고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증

요약

이 연구로, 우리는 미래의 임상 치료 테스트를위한 격리 superfused 소 망막을위한 표준화 된 스트레스 모델을 소개합니다. A- 및 B- 파의 진폭에 의해 표현 망막 함수에 어느 저산소증 (순수한 N ₂₎ 응력 또는 글루타메이트 (250 μM 글루타메이트)의 효과를 평가 하였다.

초록

신경은 지난 수십 년 동안 안과 연구 조사의 강한 필드 왔으며 녹내장, 망막 혈관 폐쇄, 망막 박리, 당뇨 망막 병증과 같은 질병에 영향을하고있다. 그것은 미래의 임상 치료 테스트를 위해 표준화 된 스트레스 모델을 소개하는이 연구의 목적이었다.

소 망막을 제조하여, 산소 포화 된 표준 용액으로 관류하고, ERG를 기록하고 있었다. 안정된 B-파도, 저산소증 (순수한 N ₂₎ 또는 글루타민산 염 스트레스 (250 μm의 글루타메이트)을 기록 후 45 분 동안 발휘했다. 단독 감광체 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 mM의 아스파라긴산은 파를 수득 하였다. ERG 복구 75 분 동안 모니터 하였다.

저산소증 들어, 87.0 %의 파 진폭의 감소는 45 분 (p = 휴약 0.03 종료 후 36.5 %의 감소)의 폭발 시간 후에 (p <0.01)를 기록 하였다. 또한, 초기 DECR통계적 유의성에 도달하는, 87.23 %를 기록 하였다 B 파의 진폭에 완화 (페이지 <0.01, 세척의 끝, P = 0.03에서 25.5 %의 감소).

250 μm의 글루탐산, 1.9 % (p> 0.05) 감소 하였다 파 진폭 (p> 0.05) 초기 7.8 % 감축. B 파의 진폭 (P <0.01) 관찰되었다의 83.7 %의 감소; 75 분의 세척 후에 감소는 2.3 % (p = 0.62)이었다. 본 연구에서 표준화 된 응력 모델은 장래에 가능한 신경 보호 효과를 확인하는 데에 유용 할 수도있을 것으로 제시된다.

서문

신경은 지난 수십 년 동안 안과 연구 조사의 강력한 필드있다. 망막은 산소에 크게 의존와 그 주변 세포의 신진 대사에 의해 강하게 영향을 매우 민감한 신경 세포의 네트워크입니다. 신경 세포 손상과 관련된 주요 안구 병변은 망막 혈관 폐색, 녹내장, 망막 박리 있습니다.

망막 동맥 폐색증, 망막 혈관 폐쇄에 대한 예로서, 내측으로 인해 망막 저산소증 ^(1)의 시야에의 갑작스런 손실을 이끈다. 그것은 종종 시력이 크게 ^일을 복구하는 환자의 8 %만이으로, 지속적인 시력 저하 ^한 일반적인 혈관 병변 ² 리드와 연결되어 있습니다. 동맥이 혈전 용해 치료 방법으로 제시되었지만, 이점은 무작위 임상 시험 ^3에 도시되지 않을 수있다.

녹내장 및 망막 박리모두 ^4-6 글루타메이트 농도의 증가가있다. 생리적 조건 하에서 글루타메이트는 중추 신경계 전체에 걸쳐 흥분성 송신기 및 내측 망막 ^7,8로서 발생된다. 상승 된 수준은 글루타메이트 아니라 망막 박리, 녹내장 및 ^5,6- 에서뿐만 아니라 증식 당뇨 망막 병증 ^9에서 발견되었다. 글루타메이트의 증가는 아마도, 따라서, 신경 세포의 ^{흥분성을 열} 손상에 이르게하고. 망막 박리와 망막 (유리체 절제술)에 증식 당뇨 망막 병증 수술의 경우에 대부분의 경우에 필요하다. 유리체 절제술 기계 조작 동안, 광섬유 또는 긴 작업 중에 관개 솔루션의 높은 유속에 의해 가해지는 전단 응력의 ​​밝은 빛이 망막 ^{(11, 12)에} 추가로 스트레스를 발휘.

모든 언급 한 질병 병리 레틴로 지역화되어 공통점혼자는 감각 신경 시스템으로 망막을 보호 할 수있는 방법을 찾기 위해 도전 안과 커뮤니티 포즈.

전위도 (ERG)은 생체 기능 감광체 (표면파) 및 내측 망막 (B 파장)의 함수의 평가를위한 표준 방법이다. ERG는 각막 도입은 전극에 의해 측정되고, 눈은 막대 또는 원뿔 또는 내측 망막 내의 결함을 검출하는 광의 레벨 증가에 의해 자극되고있다. 망막에 다른 결함은 진폭 (응답의 강도) 또는 ERG의 대기 시간 (타임 투 응답 간격)의 변화에​​ 의해 검출 될 수있다. 다른 ERG 프로토콜 및 측정 방법 (패턴 ERG는, 다 초점 망막 전위 또는 시야 ERG)는 결함의 더 차별화 할 수 있습니다. 망막의 격리 기술은 가능한 연구 동물의 예에서 간섭없이 망막에 대한 영향을 평가하기 위해, 최근에 도입 한일반적인 반응 ^{13, 14.}

평가 및 superfused 고립 된 망막에 저산소증과 글루타민산 염 스트레스에 대한 정의 및 표준화 된 스트레스 모델을 소개하는이 연구의 목적이었다. 따라서, 우리는 특정 에이전트 또는 인공 관개 솔루션의 신경 보호 효과에 대한 미래 연구를위한 기초를 마련하기를 바라고있다.

프로토콜

소 눈의 1. 준비

1. 동물이 도살 후 바로 소 눈을 얻습니다.
2. "Sickel-솔루션"의 보호 눈을 운반 120 mM의 NaCl을, 2 mM의 KCl을, 0.1 mM의의 MgCl _2, 0.15 mM의 염화칼슘 _2, 1.5 mM의의 NaH ₂ PO _4, 13.5 mM의 나 ₂ HPO _4, 5 mM의 포도당에 포함 된 특수 매체 RT.
3. 희미한 붉은 빛 어두운 적응 상태에서 망막의 준비를 수행합니다.
4. 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 적도 절개 약을 수행 윤부에 4mm 후방. 그 후 한 조각 각막, 홍채, 모양체와 렌즈를 제거합니다. Sickel-솔루션의 망막을 유지합니다.
5. 기계적으로 망막 표면에 유리질 첨부 파일을 풀고 열린 눈 컵에서 유리체를 제거합니다.
6. 그 후 네 개의 사분면으로 눈을 분할하고 약의 영역 라운드 펀치 아웃 트레 반을 이용하여 직경 7mm.
7. 조심스럽게 망막 분리색소 상피 세포에서와 빛으로부터 보호 상자 안에 기록 장치에 놓습니다. 기록 장치는 중간에 메쉬 플라스틱 테이너 이루어져; 메시에 망막을 배치하고 전극에 직접 플라스틱 링으로 고정 후.
   주 : 플라스틱 테이너는 매체의 일정한 흐름을 허용하는 두 개의 채널을 보유하고 있습니다.

2. 녹음 전위도 (ERG)

1. 상기 전위도를 기록 망막의 양쪽에 두 실버 / 실버 클로라이드를 사용하여 전극과 CA의 일정한 속도로 관류 망막 관류하기 위해서 1 ml / 분, 37 ° C의 항온. 산소로 포화 "Sickel-솔루션"를 사용합니다.
2. 측정을 시작하기 전에, 어두운 망막 (모든 측정시 빛으로부터 보호) 적응과 다섯 분의 자극 간격을 사용합니다. 망막 표면에서 6.3 MLX로 설정 강도로 자극에 대한 1 Hz에서 단일 흰색 제논 플래시를 사용합니다.
3. 사용 감광 필터와 최적의 응답을 갖기 위해, 타이머에 의해 제어되는 마이크로 초 (10)의 광 자극을 교정.
4. 측정 데이터를 처리, ERG를 필터링하고 잔디 RPS312RM 증폭기를 사용하여 (100 Hz에서 고역 통과 필터, 50 Hz에서 노치 필터, 증폭 X 100,000)를 증폭하도록. 신호를 방해 할 수있다 가능 교란 주파수를 필터링보십시오. 데이터를 처리하기 위해서는, 데스크탑 컴퓨터 (PC 호환)에 아날로그 - 디지털 데이터 수집 보드를 사용한다.
5. 안정적인 B 파 진폭이 기록 될 때까지 일정한 관류하에 어두운 적응 기간 후, 전기 신호의 진폭을 측정한다.
   주 : 다섯 번의 측정이 평균값에 도달하고 10 % 미만을 벗어나는 경우, 진폭은 안정된 것으로 간주된다. 단일 측정의 좋은 예는 그림 1에 제시되어있다.
6. 테스트를 시작하려면, 하나 순수한 질소로 순수한 산소를 대체 (단일 실험의 수, N = 5) 저산소증을 테스트250 μm의 글루타메이트 (N = 5).
7. 전기 응답 45 분 동안 5 분마다 기록합니다.
8. 시험 기간 후, 75 분 동안 산소로 포화 표준 매체와 망막을 관류하고 B 파의 진폭의 변화를 봐주세요. 이는 세척 단계이다. B 파의 피크에 파의 저점에서 B 파의 진폭을 측정합니다.
9. 암순응 조건 감광체 전위에 글루타메이트 또는 저산소증의 효과를 조사하기 위해, 양액이 1mm에 추가하여 B 파를 억제.
10. 30 분 동안 안정적인 감광체 전위를 기록한 후, 1 mM의 아스파라긴산과 상이한 관개 솔루션 망막 45 분 노출, 이전의 절차를 수행한다. 앞서 언급 한 것과 같은 세척 기간 (단계 2.8)를 사용합니다.

3. 데이터 분석

1. 통계적 데이터를 평가하기 위해, 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 등을 사용하는 모든 데이터에 대한 정규 분포 보장테스트 ^(15).
2. 폭발 전에 마지막 측정에 비해 노광 단계 이후 백분율에서 A- 및 B- 파 진폭의 감소를 계산한다. 45 분 후, ERG - 진폭의 감소를 비교 - ERG 칠하기 전에 측정 - 박람회 기간 말.
3. 회복 가능성을 조사하기 전에 해당 박람회 진폭 세척 단계의 끝에 A- 및 B- 파 비교.
4. 통계 분석은 소프트웨어 또는 JMP 통계 소프트웨어 SPSS 소프트웨어를 사용한다. 표준 편차 평균 ± 등 전반에 걸쳐 데이터를 계산합니다. 해당 통계 테스트에 의해 의미를 추정.
   참고 :이 테스트는 실험 범위에 따라 다를 수 있습니다. 이 설정에서 학생의 쌍 t-test를 사용합니다.

결과

산소 포화 표준 용액 (도 1A 및 B)와 망막 관류 제제의 1 시간 후 ERG-진폭 안정화 및 단일 진폭 측정 사이의 편차를 적게 보였다. 의 pH, 삼투압, 온도, (저산소증 테스트 제외) PO _2는 모든 시험 일정하게 유지되었다.

망막의 내부 신호로부터 감광체 신호를 분리하려면, 1mM의 아스파라긴산은 B 파장 (도 1a)을 억제 표준 용액에 첨가 하였다. 저산소증의 효과?...

토론

본 연구에서는, 45 분의 저산소증 후에 B 파 진폭에 큰 영향이 발견되었다. 이러한 감소는 여전히 세척 단계 후 유의 하였다. 광 수용체 잠재력에 비슷한 효과가 관찰 될 수있다.

결과는 다른 게시 된 데이터 ⁽¹⁶⁾ 우리에게 저산소증 후 가능한 신경 보호 효과를 연구 할 수있는 기회를 제공하여 지원됩니다.

250 μM 글루타메이트의 45 분의 박람회 후, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000