Analisi della migrazione delle cellule all'interno di una tridimensionale di collagene Matrix

Riepilogo

Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.

Abstract

La capacità di migrare è un segno distintivo di vari tipi di cellule e svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, e le risposte immunitarie. Tuttavia, la migrazione cellulare è anche un meccanismo chiave nel cancro consentire queste cellule tumorali a staccarsi dal tumore primario per avviare la diffusione metastatica. All'interno di questi ultimi anni sono stati sviluppati vari metodi di migrazione delle cellule per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule. Poiché il comportamento locomotorio di cellule differisce notevolmente tra un bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) ambiente si può presumere che l'analisi della migrazione delle cellule che sono incorporati in un ambiente 3D produrrebbe nella migrazione cellulare più significativo dati. Il vantaggio della matrice di collagene 3D dosaggio migrazione descritto è che le cellule sono incorporate all'interno di una rete fisiologica 3D di fibre di collagene che rappresentano il principale componente della matrice extracellulare. A causa ditime-lapse videomicroscopia migrazione cellulare reale viene misurata permettendo la determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, tra cui linfociti / leucociti, cellule staminali e cellule tumorali. Allo stesso modo, anche i gruppi di cellule o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel reticolo di collagene. Concludiamo che la matrice di collagene 3D test di migrazione è un metodo versatile per analizzare la migrazione delle cellule all'interno di un ambiente 3D fisiologico-like.

Introduzione

Come la fusione cellulare (per una rassegna cfr ^1,2) migrazione delle cellule è un altro fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie (per una rassegna vedi ^3). Tuttavia, la capacità di migrare è anche un prerequisito per le cellule tumorali a metastatizzare (per una rassegna vedi ^3,4).

Migrazione delle cellule è un complesso, non ancora pienamente compreso processo che è diretto dal gioco delle diverse vie di trasduzione del segnale iniziata da diversi ligando (ad esempio, citochine, chemochine, fattori di crescita, ormoni, componenti della matrice extracellulare) del recettore (ad esempio, tirosin-chinasi del recettore, recettori per le chemochine, integrine) interazioni ⁵ in ultima analisi, che causano la riorganizzazione del citoscheletro di actina concomitante con de- e rimontaggio di complessi di adesione focale e integrina-mediata segnalazione ^6.

Per analizzare la migrazione delle cellule diverse in vitro e in vivo test di migrazione delle cellule sono stati sviluppati negli ultimi decenni, tra cui il saggio di Boyden camera / transwell ^7, scratch test / guarigione della ferita test ^8-10, tridimensionale ( 3D) matrice di collagene migrazione dosaggio ^11, nonché l'imaging intravitale / microscopia (per una rassegna vedi ^12). Ciascuno di questi saggi di migrazione cellulare ha pro e contro, ad esempio, in materia di costi e necessità di attrezzature, il trattamento o l'affidabilità dei dati ottenuti.

Sia la camera di Boyden / transwell test e il test graffio / dosaggio guarigione della ferita sono facili, a basso costo e saggi ben sviluppati per misurare la migrazione delle cellule in vitro ^7-10. Nella camera di Boyden / transwell cellule test vengono seminate sulla cima di un inserto contenente pori (circa 8 micron di diametro) - il cosiddetto vano superiore ^7. Opzionale, l'inserto può essere rivestito con m extracellularecomponenti ATRIX, ad esempio, la fibronectina, collagene, ecc, per simulare un ambiente più fisiologico. Allo stesso modo, le cellule endoteliali possono essere coltivate sulla parte superiore dell'inserto, imitando in tal modo una barriera di cellule endoteliali ^13. Quelle cellule che sono passati attraverso i pori durante un intervallo di tempo definito nel vano inferiore ospitare media e integratori, come i fattori di crescita e chemochine, sono usati come-out lettura di quantificare la migrazione cellulare (o stravaso).

Nel saggio graffio / guarigione cellule test ferite vengono seminate in piastre e sono coltivate a confluenza ^10. In dipendenza delle piastre di regolazione sperimentali potrebbe essere pre-rivestito con componenti della matrice extracellulare, quali fibronectina. Dopo aver creato un graffio / ferita raschiando le singole cellule monostrato cellulare da ogni lato del graffio / ferita può migrare nello spazio vuoto, riempimento / guarigione è ¹⁰ quindi. La distanza tra i due lati del graffio / ferite è determinatain dipendenza del tempo ed è utilizzato come un out lettura per l'attività migratoria delle cellule ^10. Tuttavia, per discriminare tra proliferazione cellulare (che potrebbe anche tradursi in riempimento / guarigione del graffio / ferita) e la migrazione cellulare si consiglia di combinare l'analisi con microscopio video time-lapse e di singola cellula di monitoraggio ^10.

Tuttavia, sia la camera di Boyden / transwell test e scratch test / guarigione della ferita test, sono piuttosto imperfetto, concernente un ambiente cellulare fisiologico-like. Nella camera di Boyden / cellule dosaggio transwell devono migrare attraverso un poro di plastica, mentre nel scratch test / guarigione della ferita cellule del test vengono seminate su un piatto di plastica bidimensionale pre-rivestito. Allo stesso modo, è ben noto che il comportamento migratorio differisce marcatamente tra un ambiente bidimensionale e 3D ^3. Per esempio, aderenze tridimensionale a matrice di fibroblasti differiscono da adesioni focali e fibrillari caratterizzati su duesubstrati -dimensionale nel loro contenuto di α5β1 e integrine αvβ3, paxillina, altri componenti del citoscheletro, e la fosforilazione della tirosina chinasi di adesione focale ^14. Allo stesso modo, le cellule incorporati all'interno di un ambiente 3D visualizzate anche un comportamento migratorio alterato ^15. Così per analizzare la migrazione cellulare più accuratamente un saggio di migrazione è raccomandato consentendo di misurare la migrazione di cellule singole all'interno di un ambiente fisiologico o fisiologico simile 3D.

Imaging intravitale / microscopia è il gold-standard per misurare la migrazione delle cellule all'interno di un contesto fisiologico 3D. Questo non appartiene solo alle interazioni matrice extracellulare delle cellule, ma anche per le interazioni tra diversi tipi di cellule, come le cellule tumorali e le cellule endoteliali durante stravaso ¹⁶ o il traffico dei linfociti nel linfonodo ^17, che, ad oggi, è possibile grazie al miglioramento delle tecniche di microscopia a fluorescenza, come 2-fotonemicroscopio confocale a scansione laser, l'uso di coloranti fluorescenti vitali e ceppi di topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti derivati ^{​​12,16,17.} Inoltre, l'imaging intravitale / microscopia può essere combinato con il monitoraggio delle cellule manuale e automatica ^18. Tuttavia, a causa della necessità di un 2-fotone microscopio confocale a scansione laser e animali (e appropriati modelli animali transgenici) intravitale immagini / microscopia è una tecnica piuttosto intenso costi.

Per superare le limitazioni della camera di Boyden / transwell test e il test di guarigione scratch test / ferita e per analizzare la migrazione di diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D 3D matrice di collagene test di migrazione è stato sviluppato ^11,19. In tal modo, le cellule che migrano sono incorporate all'interno di una rete in fibra di collagene 3D, che più somiglia alla situazione in vivo. Congiuntamente, a causa di time-lapse microscopia video di migrazione delle cellule reale si misura permettendo determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, compresi i linfociti e leucociti ^11,20, staminali emopoietiche / progenitrici ^21-24, e le cellule tumorali ^5,25-29. Oltre alle cellule singole anche cellulare cluster o sferoidi possono essere incorporati all'interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel collagene reticolo ^30,31.

Questo protocollo presenta una panoramica su una tecnica semplice, ma potente per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule all'interno di un ambiente 3D - un metodo in vitro ottenendo dei risultati che sono vicine alla situazione in vivo.

Protocollo

1 Preparazione della migrazione Chambers

1. Preparare una gelatina di cera di paraffina / petrolio (1: 1) mix e calore finché il composto si sarà sciolto. Utilizzando un pennello e disegnare 2-3 strati della gelatina paraffina / petrolio (1: 1) mescolare a metà del vetrino in base alle figure 1B-1D.
   NOTA: Stiamo usando vetrini comuni (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H))
2. Applicare la cera di paraffina / petrolio mix gelatina sciolta rapidamente sul vetrino per evitare la solidificazione durante il disegno. Assicurarsi che lo strato di gelatina di cera di paraffina / petrolio è di circa 2-2,5 cm di lunghezza e 0,3-0,5 cm di larghezza. Lo spessore dello strato di gelatina paraffina / petrolio dovrebbe essere di circa 0,1-0,15 cm.
3. Aggiungere un coprioggetto alla cera di paraffina solidificata / petrolio mix gelatina e sigillare con 2-3 strati di paraffina mix gelatina di cera / di petrolio (Figure 1E, 1F). Utilizzare 4-8 camere di migrazione per un esperimento di migrazione cellulare comune. Camere Luogo di migrazione in per una posizione eretta in un rack.

2 Preparazione del collagene Sospensione Mix cellulare

1. Harvest (ad esempio, con il 0,25% tripsina / EDTA) e contare le cellule di interesse. Risospendere le cellule in mezzi completi contenenti siero fetale bovino (FCS), antibiotici e integratori consigliato. Preparare 4-8 1.5 ml provette di reazione e 20 microlitri di sospensione cellulare contenente 4-6 x 10 ⁴ cellule (il numero totale di cellule dipende dal tipo di cellula da analizzare) e riempire fino a 50 microlitri con completo supporto.
   NOTA: i composti supplementari (ad esempio, fattori di crescita, chemochine, inibitori, ecc) vengono aggiunti alla sospensione cellulare. Usare appropriate soluzioni madri tale che il volume finale della sospensione cellulare non supera i 50 ml.
2. Preparare un importo totale di 452 microlitri di sospensione collagene finale per quattro esperimenti di migrazione delle cellule. Aggiungere 50 microlitri 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio (pH 9,0-9,5) Per un tubo di reazione da 1,5 ml e mescolare accuratamente. Osservare il colore turno soluzione dal giallo-arancio al porpora intenso (pH 9,0-9,5). Aggiungi sospensione collagene 375 microlitri di liquido al / soluzione di bicarbonato di sodio 10x MEM e mescolare accuratamente. Il pH della sospensione collagene finale dovrebbe essere di circa 7,5 (indicato da una luce di colore viola).
   NOTA: Controllare il pH della soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%. Se il pH è circa 7,5 posto la soluzione di bicarbonato di sodio con un coperchio aperto in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ di essere saturo di CO ₂ e aumentare il pH (circa 9,0-9,5). Il pH della miscela di collagene sospensione cellulare è fondamentale per la stabilità della rete di collagene. Se è troppo bassa del reticolo di collagene crollerà durante l'esperimento migrazione cellulare.
   NOTA: Per questo protocollo, utilizzare il collagene liquido (pH 1,9-2,2) dal posteriore bovina (2,9-3,3 mg / ml di collagene; il 95% collagene di tipo I, 5% collagene di tipo IV). Esempi di ulteriore collagene protocolli di preparazione reticolo utilizzandocollagene di tipo I da altre fonti, come ad esempio suini o di ratto, sono indicati in ^32,33. Non modificare i volumi delle soluzioni utilizzate in quanto ciò altera la concentrazione di collagene finale di 1,67 mg / ml del reticolo. Una concentrazione di collagene superiore o inferiore ha un impatto sulla densità delle fibre di collagene e la distanza media tra di loro in concomitanza con le cellule comportamento migratorio ^34.
3. Aggiungere 100 ml di sospensione finale di collagene per sospensione cellulare 50 microlitri e mescolare thoroughly.The sospensione collagene finale (1,67 mg / ml di collagene) è leggermente viscoso. Per trasferire l'importo corretto (100 ml), pipetta la soluzione di collagene finale una volta su e giù prima di trasferirlo alla sospensione cellulare.
   NOTA: Una volta che la miscela di cellule di sospensione collagene è combinato con la soluzione di bicarbonato / sodio 10x MEM e il valore del pH è cambiato a 7,5 le fibre di collagene cominciano immediatamente a polimerizzare.
4. Trasferire la miscela di cellule di sospensione di collagene finale da thprovette di reazione di e alle camere di migrazione. Battere delicatamente la camera di migrazione per distribuire equamente il mix di cellule di sospensione di collagene sul fondo della camera di migrazione (Figura 1H). Collocare le camere migrazione in posizione verticale in un rack e incubare per circa 30 min (37 ° C, 5% CO ₂₎ per consentire la polimerizzazione delle fibre di collagene.
5. Si noti che il collagene reticolo polimerizzato è leggermente torbida, ma ancora in fase di luce di colore viola. Riempire le camere di migrazione con terreno completo o mezzo completo con supplementi di interesse e sigillare la camera di migrazione con gelatina di cera di paraffina / miscela di petrolio (Figure 1I, 1J).

3 Registrazione e analisi della migrazione delle cellule

Questa sezione descrive la registrazione di migrazione delle cellule mediante microscopia time-lapse video e l'analisi della migrazione delle cellule dal monitoraggio delle cellule manuale.

1. Accendere il microscopio e la hea palco microscopioter. Regolare la temperatura a 37 ° C. Utilizzare un obiettivo 10X. Mettere camera di migrazione sotto un microscopio e mettere a fuoco circa 50 cellule o più nel campo visivo.
2. Migrazione cellulare Record in modalità time-lapse utilizzando un'applicazione software di video sorveglianza multi-camera. Salvare i filmati di migrazione cellulare in un formato appropriato, ad esempio, "* avi" o "* mov". Collegare i file video di migrazione delle cellule di un database contenente informazioni di supporto, come il tipo di cellula e condizioni sperimentali.
   NOTA: Stiamo registrando linfociti e HSPCs per un massimo di 2 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1:80, il che significa che 0,75 sec in time-lapse è pari a 1 min in tempo reale. Le cellule tumorali sono cellule in movimento lento e sono quindi registrate per almeno 16 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1: 1.800 (0,5 sec in time-lapse è pari a 15 minuti in tempo reale).
3. Analizzare i film migrazione cellulare utilizzando un'applicazione software di monitoraggio cella appropriata, come i plugin software ImageJ(Una visione d'insieme è dato in ^18). Per un'analisi imparziale è di cruciale importanza che le cellule saranno selezionati a caso senza la conoscenza se le cellule sono migratrici attivo o meno.
   NOTA: Stiamo usando un software di auto-sviluppato per tenere traccia manualmente i percorsi di almeno 30 cellule per sperimentare seguendo le cellule si muovono con precisione con il cursore del mouse (che è posizionato al nucleo). Durante il monitoraggio, xy coordinate delle celle cingolati sono determinati automaticamente in base alla modalità time-lapse utilizzato. Per linfociti / HSPCs xy coordinate sono determinate ogni 0,75 secondi (pari a 1 minuto in tempo reale), mentre per le cellule tumorali xy coordinate sono determinate ogni 0,5 secondi (pari a 15 minuti in tempo reale).
4. Determinare un totale di 60 xy coordinate per cella per un tipico esperimento migrazione cellulare. Questo è uguale a 1 ora in tempo reale per i linfociti / HSPCs e 15 ore in tempo reale per le cellule tumorali. A "," indica che una cella non è spostato tra two punti di tempo, mentre un "valore numerico" indica la distanza in "pixel" una cellula è spostato tra 2 punti temporali (Figura 2A).
   NOTA: il monitoraggio delle cellule manuale richiede esperienza. In particolare, le cellule migrano veloce sono difficili da rintracciare e ogni tipo di cellula mostrano un comportamento migratorio netto che potrebbe essere innescato da fattori integrati. In caso di divisione cellulare, mentre il monitoraggio, scegliere a caso una cellula figlia per continuare il monitoraggio. Le cellule che migrano fuori del campo di vista o muoiono durante il monitoraggio non sono trascurati, ma sono considerati per l'analisi.

Analisi 4. Dati

1. Analizzare i dati di tracciamento cellulare utilizzando un'applicazione software appropriato, ad esempio, un foglio di calcolo.
   1. Analizzare i dati di monitoraggio delle cellule copiando la cella di rilevamento dati grezzi (Figura 2A), in un modello di foglio di calcolo auto-progettato. Moltiplicare somma dei "valori numerici", che rappresentala distanza totale di una cella ha migrato con un fattore di correzione per convertire i "pixel" in "micron".
   2. Determinare due parametri di migrazione cellulare: l'attività motoria (che equivale al tasso di migrazione) e il tempo di movimento attivo (Figure 2C, 2D).
   3. Identificare le cellule che sono migrate minore di 25 micron (livello di soglia per ridurre il numero di cellule falsi positivi) come cellule non-movimento. Sostituire "valori numerici" di queste cellule con ",".
      NOTA: Il parametro "attività motoria" (o tasso di migrazione) rappresenta la percentuale di cellule della popolazione di cellule cingolato che si sono trasferiti tra due punti di tempo (Figura 2D). Un "valore numerico" è definito come una cellula in movimento, mentre "," è definito come una cella non in movimento. Il parametro "tempo di movimento attivo" (attiva) rappresenta la percentuale del tempo totale di una cella è migrato nel rimento per il periodo di tempo del periodo di osservazione (Figura 2C). Un "valore numerico" indica che una cellula è spostato, mentre "," indica che una cella non è mossa. Questo parametro viene inoltre utilizzato per determinare il numero di cellule che non si è mosso.
2. Calcolare la significatività statistica e dei dati di migrazione delle cellule di visualizzazione.
   1. Calcola significatività statistica dell'attività locomotoria medio della cellule (tasso di migrazione) utilizzando il test di Mann-Whitney. Consideriamo p-value <0.05 come significativo.
   2. Visualizzare l'attività locomotoria medio di cellule come xy-diagramma, schema BoxPlot, o come un diagramma grafico a barre. Visualizzare i dati basati su celle singole, come il tempo di movimento attivo o la velocità, come un diagramma grafico a barre o un istogramma.
      NOTA: Se l'applicazione software foglio di calcolo scelto non contiene una tabella o un grafico istogramma strumento BoxPlot una ricerca online deve essere effettuata per la ricerca di idonei tutorials.

Risultati

Il 3D-collagene test di migrazione matrice utilizzata in combinazione con time-lapse video-microscopia e di monitoraggio delle cellule assistita da computer consente la determinazione di vari parametri di migrazione delle cellule, compreso sia il parametro basato sulla popolazione (ad esempio, l'attività locomotoria media) e parametri basati su celle singole (ad esempio, il tempo di movimento attivo, velocità, distanza migrato). Un esempio di set di dati di monitoraggio delle cellule ottenuti, l&...

Discussione

La capacità di migrare è una caratteristica delle cellule tumorali ^4. Senza la possibilità di staccarsi dal tumore primario e migrare attraverso le circostanti cellule tumorali tessuto connettivo non sarà in grado di seminare lesioni secondarie, che sono la principale causa di morte di quasi tutti i pazienti affetti da cancro. A causa di questa relazione molti studi si stanno concentrando sulla migrazione delle cellule del cancro. Lo scopo di questi studi è l'identificazione di nuove molecole target ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use