edilmiş bir mesafe ile tutarlı fakat ölçüm doğru pozisyonları işaretleyin. Deneysel öneri: algılama elektrottan 4 mm'lik bir mesafede, uzak uyarım gerçekleştirilecektir.Algılama elektroda 16 mm'lik bir mesafede, proksimal stimülasyonu (Şekil 2) yürütülecektir.

Şekil 2.. Hemen önce ölçümlerin başına deneysel durumu gösteren Temsilcisi resim. Beyaz ok algılama (siyah) ve referans (kırmızı), sol arka bacak gastrocnemius kasında elektrot konumunu gösterir. İğne elektrotlar tarafından uyarım siyah algılama elektrodu için tanımlandığı konumlarda gerçekleştirilir. Distal stimülasyon noktası (sol arka bacakta "DS" ile siyah işareti) algılama elektrottan 4 mm'lik bir mesafe vardır; proksimal stimülasyon ("ps" ile siyah marka) yer uzaklıkta 16 mm'dir. Sağ arka bacak üzerinde kırmızı çizgi yakl gösterir siyatik sinirin anatomik ders Imate. Ayrıca, ilgili arka bacak kaslarının kaba pozisyonları işareti olarak gösterilmiştir. Yıldız işareti rektal ısı sondasını göstermektedir.

2. Ölçüm

1. İlke: monopolar atılabilir 28 G iğne elektrotlar 0.1 msn süresince tekrar tekrar üretilen tek kare dalga darbeleri ile sinir uyarılarının bir dizi yapın (tekrarlama hızı 200 ms; bkz. Şekil 3A). Off-line veri analizi için, aynı anda nedeniyle sinir stimülasyonu için nöromüsküler işlev yanıt eğrisinde (Şekil 3B) ile birlikte uyarma sinyalleri elde etmek için tavsiye edilir. Sonraki veri analizi için maksimal yanıtları bir dizi ("temsilci nöromüsküler fonksiyonu yanıtı") ortalama. Güvenilir veri, kayıt ve stimülasyon site ve hayvan başına daha sonra ortalama en az 3 bağımsız, optimum tepki eğrileri üretmek için.
   p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
   Veri toplama ve analizi (şematik sunum) Şekil 3. Prosedür. Tekrar tekrar oluşturulan darbe iğne elektrot (Şekil 3A'da üst sıra) ile siyatik sinir uygulanır. Aynı zamanda, karşılık gelen çok sayıda nöromüsküler yanıt eğrileri (Şekil 3A'da alt satır) kaydedilir. Sinyal yanıtın Gecikme hem de süresi ve sinyalin genliği gösterilir ve can edilir: Ortalama ve büyütülmüş zaman nedeniyle uyarım darbeleri (Şekil 3B'de üst satır) nöromüsküler yanıt eğrileri, aşağıdaki karakteristik özellikleri (Şekil 3B'de alt sıra) göster sonraki hesaplamalar ve istatistik elde edilebilir. Düzensiz sinyal iletim ve / veya idare kayıtları genellikle sadece tek bir pozitif ve bir negatif sapma veya sinyal deformasyon daha fazla olan çeşitli sinyal deformasyonlar sonucuDüşük genlikli (Şekil 3C) ile (Bimodal şekli).
2. Belirlenmiş bir pozisyonda bir iğne elektrot (Şekil 2'de "PS") ile yakın stimülasyon yapın.
   1. Azami amplitüd ile en iyi kayıt koşulları elde etmek için, uyarım işlemine aynı anda fiili tepki eğrileri görselleştirmek. Böyle yaparak, deneyci hemen tepki eğrilerinin şekli hem de genlik boyutunu değerlendirmek edebilmektedir.
   2. Gerekirse, hafif ve dikkatli bir şekilde konumunu ve / veya siyatik sinir ile ilgili olarak uyarım iğne açısını işlemek. Uyarım koşulları bu nazik optimizasyon olası en büyük değeri ve tipik bifazik şekil bir yanıt eğrisi (Şekil 4) ile sürekli genlikleri ulaşılmasını sağlar.
3. Belirlenmiş bir pozisyonda (Şekil 2'de "DS"), bir iğne elektrot ile distal stimülasyon yapın.
4. Completio sonraBu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar n ölçümü, ayrı bir kafese test fare aktarmak. Tam anestezi kurtarıldı kadar sahipsiz diğer hayvanların şirket bir hayvan bırakmayın. Ameliyat sonrası ağrı yönetmek için zamanında artık oyunculuk analjezikler yönetmek. Steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID) ve opioid sistemik uygulama 1-3 gün için tavsiye edilir.
5. Alternatif olarak, boyun çıkığı örneğin hayvan için herhangi bir başka ağrı olmadan hızlı ve insancıl bir şekilde hala anestezi fare kurban.

Şekil 4. Maksimum genlikli CMAP kayıtları belirlemek için İllüstrasyon. Eksiksiz bir kaydı serisi sunulmaktadır. (A ) Araya nokta. Maksimum genlikli CMAP kayıtları (b) hafif stimülasyon iğne hareketi sonuçları. (C) iğne yerleştirme ek değişiklikler yakın maksimum genliklerinin dahil olmak üzere farklı genlikli CMAP kayıtları üretmek. Yakın-maksimum genliklerinin seri CMAP kayıtları ile (d) Uyarım iğne değiştirme. Not: CMAP amplitudes Tipik eksiltme stimülasyon sitesinde ^{12, 13,} mükerrer uyarılma sırasında oluşabilir. Yıldız ortalama için gösterilen azami amplitüd ile CMAP kayıtlarını gösterir.

3. Analizi

1. Uygun bir yazılım paketi (örneğin AtisaPro) kullanarak temsilcisi nöromüsküler fonksiyon tepki veri setine dayalı sinir iletim parametrelerini ayıklayın.
   Not: özel bakım ile zamanla ilişkili verileri kararlılık idare edin çünkü bileşik motor aksiyon pot bükülme noktası tayiniential (CMAP) başlangıçlı ve sonlandırma zor olabilir. Doğrulanmış tekrarlanabildiğini bir prosedür başlangıcından sonra ve sona ermeden önce sinyal deplasmanlar üzerinde teğetlerinin kullanılan Şekil 3B, verilmiştir.
2. 'Sinyal gecikmesini' ve 'CMAP değerlerini hesaplayın.
   1. CMAP süresi 'Gecikme' ilk negatif sapma CAMP başlangıcı arasındaki zaman aralığı baz denir için dönüşünü alınmalarını ise, uyarılması ve CMAP başlangıcı arasındaki zaman gecikmesini temsil '. Uzak ve yakın stimülasyon siteler arasındaki mesafe ile birlikte iletim hızını hesaplamak için uzak ve yakın gecikmeleri arasındaki farkı kullanın.
      stimülasyon siteler arasında iletim hızı = gecikme / mesafe
   2. CMAP '(bileşik motor aksiyon potansiyeli) genlik (mV verilen) CMAP sinyalinin maksimum pozitif ve negatif dönüş noktası arasındaki büyüklüğünü temsil eder.
      CMAP = değer 'olumlu bir dönüş noktası' - değerin 'negatif dönüş point '

Sonuçlar

Her bir cinsiyet 6 hayvan: Bu çalışma için toplam 12 fareden oluşan siyatik sinirler üzerinde in vivo elektrofizyolojik ölçümler bir dizi yapılmıştır. Ölçümler sunulan protokol ile gerçekleştirilmiştir ve aşağıdaki sonuçlar elde edildi:

Hem erkek hem dişi farenin yaklaşık 20 m / sn 'lik bir ortalama siyatik sinir iletim hızı (Şekil 5) gösterir. Bu, literatürde diğer ölçümler ile tutarlıdır. Ayrıca, kadınlar ve erkekle...

Tartışmalar

Açıklanan protokol, ilgi konusu siniri ortaya çıkarmak için gerek kalmadan, anestezi uygulanmış farelerde ilgili siyatik sinir iletim özelliklerini belirlemek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu deneysel prosedür İğne doku hasarına neden olur. Bu nedenle kayıtları bittikten sonra hayvanları kurban etmek makul bir seçenektir. Ancak önceki kayıtları sinirin pozlama gerektiren diğer invaziv işlemler karşılaştırıldığında, doku hasarı ^3,14 nispeten kü?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Concentric Needle Electrodes (Stimulation)	Natus Medical Incorporated San Carlos, CA 94070, USA	9013S0901
Digital Ring Electrodes (Recording)	Natus Medical Incorporated San Carlos, CA 94070, USA	9013S0302
ToM - Tower of Measurement (A/D converter)	GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany
AtisaPro, Data acquisition & analysis software	GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany
HSE-Stimulator T	Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany