Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

Резюме

Здесь мы приводим протокол для употребления инъекционных ультразвуковые микропузырьков контрастных агентов в живую, изолированных поздно созревания эмбрионов на стадии мышиных. Этот метод позволяет изучать параметров перфузии и сосудистых молекулярных маркеров в пределах эмбриона с использованием высокочастотного изображений контрастным усилением УЗИ.

Аннотация

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or α_vβ₃) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Введение

Контрастное ультразвуковое исследование использует микропузырьков контрастных агентов для визуализации и характеризуют сосудистой оболочке. Эти агенты позволяют неинвазивного оценку микроциркуляции, кровеносных сосудов и сердечно-сосудистой системы. Кроме того, модификация поверхности пузырька может привести к целевой микропузырьков связывания с эндотелиальными биомаркеров, как показано в доклинических приложений ангиогенеза, атеросклероза и воспаления ^1,2 делая молекулярную ультразвуковой визуализации сосудистых событий возможных. Поэтому Контраст усиливается ультразвук может быть использован для идентификации сложные и разнообразные среды, влияющие на здоровых и больных сосудистые состояния ^3-5.

В последние несколько лет интерес к полезности изображений микропузырьков расширилась до универсала модели мышиного эмбриона. В качестве модели развития млекопитающих, введение микропузырьков в эмбриональном сосудистой повышает физиологическиеИсследование развивающихся сердечно-сосудистой системы (например, потока крови, сердечный выброс) и в тех случаях, трансгенных и целевых мутантных мышах болезни сердца ^6,7, может дать представление о том, как генетические факторы изменения сердечно-сосудистой системы. В самом деле, количественный и качественный 2D анализ эмбрионального сосудистой мозговой уже достигнуты ^8. Кроме того, эмбрион мыши представляет как прекрасным примером для изучения связывания целевых микропузырьков сосудистых маркеров в естественных условиях. Bartelle и др. ^9, например, ввели авидин микропузырьков в зачаточном желудочков сердца с целью оценки целенаправленное связывание в Biotag-Бира трансгенных эмбрионов и изучить сосудистую анатомию. Поколение гетерозиготных и гомозиготных мышиных моделях может быть также использован в качестве суррогата модели опухоли исследований, направленных на определение количественного природы молекулярного УЗИ - важный ориентир в переводе эту технику в клинику.

Микропузырьки наиболее часто вводят в эмбриональном обращении через внутри-сердечной вливаний в отдельных эмбрионов, которые открыты в лапаротомии ^8-10. В утробе матери инъекций, однако, сталкиваются с целым рядом проблем. Они включают в себя инъекции руководство, необходимость борьбы с движением у матери и экстериоризированного эмбриона, поддержание гемодинамики жизнеспособности у матери и выводили эмбрионов, обращаясь долгосрочные последствия анестезии и осложнения, связанные с кровотечением ^11. Таким образом, цель исследования состояла в разработке методики для введения микропузырьков в изолированных жилых поздней стадии эмбрионов ^12. Эта опция предлагает больше свободы в плане управления впрыском и позиционирования, воспроизводимости плоскости изображения, без препятствий, и упрощенного анализа изображений и количественной оценки.

В настоящем исследовании мы опишем новый порядок введения микропузырьков в живых эмбрионов мышей FOR целях изучения микропузырьков кинетическое поведение и изучения целевой микропузырьков связывания эндогенных эндотелиальных поверхностных маркеров. Нелинейная конкретных изображений контраст УЗИ используется для измерения ряда основных параметров перфузии в том числе пик повышения (PE), промыть в скорости и времени до пика (ТТП) в изолированных зародышей E17.5. Мы также продемонстрировать справедливость модели эмбриона для оценки количественной природы молекулярной ультразвука в эмбриональной потере эндоглин функции трансгенных мышах, где эндоглин является клинически значимым целевой благодаря своей высокой экспрессии в эндотелиальных клетках сосудов в местах активного ангиогенеза ¹³ , Адгезия эндоглина ориентированные (MB _E), крысы изотипического IgG ₂ управления (MB _C) и нецелевые (MB _U) микропузырьков оценивали в гетерозиготном эндоглина (Eng ^+/-) и гомозиготной эндоглина (Eng ^{+ / +),} выражающая эмбрионов. Анализ целевого биндинг показывает, что молекулярная УЗИ способны дифференцироваться между эндоглина генотипов и относящихся плотности рецепторов к количественному уровнях молекулярных ультразвука.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментальные методики, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в Sunnybrook научно-исследовательского института (Торонто, Онтарио, Канада) на. Процедуры для гуманного обращения с животными должны соблюдаться во все времена. Предполагается, что следователь обучение по основам эксплуатации ультразвуковой системы визуализации. Этот протокол работает лучше всего с двумя людьми.

1. Животные модели

1. Mate CD-1 самец и самка Mus Musculus получить диких эмбрионов типа для перфузионных исследований.
2. Для молекулярных методов визуализации, создавать мышей ENG +/- путем гомологичной рекомбинации с использованием эмбриональных стволовых клеток 129 / Ola происхождения, как описано Бурдо и др. ^14.
   1. Мышей обратное скрещивание B6- ENG ^+/-, любезно приобрел у доктора Мишель Letarte, в CD-1 фоновом режиме. Использовать Eng ^+/- компакт-1 обратному скрещиванию эмбрионов, а также их Eng ^{+ / +} однопометница соntrols. Mate мышей, чтобы произвести постановочные эмбрионов.

2. Экспериментальная Подготовка

1. Инициировать спаривания мышей и проверить пробки ежедневно. Эмбриональные день 0,5 определяется как полдень дня наблюдается влагалища плагин.
2. Подготовка эмбриона носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл 1 М HEPES и 5 мл пенициллина-стрептомицина (10000 единиц пенициллина, 10000 мкг стрептомицина) до 500 мл модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг / л). Оберните бутылку в фольге и держать охлажденным при температуре 4 ° С.
3. Центрифуга ясно, ультразвуковой гель в 50 мл конические пробирки при 140 х г в течение 20 мин. Нарисуйте гель вверх в 30 мл шприцев. Заполните дополнительные (отмечены) 30 мл шприцы с фосфатным буферным раствором (PBS) и отложите в сторону. Один помет эмбрионов, как правило, требуют от 2-3 шприцев ультразвуковой гель и 4 шприцы PBS.
4. Потяните около 30 стеклянных иглы и аккуратно крепятся к полосе пластилинав 100 х 20 мм клеток культуральной чашке. Это гарантирует, что иглы разделены и безопасно во время обработки. Используя стеклянную съемника использовать следующие параметры на 1 х 90 мм стеклянных капилляров с нитью: автономный отопитель 77, Sub магнита 55, главным магнитом 70.
5. Подготовка 11:50 рассечение пластины (достаточно, чтобы обеспечить каждого эмбриона в помете получает свой блюдо), используя соотношение 1: 8 громкости отвердителя на базу. Налейте 40 мл базы в 50 мл коническую трубку. Добавить 5-6 мл отвердителя и перемешать деревянной палкой.
   1. Налейте в 60 х 15 мм культуры блюд, заполняя каждый приблизительно на половину. Позвольте стенду O / N, чтобы установить.
6. Прикрепите женские Luers до 400 мм длинные куски из поливинилхлорида (ПВХ) труб (внутренний диаметр: 0,79 мм). Трубки должны добраться из шприца на сцену ультразвуковой комфортно.

3. Экспериментальная установка

1. Упорядочить изображений платформу под операционным микроскопом с 3D двигателем и линейкой 21 MHг датчик.
   1. Orient платформа, так что рейку находится слева, со стадией, расположенного непосредственно под микроскопом.
   2. Установите 3D двигатель с шаровым шарниром части, проходящей рычага платформы. Винт быстрого выпуска должность зажима датчика в быстрое освобождение смонтировать на двигателе, лицом вперед, и положение датчика голову в хомут, закрыв защелку.
   3. Закрепите разъем датчика в активном порту на передней панели корзине. Включите машину.
2. Инициировать ультразвуковой датчик 21 МГц, выбрав установку "кардиология" для молекулярных методов визуализации и «Общие положения» перфузионных исследований. Установить все время усиления компенсации ползунки для точной средней позиции. Для "Контраст Режим" установите следующие параметры: Частота: 18 МГц, мощность передачи: 4%, (0,39 МПа), Контраст усиления: 30 дБ, очаги: 6 & 10 мм, Контраст Режим: нелинейная, взрыв время: 100% в 0,1сек, ширина ширина: Широкий.
3. Алиготе 40 мл эмбрион СМИ каждый на четыре 50 мл конические пробирки. Поместите на льду.
4. Тепло 1 л воды в 2 л химический стакан на плитке. Поддержание при 45 ° С. Добавить один шприц ультразвукового геля и PBS в стакан для предварительного нагрева. Поддерживать эту температуру путем мониторинга с термометром во все времена.
5. Отложите 11:50 1 мл шприцев и 11:50 21 G иглы для инъекции микропузырьков.

4. Хирургические процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть помощник подготовить пузыри (стадия 5), а хирург приступает к хирургической процедуры. Протокол, описанный здесь, была заимствована из Уайтли и др. ¹⁵

1. Сбор E16.5 или E17.5 эмбрионов от беременной женской мыши следующие смещения шейных позвонков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: эффекты анестезии на эмбрионах до сих пор не изучены в деталях ^16. Дополнительные методы, в том числе декапитации, может быть целесообразным опния в жертву беременных мышей.
   1. Разрежьте брюшко, чтобы выявить матку & эмбрионов. Аккуратно и быстро удалить матку, сокращая на кончиках рогов матки (отделяя яичников и маточных сосудов) и разрыва в влагалище и мочевого пузыря.
   2. Использование Пинцет, трансфер матку трубки 40 мл ледяной эмбриона СМИ как можно быстрее без ущерба для эмбрионов. Откажитесь от туши мыши.
2. Переезд с микроскопом и на сцене. Депозит матку в 100 х 20 мм для культивирования клеток блюдо. Передача матки в новую тарелки, заполненной 50 мл свежего эмбрионального сред.
3. Использование стерилизованной (70% этанола спрей) тонких щипцов, осторожно оторвать и оторваться наружные мембраны матки, начиная с одного конца. Expose плацентарный децидуальной, теменной желточного мешка и мембрану REICHERT к отделять и удалять из основного висцерального желточного мешка.
4. Рассеките из эмбрионов один за другим, сохраняя висцерального уOlk мешки неповрежденные и обработки плаценты как можно осторожнее ^17. Будьте осторожны, чтобы избежать разрыва желточного мешка, как эмбрионы выскочить немедленно.
   1. Используйте перфорированный ложку, чтобы переместить эмбрионов другое блюдо держали на льду со свежими СМИ эмбриона. Держите эмбрионов в охлажденном, пока не понадобится. Изменить носитель в зачаточном блюдо каждый 1-1,5 ч. С этих условиях эмбрионы являются жизнеспособными на срок до 4 ч после вскрытия.

5. Микросепаратор Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните молекулярная визуализация при помощи ультразвука с использованием как целевые и нецелевые микропузырьков. Один эксперимент может потребоваться до 3 отдельных ампулах микропузырьков: я) антител направлены микропузырьки, II) контроль изотипа целевых микропузырьков и III) нецелевые микропузырьков. Контрастное вещество приходит в виде сухого порошка, замораживания и должна быть восстановлена ​​с физиологическим раствором перед инъекцией. Есть ~ 2 х 10 ⁹ микропузырьки в каждом нецелевого MicroBubble флакон и ~ 8,8 х 10 ⁸ микропузырьки в целевых готовых ампул. Микропузырьки стабильны в течение до 3 ч после приготовления.

1. Восстановление Целевые Готово флаконов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры целевых готовых препаратов: эндоглина целевые микропузырьки (MB _E, биотинилированными крыс MJ 7/18 антитела к мыши эндоглина; в доме гибридом объекта); сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора 2 (VEGFR2) целевые микропузырьки (МБ _В, с биотином мышиного анти-CD309); крыса изотипу IgG ₂ контрольное антитело целевые микропузырьки (MB _C, биотин крыса изотипу IgG ₂ управления ориентации мыши IgG2a).
   1. Развести раствор антител (20 мкг) в 1 мл (конечный объем физиологического раствора). Держите на льду.
   2. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
   3. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Мягкоагитировать. Дайте постоять 5 мин на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковые микропузырьки могут быть уничтожены в соответствии с средах с высоким давлением.
   4. После прошедшего времени, заполнить новый шприц с разведения антитела и добавить к соответствующему флаконе. Аккуратно агитировать. Пусть смесь (теперь 2 мл) стоять в течение 10 мин. Держите на льду. Предполагая полную поверхность сопряжения, среднее количество связанного лиганда для микропузырьков составляет примерно ¹⁸ 7600 лиганды / мкм ^2.
2. Восстановление нецелевого флаконов
   1. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
   2. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Аккуратно агитировать. Дайте постоять 5 мин. Добавить еще 1 мл физиологического раствора, как описано выше. Аккуратно агитировать и дать постоять 10 мин на льду.
3. Coulter подсчета
   1. Аккуратно агитировать нужный микропузырьков флакон и сделать ~50 мкл раствора в шприц емкостью 1 мл с использованием иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую 2 мл микроцентрифужных трубки.
   2. Пипетки 10 мкл образца раствора микропузырьков в 10 мл разбавителя.
   3. После осторожного перемешивания, оценки концентрации и размера распределения населения микропузырьков с помощью сошника счета (см перечень материалов). Граф минимум три 50 измерений мкл (в одном флаконе образца), используя 30 мкм диафрагмы.
4. Подготовка Микропузырьки для инъекций
   ПРИМЕЧАНИЕ: помощник выполняет этот шаг, когда "инъекции микропузырьков в эмбрионы" (шаг 6) началось. Каждый эмбрион вводят один раз, в зависимости от типа микропузырьков выбраны для каждой инъекции, чтобы быть случайным образом выбирается с заместителем таким образом, что все виды микропузырьков равномерно распределены в течение всей процедуры, но, приведенной в случайном порядке. Убедитесь, хирург слеп к тип пузырька вводили.
   1. Определить йе объем фондового пузыря решения, необходимого для получения конечной концентрации 1 х 10 ⁸ Мб / мл в объеме 400 мкл (рассчитать объем с помощью концентрации акций, измеренные в 5.3.3). Алиготе соответствующий объем физиологического раствора в пустую пробирку микроцентрифужных.
   2. Осторожно перемешивать выбранный микропузырьков пробирку и провести избыточного объема (~ 50 мкл, большую, чем рассчитано выше) раствора в 1 мл шприц с помощью иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую пробирку микроцентрифужных.
   3. Внесите необходимый объем микропузырьков маточного раствора и добавить к аликвоты раствора. Смешайте осторожным перемешиванием с кончиком пипетки.
   4. Нарисуйте разбавленный микропузырьков раствор в чистый шприц, используя иглу 21 G. Снятие иглы, устранить любые воздушные пузырьки из шприца и прикрепите Луер и трубы. Медленно нажать решение конец трубки решений, чтобы не генерировать пузырьки воздуха.
   5. Вставьте СиринGE в шприц инфузионного насоса, установленного для выдачи микропузырьков со скоростью 20 мкл / мин при общем объеме 20 мкл. Приложить вытащил стеклянную иглу до конца трубки. Перемещение насоса ближе к стадии впрыска.

6. Введение микропузырьков в эмбрионы

1. Случайно выбрать и удалить (с перфорированной ложкой) один эмбрион от охлажденной СМИ блюдо. Место в рассечение блюдо, расположенной на этапе ультразвукового под стереоскоп и удалить желточный мешок и амниотической мембраны с тонким пинцетом, резки / разрыв со стороны появившемся мере васкуляризированной (antimesometrial сторона). Это легко достигается путем прокалывания на территории, прилегающей к области головы.
   1. Вырезать достаточно, чтобы удалить эмбрион изнутри, но не более. Стабилизировать рассечение блюда, приготовленные из маленьких кусочков пластилина.
2. Аккуратно маневрировать мешочек со всего эмбриона. Установите эмбриона на его стороне, с плацентой иСосуды пуповины впереди. Использование насекомых штифты, придавить желточный мешок (4 контакта рекомендуется) и на кромки плаценты, при необходимости, чтобы прикрепить на месте. Избегайте крупных сосудов.
3. Вымойте эмбриона с подогретого 45 ° C PBS до эмбриона не приходит в себя. Определить пупочную вену и связанный с ним сосудистой сети. Расположите тарелку так, чтобы инъекция может быть сделано удобно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При нагреве, кровь в эмбрионе потечет, явно накачке в артерии пуповины. Когда впервые начинает поток, вены будут ярко-красные, с кровью в оба судна быстро появляются идентичны. Ветви, вытекающие из пупочной вены обычно перекрывают те из пупочной артерии на поверхности плаценты.
4. После того, как эмбрион возродился, покрыть его (но не плаценты) с предварительно нагретой США геля, будучи уверенным, деликатно удалить воздушные пузырьки (с использованием тонких щипцов) со всего эмбриона. Долить блюдо с подогретого PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за уровнем Solutiна в PBS и гель шприцы и добавить резервные шприцы отопительного стакане по мере необходимости.
5. Установить стекло иглу на большой шар пластилина на краю рассечение блюдо и вставить конец иглы в PBS. Выбор вены на хорионический поверхности плаценты диска, как далеко от главной ветви, как разумно, обрезать кончик размера с помощью ножниц. Инъекции легче, если кончик разрезают под небольшим углом. Удалите все зубчатые края стекла, используя лезвие весенних ножницами.
6. Использование шприца, медленно впрыскивают раствор микропузырьков при 20 мкл / мин в стеклянной иглы, пока весь воздух не будет исключен из кончика иглы и микропузырьки можно увидеть свободно течь в PBS. Остановите насос и сбросить за объемом впрыска от 20 мкл. Не впустить воздух сосудистой системы эмбриона во время инъекции.
7. Вставьте кончик стекла иглы осторожно в один из вены в плаценте и убедиться, что он неподвижен. Качели прочь стерoscope головы и положение выше эмбриона преобразователь. Инициировать изображений.

7. УЗИ молекулярной визуализации

Примечание: Использование контрастных нелинейные условия формирования изображения, установленные ранее, положение датчика так, что эмбрион расположен равномерно между фокусами 6 и 10 мм. Однажды расположенные начать внутривенную инъекцию микропузырьков. При инъекции завершено, запустить таймер.

1. Перфузии
   1. Убедитесь, что максимальное количество кадров для нелинейного режима контрастности выбрать, нажав кнопку "Управление исследование» и перейдите на вкладку «префов» в верхней части исследования браузере. Отметьте соответствующий квадрат в окне "Настройки".
   2. Настройте параметры обработки изображений, инициируя нелинейной изображений. Нажмите кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Уточнить 2D усиления путем корректировки «усиление & #8217; набрать 30 дБ, снизить мощность до 4% с помощью «власть» циферблата, уменьшить частоту 1 Гц с помощью 'частоту' набора и установить ширину луча (левый нижний угол), чтобы широкое использование ролик мяч / мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все органы управления расположены на панели управления ультразвуковой системы.
   3. Захват всего мыть-ин и рассеивание микропузырька болюса с помощью записи кинопетли 20 мин при частоте кадров 1 Гц. Пресс-скан / замораживания, чтобы начать сбор данных.
   4. После того, как полная последовательность изображений была захвачена, нажмите кнопку "киношный Store ', расположенный на панели управления, чтобы сохранить последовательность изображений в системном буфере. Система создает дате метками кинопетли нелинейных данных контраст модели приобрели.
2. Целевые Микросепаратор изображений
   1. В разделе "Prefs", установите время серийной съемки до 0,1 сек. Задайте соответствующие параметры изображения с помощью кнопок управления дезсываются выше (7.1.2.).
   2. Инициировать нелинейного изображений контрастности, нажав на кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Обеспечить эмбрион правильно расположен под датчиком, и что поток микропузырьков контрастного вещества через эмбриона видна в нелинейном режиме контраст изображения.
   3. Для оценки целевой микропузырьков связывания на стадии эмбриона, исследования молекулярной визуализации, позволяют микропузырьки циркулировать в покое на 3 мин и 40 сек после завершения инъекции. Это время, чтобы сохранение оборотных микропузырьков. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы остановить изображений в течение этого времени.
   4. В 3 мин и 40 сек, резюме визуализации, чтобы подтвердить, что эмбрион еще видны, адекватно покрыты PBS, и что микропузырьки продолжают циркулировать. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию.
   5. Приобретать последовательность нарушение / пополнения запасов 3 мин и 50 сек после инъекции с помощью записи 'пре-сового уничтоженияПоследовательность зации », акустический ответ, в 29 Гц. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать сбор данных. В 4 мин после инъекции ^18,19, инициировать 0,1 сек высокочастотный акустический взрыв. Нажмите кнопку "всплеск" для реализации взрыв.
   6. Продолжайте записывать кадры для остальной части последовательности (до буфера линия не полностью) и сохраните кинопетли нажав на кнопку "киношный магазин».
   7. Соберите дополнительную кинопетли оборотных микропузырьков. Предполагается, что эта последующая последовательность изображений «пост-уничтожение", чтобы содержать только циркулирующие сигналы пузырь, который пополнили луч. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию и "киношный магазин" собрать изображения.
   8. Этикетка петли киношных после съемки каждого эмбриона. Нажмите 'Управление исследование ", выделите файл, используя ролик мяч и' выберите 'кнопки, нажмите' изображения этикетку 'и имя соответствующим образом.

8. Обработка эмбрионов после инъекции

1. Сообщение изображения, перемещать преобразователь, открепить эмбрион и эвтаназии (с помощью декапитации, цервикальной дислокации, асфиксией диоксидом углерода, или анестезии с последующим быстрым замораживанием или фиксации), по желанию.
2. Для каждого последующего введения эмбрионов свежие рассечение блюдо, игла, шприц и труб сегмент должен быть использован, с подготовкой следующей партии впрыска микропузырьков решение, происходящих во время вскрытия и возрождения.
3. Сохранить образцы ткани (например, хвост, мозг) для дополнительных анализов (например, генотипирование определяется с помощью ПЦР анализа изолированной хвоста ДНК, окрашивания LacZ, или полу-количественные показатели экспрессии биомаркеров с помощью вестерн-блоттинга ^21).

Результаты

Инъекция ультразвуковых контрастных агентов в бывших маточно мышиных эмбрионов зависит от успешного выделения живых, в конце гестационного эмбрионов на стадии от матки и поддержание жизнеспособности в течение курса инъекций и связанной изображений ультразвука. После того, как ?...

Обсуждение

Ультразвуковые контрастные агенты вводили в поздней стадии эмбрионов беременность мыши и нелинейных контрастных изображений были приобретены для измерения параметров перфузии и целевых микропузырьков обязательными. Успешное изображений микропузырьков в пределах эмбрионального с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	This antibody/microbubble combination is often required as experimental control
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin	In house hybridoma		Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose	Sigma	D5796
50 ml Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020	lot # 7592456
Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde	Sigma	76240	4%
Phosphate Buffered Saline [1x]	Sigma	D8537	1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% sodium chloride (saline)	Hospira	0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted	MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm	Sigma	D8054
Centrifuge	Sorvall Legend RT centrifuge
Conical tubes, 50 ml BD Falcon	VWR	21008-938
Diluent	Beckman Coulter	Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner)	Fine Science Tools	Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
Forceps, splinter	VWR	25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker)	VWR	89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament	Narishige	GD-1
Glass needle puller	Narishige	PN-30
Gloves	Ansell	4002
Gross anatomy probe	Fine Science Tools	10088-15
Hot plate	VWR	89090-994
Ice bucket	Cole Parmer	RK 06274-01
Imaging Platform	VisualSonics Inc.	Integrated Rail System
Light source, fiber-optic	Fisher Scientific	12-562-36	Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread	Cole Parmer	45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency	VisualSonics Inc.	Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”)	VWR	305165
Particle size analyzer	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl]	Eppendorf	Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl]	Eppendorf	epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32”	VWR	63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head)	VWR	CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification	Fisher Scientific	Steromaster
Syringes, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
Syringes (10), 30 ml	VWR	CA64000-041
Syringe infusion pump	Bio-lynx	NE-1000
Thermometer, -20-110 °C	VWR	89095-598
Timer	VWR	33501-418
Tubes, Eppendorf	VWR	20170-577
Tube racks (3)	VWR	82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, angled up	Fine Science Tools	15005-08