АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Косвенным протокол иммунофлюоресценции описано в этой статье позволяет обнаруживать и локализовать белков в молочной железе мыши. Полный метод ее подготовки молочных желез образцы, для выполнения иммуногистохимии, чтобы изображение на срезах тканей с помощью флуоресцентной микроскопии, и, чтобы восстановить изображение.

Аннотация

Непрямой иммунофлуоресценции используется для обнаружения и определения местоположения интерес белков в ткани. Протокол, представленные здесь описывает полное и простой способ для иммунной обнаружения белков, мышь лактирующих молочную железу, принимаемых в качестве примера. Протокол для подготовки образцов ткани, особенно в отношении рассечение молочной железы мыши, ткани фиксации и замороженной ткани срезов, подробно. Стандартный протокол для выполнения непрямой иммунофлюоресценции, в том числе дополнительного шага поиска антигена, также представлены. Наблюдение меченых срезов, а также получение изображений и пост-обработки также заявил. Эта процедура дает полный обзор, из коллекции тканей животных в клеточной локализации белка. Хотя это общий способ может быть применен к другим образцов ткани, она должна быть приспособлена к каждой ткани / первичным антителом пару изучены.

Введение

Молочная железа является нетипичным млекопитающих экзокринной орган, основной функцией которого является производство молока, чтобы кормить новорожденных. Развитие ткани молочной железы происходит главным образом после родов и характеризуется уникального процесса, в котором эпителий вторжению в окружающую строму. Эта ткань подвергается много изменений (рост, дифференцировку и регрессия), особенно во время взрослой жизни, одновременно с изменениями в репродуктивного статуса (рисунок 1). В дополнение к общей морфологии ткани, пропорции различных типов клеток, а также их расположение в молочной железе резко изменяются в течение развития 1-5.

Во время эмбрионального жизни, молочной эпителия происходит от молочных линий молоко, которое определяется небольшим утолщением и стратификации эктодермы, между передними и задними конечностями с каждой стороны от средней линии вокруг эмбрионального день 10,5 (E10.5) (рис 1А ).На E11.5, молокопровод распадается на отдельные плакодах, которые симметрично расположены вдоль линии молочной молоко воспроизводимых местах, и окружающие мезенхимы начинает конденсироваться. Плакод начинают все глубже в дерму и молочной мезенхимы организует в концентрических слоев вокруг молочной зародыше (E12.5-E14.5). По E15.5, молочной эпителий, начинает размножаться и удлиненные, чтобы сформировать первичную росток, который толкает через молочной мезенхимы к жировой ткани. Основной росток развивает полый просвет с отверстием для кожи, отмеченной формирования соска оболочки. На E18.5, то удлиняя канал превратился в жировой ткани и имеет разветвленную в небольшой arborized системы протоков охватила в жировой ткани. Разработка, по существу, арестован и в зачаточном состоянии молочной железы остается морфогенетически покоя до наступления половой зрелости. В мужской эмбрион, активация рецепторов андрогенов приводит к дегенерации почек, которые исчезаютпо E15.5. По E18, молочной развития не перестает до полового созревания 6-9.

При рождении, молочной железы таит в себе элементарное систему протоков, что продлевает и филиалы медленно (изометрической роста). В начале полового созревания, сферические структуры, расположенные на кончиках протоков называют концевой почки (TEBS), образуются из внешнего слоя клеток рака простаты и многослойной внутреннего ядра клеток (клеток тела). Эти структуры являются весьма пролиферативного и проникнуть в окружающую ткань стромы в ответ на гормональные сигналы. Распространение в результатах TEBS в протоковой удлинения, в сочетании с морфогенеза ветвления. Этот процесс приводит к созданию основного эпителиального arborized сети, исходящей из соска (рис 1B, период полового созревания). В ~ 10-12 недель после рождения, когда эпителий вторглись весь жировой ткани, ее расширение прекращается и TEBS исчезают. Развитие протоков затем подвергается динамические изменения, т.е. успехуве пролиферацию и регресс эпителиальных клеток в соответствии с эстрального цикла 10 (Рис 1В, взрослых).

С самого начала беременности, молочной ткани подвергается существенный рост и морфологические изменения, чтобы подготовиться к лактации. Молочная эпителия интенсивно пролиферируют и дифференцируются, что ведет к сильно разветвленного тубуло-альвеолярного сети. Одновременно, эпителиальных клеток молочной железы (МИК) поляризованы и способны синтезировать и секретировать молочные продукты. МИК организовать в многочисленных альвеолярных структур (ацинусов), которые окружены сократительных клеток миоэпителиальных и включены в строме, состоящей из соединительной ткани и жировой, кровеносных сосудов и нервных окончаний (Фигура 1В, беременность). Кроме того, базальные сторона MECs находится в тесном контакте с базальной мембраной (внеклеточного матрикса), и взаимодействие между этими двумя организациями плотно регулировать как морфогенез и секреторную функцию молочной железыры эпителий 11-13.

Все эти процессы опираются на действия различных экологических киев, из которых наиболее важными являются hormones14, паракринных факторов и внеклеточного матрикса. Например, прогестерон вызывает обширный боковой ветвления 15 и alveologenesis, что, в сочетании с пролактина (PRL) 16,17, продвигает и поддерживает дифференцировку альвеол. В дополнение к стероидам и PRL18, цитокинов и сигнальных путей, связанных с развитием (Wnt и Notch сигнальными путями) также участвуют в молочной приверженности клонов и развития 19-21. В конце беременности, просвета МИК начинают производить богатой белком молока, известный как молозиво в просвете альвеол. Кроме того, прогестерон действует на эпителиальной проницаемости и так как плотные соединения остаются открытыми, молозиво также в материнском кровотоке.

После родов, то Mammarу эпителий занимает почти всю молочную железу и объема имеет высокую степень организации (рисунок 2, эпителия молочной железы). Молоко производящих единиц, а именно альвеолы ​​(Рисунок 2, альвеолы), формируются монослоя поляризованных эпителиальных молочных секреторных клеток (MESCs), с их апикальной плазматической мембраны разграничения просвет. Альвеолы ​​организовать себя на дольки, которые сгруппированы в долях, связанных с каналами, которые истощают молоко с внешним среде (рис 2, доли). Лактации происходит, т.е.., MESCs начинают секретировать обильные количества молока, в первую очередь вызвано снижением плацентарных гормонов (главным образом прогестерон) (фиг.1В, лактации). Гены молочного белка активируются в определенном временном время хода в диапазоне от беременности лактации 9,22,23, главным образом, в ответ на PRL гипофиза, опубликованном в момент кормления грудью. Одновременно, контакты между MESCs и внеклеточного матрикса как стимулировать молочный белок SYNThesis через сигналы, которые передаются через взаимодействий между клеточными интегринов и ламинином 24,25, подавляющих апоптоз и в MESCs 26,27. Эти сигнальные пути приводит к активации молочного белка промоторов генов 28 через активацию факторов транскрипции конкретного 29. Межклеточных контактов также важны для некоторых аспектов дифференцировки, включая создание верхушечного полярности и векторной секреции молочных продуктов. Плотные соединения быстро закрыть после начала лактации и MESCs мелко организовать поглощение молекул из крови, а также синтеза, транспорта и секреции молочных компонентов, в ответ на потребности в питании новорожденных. Во время сосания, сокращение миоэпителиальных клеток, окружающих альвеолы ​​происходит в ответ на окситоцина и приводит к выделению молока по протокам и в соске. Молоко представляет собой сложную жидкость, которая содержит белки (в основномказеин), сахара (в основном лактозы), липиды и минеральные вещества, а также биологически активные молекулы, такие как иммуноглобулины (IgA), факторов роста и гормонов. Казеины синтезируются, собраны в супрамолекулярных структур, а именно казеин мицеллы, транспортируемые вдоль секреторного пути, а затем выпущен экзоцитоза, то есть сплав казеина, содержащего секреторные везикулы (КА) с апикальной мембране мЭСК (рисунок 2).

Внутриклеточного транспорта зависит от материальных обменов между мембранных отсеков и включает в себя Растворимый N-этилмалеимид-Чувствительный Fusion (NSF) Приложение белка (SNAP) рецепторов (SNARE) 30,31. Семья SNARE белки подразделяется на везикулярного SNAREs (V-ловушки), присутствующих в мембране везикул и целевых SNAREs (т-ловушки), локализованные на целевых мембран. По сжать через их биспиральных доменов, V и Т-SNAREs собрать с образованием высокостабильный четыре спиралей комплекс, называют йе SNARE комплекс. Этот комплекс способствует сочетание двух противоположных липидного бислоя постепенно привести их в непосредственной близости 30,32. Впоследствии, Малый комплексы диссоциируют на NSF аденозинтрифосфатазы и его адаптер белка SNAP и малого белки возвращают обратно в купе происхождения 33. Интересно, что каждый белок SNARE преимущественно проживает в различных клеточных отсеках и малого спаривания может внести свой ​​вклад в специфичность внутриклеточных событий термоядерных 34. Предыдущие исследования показывают, что, по крайней мере Синаптосомальное-ассоциированный белок 23 (SNAP23) и везикул-ассоциированный мембранный белок 8 (VAMP8) и syntaxins (STX) -7 -12 и играют важную роль в казеина экзоцитоза 35,36. Эти белки были также обнаружены в ассоциации с липидной фракции молока, т.е. молоко жировых шариков (МФГС) 37. В настоящее время преобладает модель постулирует, что цитоплазматические капли липидов (CLDs) образуются в результате накопления нейтральной лipids (главным образом триглицериды и эфиры стеринов) и холестерин, полученный от материнской диете между двумя листовок эндоплазматическая сеть (ЭР) мембраны 38-41. Большие CLDs формируются, по крайней мере частично, путем слияния меньших CLDs во время транспортировки в апикальной стороне MESCs где они будут освобождены, как MFGS (1-10 мкм в диаметре) почкованием, будучи enwrapped по MESC апикальной мембране 40-42. Кормление грудью прекращается через щенки отнимают и MESCs постепенно умирают путем апоптоза, что приводит к регрессии ткани молочной железы обратно в пубертатном состоянии (рис 1B, инволюция).

Иммунофлуоресценции (ИФ) является общим аналитическая лаборатория метод используется практически во всех аспектах биологии, и в научных исследованиях и в клинической диагностике. Если методы могут быть выполнены на срезах тканей (иммуногистохимия, IHC) или (иммуноцитохимия, ICC) Образцы клеток. Этот мощный подход основан на использовании fluorescent-меченые антитела, которые специфически связываются (прямо или косвенно) к интересующему антигену, таким образом позволяя визуализацию его распределение в тканях через флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентных сигналов во многом зависит от качества и концентрации антител и надлежащей обработки образца. Простой непрямой иммунофлюоресценции (IIF) протокол представлен для обнаружения молочные продукты (казеин и МФГС) и белков, участвующих в секреции молочных продуктов (butyrophilin (btn1), Малый белки) на замороженных участках молочной железы мыши ткани (рисунок 3). Хотя этот протокол обеспечивает полный обзор IHC, начиная от сбора ткани для изображения после лечения, важно и дополнительных шагов, а также некоторых технических рекомендаций также представлены и обсуждены.

протокол

Мышей CD1 были выведены на INRA (UE0907 IERP, Жуи-ан-Жоза, Франция). Все этические аспекты ухода за животными соблюдены соответствующих руководящих принципов и требований лицензирования, установленными французского министерства сельского хозяйства. Процедуры, используемые были утверждены местным комитетом по этике (соглашения 12/097 от Comethea Жуи-ан-Жоза / AgroParisTech).

1. молочной железы Подготовка проб

  1. Мышь молочной железы рассечение
    1. Эвтаназии мышей на 10-й день лактации путем смещения шейных позвонков и закрепить животное вниз с его живота вверх.
    2. Намочите вентральной области с этанолом и высушить его с бумажным полотенцем.
    3. Использование щипцов, подтянуть кожу живота между двух задних ногах и сделать надрез (только через кожу) около 1 см с острыми ножницами. Начиная с этого первого разреза, а затем использовать ножницы, чтобы вырезать кожу до шеи на мышь. Потяните кожу от брюшины и пин вниз одной стороны кожи в то время,, растягивание его учили.
    4. Соберите брюшной полости и паховых молочных желез от толкая их от кожи с помощью тампона и, наконец, потянув или резки их от брюшины.
      Примечание: На этом этапе окрашивание кармин может быть выполнена для того, чтобы визуализировать эпителия молочной железы в течение всей железы 43. Этот подход может быть полезен для анализа глобальной морфологии молочной железы при различных условиях (физиологические этапы развития, заболевания, в естественных условиях обработки).
    5. Снимите лимфатический узел, расположенный на стыке брюшной и паховых желез 44.
  2. Молочная фиксация тканей
    1. Вырезать ткань молочной железы на 3 мм 3 фрагменты скальпелем и немедленно промойте эти фрагменты в фосфатным буферным раствором (PBS), раствор, рН 7,4, для того, чтобы удалить как можно больше молока, насколько это возможно.
    2. Быстро высушить фрагменты на бумагеполотенце и положить их в холодный раствор PBS, содержащего 4% параформальдегида (PFA, HCHO, 32% раствор формальдегида, осторожность) в течение 10 до 15 минут на льду.
      Примечание: Это достаточно времени, чтобы последующий анализ на срезах тканей молочных путем IIF36 и / или в гибридизация 45. Однако, как альдегидные фиксаторы проникают довольно медленно в тканевых частей (~ 1-3 мм в час), в этот раз может быть продлен чтобы обеспечить оптимальный фиксацию образца ткани. Кроме того, исправить ткани в естественных условиях путем перфузии наркозом животное с фиксирующим раствором (не описано в данном исследовании).
  3. Сахароза настой
    1. Быстро промыть молочной фрагменты в холодной PBS и погружают их в растворе PBS холодной, содержащего 40% сахарозы (D-сахароза, C12H22O11, н 342,3 г / моль) в течение 16 ч до 48 при 4 ° С при легком встряхивании.
  4. Ткань вложение
    Примечание: На этом этапе, молочные фрагменты могут быть повторно сократить для того, чтобы мелких фрагментов (2-3 мм 3) Или настроить свою форму.
    1. Правильно маркировать пластиковые формы и заполнить треть объема пресс-формы с соединением ОСТ, поддерживаемой при комнатной температуре. Разместите один фрагмент (2-3 мм 3) ткани молочной железы на форму и покрыть ее ОКТ соединения.
    2. Поместите формы на поверхности жидкого азота (на листе алюминия или с помощью металлического сита) и позволяют продукт для замораживания.
      Примечание: Она должна стать твердым и белый перед погружением формы в жидком азоте.
  5. Хранить замороженные образцы при -80 ° С до тех пор, срезы тканей не производится.

2. Замороженные ткани Секционирование

Примечание: криостат, которая по существу является микротом внутри морозильной камеры, требуется, чтобы сделать замороженных срезов. Более низкая температура часто требуется для жира или с высоким содержанием липидов тканей, таких как девственной молочной железы.

  1. Отрегулируйте температуру криостата до -26 ° C и подождите, пока он не имеет STABIванный. Поддерживать блок замороженной ткани на -26 ° C на протяжении всей процедуры секционирования. Совершенно избежать оттаивания ткани в любой момент во время процедуры.
  2. Охладите лезвие, поддержка резания, стабилизирующая устройства и кисть до -26 ° С, помещая их в криостат, по крайней мере 10 мин. Кроме разместить слайд коробку внутри криостата, чтобы иметь возможность хранить стеклянные пластинки, как секции выполнены.
  3. Правильно маркировать стеклянные слайды, которые будут использоваться для сбора срезов тканей и поддерживать их при комнатной температуре; в противном случае срезы ткани не будет придерживаться их. Удалить образец из формы внутри криостата.
    Примечание: Использование положительно заряженные предметные стекла значительно способствовать адгезии свежих замороженных срезов из-за более высокой электростатического притяжения.
  4. Накройте поверхность металлической ткани диска с ОКТ соединения (поддерживается при комнатной температуре) и нажмите замороженные пробы на него. Поместите влажный монтировать внутри криостата и пусть он совместноол, по крайней мере 15 мин.
  5. Поместите влажный крепление в держатель диска криостата. Отрегулируйте толщину резки до 5-6 мкм, и, если это возможно, использовать новую острое лезвие или по крайней мере изменить область на лезвии, используемой, чтобы сократить каждого образца, так как некоторые ткани будет быстро скучно его.
  6. Регулировка положение стабилизатора устройства над лезвием путем куски монтажной среды до тех пор, пока кусочки образуются равномерно и правильно. В идеале, стабилизатор устройство шаг за лезвием бритвы по 1 мм.
  7. После того, как все настройки верны, выполните срезов тканей, поворачивая колесо в непрерывном равномерном движении. Если температура не является идеальным, срез ткани будет, по своей природе, попробуйте свернуться.
    1. Используйте щетку, чтобы захватить и маневрировать в разрезе по сцене, чтобы разместить его по своему желанию на предметное стекло. Используйте щетку для очистки остатки, возможно, присутствующие на замерзшем блока тканей и / или лезвием бритвы.
  8. Тянутьраздел ткани к пользователю и избегать нажатия его на сцену криостата. Избегайте нажатия срезы ткани на стадии криостата, как это может привести к адгезии тканей срез на стадии и, следовательно, невозможности восстановления его предметное стекло.
  9. Получить срезах тканей по одному, выбирая их на поверхности стекло, держа его над секцией и рыбалка вниз, чтобы коснуться срезы ткани.
    Примечание: участки ткани быстро присоединиться к теплой стекла из-за статического притяжения. Если несколько разделов ткани помещают на одном слайде, будьте осторожны, чтобы не перекрывать их и интервалы между ними достаточно, чтобы быть в состоянии индивидуально вложить их в гидрофобной окружности (см раздел 3.1.1.).

3. непрямой иммунофлуоресценции

  1. Расположение разделы
    1. Используйте гидрофобный барьер перо, чтобы нарисовать круг вокруг гидрофобного слайд-монтажа ткани. Пусть круг высохнуть в течение примерно 1 мин при комнатной температуре. Нарисуйте линию вокруг твыпуск участки с тонкой черной перманентным маркером, а также, но на стороне стекле напротив той, где участки ткани.
      Примечание: Этот круг водоотталкивающий и acetone- и алкоголь нерастворимых. Поэтому оно предлагает барьер для водных растворов, используемых в процессе IHC и уменьшает объем требуемых реагентов.
    2. Увлажняет срезах тканей путем покрытия их с каплей ~ 250 мкл PBS в течение нескольких минут при комнатной температуре. Fix срезах тканей путем покрытия их ~ 250 мкл свежеприготовленного 3% -ным раствором PFA в PBS в течение 10 до 15 мин.
      Примечание: При желании в этом случае, используйте решение альдегид закалки (50 мМ хлорида аммония (NH 4 Cl, г-н 53,5 г / моль) в PBS или 0,1 М глицин (C 2 H 5 NO 2, г-н 75.07 г / моль) в PBS ), чтобы остановить реакцию связывания. Простой и обильные PBS стиральная правило, достаточно, чтобы удалить непрореагировавший альдегид.
  2. Поиск антигена (по желанию)
    Примечание: В то время как большинство антигены могут быть обнаружены без извлечения антигена (AR), другие будут наблюдаться только тогда, когда выполняется этот шаг. В некоторых случаях, АР также позволяет повышение наблюдаемого сигнала.
    1. Поместите AR решение (100 мМ Трис (C 4 H 11 NO 3, г 121,14) 5% мочевины (NH 2 CONH 2, г 60,06) рН 9,6) в химическом стакане. Объем раствора AR должна быть достаточной, чтобы полностью покрыть стеклянные слайды помещают в держатель стекла.
    2. Разогреть AR решение 95 ° C с помощью мониторинга температуры с помощью термометра, а затем поместить стеклянные слайды на подходящем стойки, immerge стойку в горячей буфера, крышка, чтобы ограничить испарение и инкубировать в течение 10 мин при 95 ° С.
    3. Удалить стакан с водяной бани и оставляют стеклянные слайды течение еще 10 мин в буфере.
  3. Иммунологический
    1. Промыть срезах тканей с PBS (~ 250 мкл / раздела) и насыщают их решения3% бычьего сывороточного альбумина (BSA, ~ 250 мкл / раздела) в PBS в течение не менее 30 мин при комнатной температуре.
    2. Поместите 30-50 мкл первичного антитела, разбавленного в PBS, содержащий 2% BSA в каждой секции ткани.
      Примечание: Этот объем достаточно, чтобы сформировать каплю, который полностью покрывает секцию ткани.
    3. Поместите тот же объем разбавителя (2% BSA в PBS) в покое на срез ткани для выполнения отрицательный контроль без первичных антител.
      1. Систематический этот негативный контроль в каждом эксперименте IHC и выполнять для каждого вторичного антитела, используемого для оценки фона эксперимента (неспецифической маркировки в связи с вторичным антителом и / или тканей автофлуоресценции). Другие типы положительных или отрицательных контролей также может быть выполнена, чтобы обеспечить специфичность маркировки (обсуждение см).
    4. Поместите стеклянные пластинки в увлажненной коробки O / N при 4 ° С.
      Примечание: Первичные антитела были использованы мышиные моноклональные антитела-цитокератин8 (CK8, разведение 1:50), мышиное моноклональное анти-цитокератин 14 (CK14, разведение 1:50), кроличьи поликлональные антитела против мышиного казеина (# 7781, 1:50 разбавления, любезно предоставлена ​​MC Невилл, Университета Колорадо здравоохранения Центр наук, СО, США), кроличьи поликлональные анти-btn1 (1: 300 разведение, любезно предоставлена ​​IH Mather, Департамент животных и птиц наук, Университет штата Мэриленд, Колледж-Парк, штат Мэриленд, США), кролик поликлональных анти-Stx6 ( разведение 1:50, любезно предоставлена ​​С. Туз, Cancer Research UK, научно-исследовательского института в Лондоне, Лондон, Великобритания) и кролик поликлональных анти-VAMP4 (разведение 1:50).
    5. Тщательно мыть срезах тканей с PBS, по крайней мере четыре раза в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Развести соответствующий вторичного антитела (родамин-конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG (H + L), 1: 300 разведение) в PBS, содержащий 2% BSA, разместить 30-50 мкл этого раствора на всех срезах тканей, и инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
      1. Так флуорохромы являются молекулы светочувствительные, нене подвергайте срезах тканей на свет, пока их анализа. Для IIF на срезах тканей, способствуют вторичных антител, соединенных с красным флуорофором, поскольку клеточные мембраны имеют тенденцию генерировать зеленый автофлуоресценции, которые могут помешать низкой маркировки. Кроме того, выбирая красный флуорофора связью вторичного антитела позволяет сопутствующей маркировке нейтральных липидов (см. Ниже)
    7. Тщательно промыть срезы ткани с PBS, по крайней мере четыре раза в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. После фиксации (по желанию)
    1. Для некоторых экспериментах, выполнить пост-фиксацию путем инкубации образцов с 2% PFA в PBS разбавленные в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы стабилизировать каркасов антиген / антитело. Тем не менее, этот шаг можно обойтись в большинстве случаев.
  5. Нейтральные липиды и ДНК counterstaining
    1. Для визуализации CLDs и МФГС, цветные нейтральные липиды путем инкубации срезов ткани в 30-50 мкл раствора PBS, содержащего 3 мкг / мл BODIPY 493/ 503 в течение 10 мин при комнатной температуре. Быстро промойте срезы ткани дважды PBS.
    2. Контрастное ядерной ДНК с 30-50 мкл раствора PBS, содержащего 3 мкМ DAPI (4-6-диамидино-2-фенилиндола, 5 мг / мл исходного раствора) в течение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте срезах тканей с PBS в два раза, прежде чем устанавливать слайды для наблюдения.
  6. Раздел монтаж
    1. Удалить PBS и поместить каплю монтажа среды на каждом разделе ткани.
    2. Поместите одну сторону покровным под углом по отношению к слайд, в контакт с внешним краем капли жидкости, а затем опустить крышку медленно, во избежание воздушных пузырей. Дайте жидкости распределяется между стекле и покровным в течение нескольких минут, а затем удалить излишки монтажа среды с бумажным полотенцем.
    3. Печать покровное к стекло с лаком для ногтей и магазин тканей разделов при 4 ° С не допустить их попадания света до наблюдения.

4. флуоресценции Наблюдательные Приобретение изображения

Примечание: флуоресцентный микроскоп оснащен камерой контролируется программным обеспечением захвата изображений требуется соблюдать результаты IHC.

  1. Прежде, чем приобрести изображения, проверить интенсивность маркировки и оценить фон эксперимента, глядя на отрицательных контролей. Приобретать фотографии каждого флуоресцентной метки (цвет канала) в отдельности.
  2. Приобретать все фотографии, в том числе и соответствующие элементы управления, в тех же условиях (воздействия и общих настроек) для каждого цветового канала.
  3. Обычные микроскопии
    1. Выполните эпифлуоресцентной микроскопии с помощью микроскопа, оснащенного стандартным фильтрам для флуоресцеинизотиоцианатом (FITC, зеленый), родамин (красный) и DAPI (синий) выбросов, × 20 до × 63 (масло-погружение, NA 1.3) целей и камеру изображения DP50.
  4. Конфокальной микроскопии
  5. Выполните конфокальной микроскопии с Microsризу оснащен программным обеспечением ZEN, используя × 20 × 63 для масла (погружение-NA, 1.4) целей и длин волн возбуждения 488- и 568-нм лазера.

Лечение 5. Изображение

Примечание: Все изображения пост-обработки производится при помощи бесплатного программного обеспечения ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=dobj).

  1. Наложение изображения (слияние)
    1. Откройте изображения, полученные в каждом канале, что будут объединены (Файл / Открыть). При работе с 8-битными изображениями в градациях серого, атрибут искусственный цвет на каждый канал, используя таблицу поиска (таблицы Изображение / Lookup).
    2. Создание составного изображения в градациях серого с цветными изображениями, используя команду "Объединить каналы" (изображение / цвет / Объединить каналы), а затем, приписывая цвет каждого канала.
    3. Выполните изображение складывается наложение таким же образом, открыв стеки, приобретенные в каждом канале, что будут объединены (Файл / Открыть) и с помощью команды "Объединить каналы и# 8221; (Изображение / цвет / Объединить каналы) приписывать цвет каждого канала. Сохраните составной стек в виде последовательности изображений или в виде фильма (см раздел 5.4).
  2. Изображение стек Z проекция
    1. Используйте функцию Z проекции (изображения / Стек / Zproject, Макс Intensity), чтобы обеспечить двумерное представление всех фотографий стека изображения, проецируя их вдоль оси, перпендикулярной к плоскости изображения (Z-оси). Опция "Максимальная интенсивность" создает образ, в котором каждый пиксель содержит максимальное значение за всех изображений в стеке. Это создает одно изображение, позволяя визуализацию всей наблюдаемой окрашивания через стек изображения всей для конкретного канала или после наложения нескольких каналов.
  3. Изображение стек 3D проекция
    1. Используйте команду 3D проецирования (Изображение / Стек / 3D проект, яркая точка, ось у), чтобы сформировать последовательность проекций вращающейся объема на плоскости. , Визуализация суrfaces и внутренние структуры зависит как метод проектирования (ближайшие точки, яркая точка (используется здесь), или среднего значения) и параметры визуализации выбран. Каждый кадр анимационного последовательности является результатом проецирования под другим углом зрения.
    2. Поверните созданный 3D изображения вокруг каждой из трех ортогональных осей (ось у была выбрана здесь). Сохранить последовательность, полученный в качестве одного изображения или фильма.
  4. Стек изображение, чтобы фильм преобразования
    1. Открыть стека изображений (Файл / Открыть) и сохраните его как фильм в формате .AVI с помощью команды "AVI" (Файл / Сохранить как / AVI).

Результаты

Молочная железа является подкожная железа, расположенная вдоль вентральной структуры как грудной клетки и брюшной полости у грызунов. Расположение пяти пар желез мыши во время беременности показано на рисунке 4. Морфология молочной железы резко меняется в своем разви?...

Обсуждение

IHC является относительно простой и прямой экспериментальный метод локализации антигена в срезах тканей, которые в первую очередь зависит специфический эпитоп-антитело взаимодействий. Хотя большое количество протоколов используются для локализации белка на IIF, сердечник из этих проц?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарны основной изображений объекта ИНРА MIMA2 (INRA, UMR1198, Жуи-ан-Жоза) и сотрудникам аппарата IERP (UE 0907, ИНРА, Жуи-ан-Жоза) для ухода за животными и удобствам. Мы хотели бы также поблагодарить IH Mather, MC Невилл и С. Туз за предоставление нам очень полезную antibodie.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DissectionCompanyCatalog NumberComments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparationCompanyCatalog NumberComments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)SigmaP-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)Electron Microscopy Sciences15714-Spersonnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue TekSakura4583
Sucrose (D-saccharose)VWR27480.294
Plastic moldsDominique Dutscher39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample supportLeica CM3050S
Razor blades (SEC35)Thermo Scientific152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra PlusThermo Scientific10143560W90/1014356190
Brushes
IHCCompanyCatalog NumberComments/Description
Super Pap PenSigmaZ377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBSSigmaA-0171
0.1 M glycine in PBSVWR24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPIVector LaboratoriesH-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)VWRCORN2980-225
Nail polish
Primary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences
Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)Biolegend (Covance)MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)Thermo ScientificMS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)generously gifted S. Tooze
(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)Abcamab3348
Secondary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-025-003
CounterstainsCompanyCatalog NumberComments/Description
Bodipy 493/503Life Technologies (Molecular Probes)D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)Life Technologies (Molecular Probes)D-1306
Observation/Image captureCompanyCatalog NumberComments/Description
conventional fluorescence microscopeLeica Leitz DMRB
microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine
and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)Zeiss LSM
510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatmentCompanyCatalog NumberComments/Description
ImageJ 1.49k softwareFree software

Ссылки

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: a journey of morphogenesis and commitment. Development. , 135-995 (2008).
  2. Smith, G. H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo model: evidence for distinct cellular progenitors of the ductal and lobular phenotype. Breast Cancer Res Treat. 39, 21-31 (1996).
  3. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479, 189-193 (2011).
  4. Oakes, S. R., Gallego-Ortega, D., Ormandy, C. J. The mammary cellular hierarchy and breast cancer. Cell Mol Life Sci. 71, 4301-4324 (2014).
  5. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes & development. 28, 1143-1158 (2014).
  6. Robinson, G. W. Cooperation of signalling pathways in embryonic mammary gland development. Nat Rev Genet. 8, 963-972 (2007).
  7. Cowin, P., Wysolmerski, J. Molecular mechanisms guiding embryonic mammary gland development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003251 (2010).
  8. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003178 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Integrated morphodynamic signalling of the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 581-593 (2011).
  10. Daniel, C. W., Smith, G. H. The mammary gland: a model for development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 3-8 (1999).
  11. Howlett, A. R., Bissell, M. J. The influence of tissue microenvironment (stroma and extracellular matrix) on the development and function of mammary epithelium. Epithelial Cell Biol. 2, 79-89 (1993).
  12. Edwards, G., Streuli, C. Signalling in extracellular-matrix-mediated control of epithelial cell phenotype. Biochem Soc Trans. 23, 464-468 (1995).
  13. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes & development. 12, 449-455 (1998).
  14. Topper, Y. J., Freeman, C. S. Multiple hormone interactions in the developmental biology of the mammary gland. Physiol Rev. 60, 1049-1106 (1980).
  15. Brisken, C., et al. A paracrine role for the epithelial progesterone receptor in mammary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 5076-5081 (1998).
  16. Ormandy, C. J., Binart, N., Kelly, P. A. Mammary gland development in prolactin receptor knockout mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2, 355-364 (1997).
  17. Oakes, S. R., Rogers, R. L., Naylor, M. J., Ormandy, C. J. Prolactin regulation of mammary gland development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 13, 13-28 (2008).
  18. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 715-725 (2005).
  19. Kouros-Mehr, H., Werb, Z. Candidate regulators of mammary branching morphogenesis identified by genome-wide transcript analysis. Dev Dyn. 235, 3404-3412 (2006).
  20. Khaled, W. T., et al. The IL-4/IL-13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development. Development. 134, 2739-2750 (2007).
  21. Asselin-Labat, M. L., et al. Gata-3 is an essential regulator of mammary-gland morphogenesis and luminal-cell differentiation. Nat Cell Biol. 9, 201-209 (2007).
  22. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105, 223-235 (1989).
  23. Robinson, G. W., McKnight, R. A., Smith, G. H., Hennighausen, L. Mammary epithelial cells undergo secretory differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation. Development. 121, 2079-2090 (1995).
  24. Streuli, C. H., Bissell, M. J. Mammary epithelial cells, extracellular matrix, and gene expression. Cancer Treat Res. 53, 365-381 (1991).
  25. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. J Cell Biol. 129, 591-603 (1995).
  26. Boudreau, N., Sympson, C. J., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 267, 891-893 (1995).
  27. Pullan, S., et al. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium. J Cell Sci. 109 (Pt 3), 631-642 (1996).
  28. Schmidhauser, C., Bissell, M. J., Myers, C. A., Casperson, G. F. Extracellular matrix and hormones transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9118-9122 (1990).
  29. Streuli, C. H., et al. Stat5 as a target for regulation by extracellular matrix. J Biol Chem. 270, 21639-21644 (1995).
  30. Sollner, T., et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature. 362, 318-324 (1993).
  31. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  32. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  33. Sollner, T., Bennett, M. K., Whiteheart, S. W., Scheller, R. H., Rothman, J. E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion. Cell. 75, 409-418 (1993).
  34. McNew, J. A. Regulation of SNARE-mediated membrane fusion during exocytosis. Chem Rev. 108, 1669-1686 (2008).
  35. Wang, C. C., et al. VAMP8/endobrevin as a general vesicular SNARE for regulated exocytosis of the exocrine system. Mol Biol Cell. 18, 1056-1063 (2007).
  36. Chat, S., et al. Characterisation of the potential SNARE proteins relevant to milk product release by mouse mammary epithelial cells. Eur J Cell Biol. 90, 401-413 (2011).
  37. Reinhardt, T. A., Lippolis, J. D. Bovine milk fat globule membrane proteome. J Dairy Res. 73, 406-416 (2006).
  38. Robenek, H., et al. Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10385-10390 (2006).
  39. Fujimoto, T., Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y. Lipid droplets: a classic organelle with new outfits. Histochem Cell Biol. 130, 263-279 (2008).
  40. Mather, I. H., Keenan, T. W. Origin and secretion of milk lipids. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, 259-273 (1998).
  41. Heid, H. W., Keenan, T. W. Intracellular origin and secretion of milk fat globules. Eur J Cell Biol. 84, 245-258 (2005).
  42. McManaman, J. L., Russell, T. D., Schaack, J., Orlicky, D. J., Robenek, H. Molecular determinants of milk lipid secretion. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 12, 259-268 (2007).
  43. de Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  44. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  45. Galio, L., et al. MicroRNA in the ovine mammary gland during early pregnancy: spatial and temporal expression of miR-21, miR-205, and miR-200. Physiol Genomics. 45, 151-161 (2013).
  46. Linzell, J. L., Peaker, M. The effects of oxytocin and milk removal on milk secretion in the goat. J Physiol. 216, 717-734 (1971).
  47. Knight, C. H., Peaker, M., Wilde, C. J. Local control of mammary development and function. Rev Reprod. 3, 104-112 (1998).
  48. Walid, M. S., Osborne, T. J., Robinson, J. S. Primary brain sarcoma or metastatic carcinoma?. Indian J Cancer. 46, 174-175 (2009).
  49. Hue-Beauvais, C., et al. Localisation of caveolin in mammary tissue depends on cell type. Cell Tissue Res. 328, 521-536 (2007).
  50. McManaman, J. L., Neville, M. C. Mammary physiology and milk secretion. Adv Drug Deliv Rev. 55, 629-641 (2003).
  51. Mather, I. H., Jack, L. J. A review of the molecular and cellular biology of butyrophilin, the major protein of bovine milk fat globule membrane. J Dairy Sci. 76, 3832-3850 (1993).
  52. Heid, H. W., Winter, S., Bruder, G., Keenan, T. W., Jarasch, E. D. Butyrophilin, an apical plasma membrane-associated glycoprotein characteristic of lactating mammary glands of diverse species. Biochim Biophys Acta. 728, 228-238 (1983).
  53. Bock, J. B., Klumperman, J., Davanger, S., Scheller, R. H. Syntaxin 6 functions in trans-Golgi network vesicle trafficking. Mol Biol Cell. 8, 1261-1271 (1997).
  54. Tran, T. H., Zeng, Q., Hong, W. VAMP4 cycles from the cell surface to the trans-Golgi network via sorting and recycling endosomes. J Cell Sci. 120, 1028-1041 (2007).
  55. Wendler, F., Page, L., Urbe, S., Tooze, S. A. Homotypic fusion of immature secretory granules during maturation requires syntaxin 6. Mol Biol Cell. 12, 1699-1709 (2001).
  56. Wendler, F., Tooze, S. Syntaxin 6: the promiscuous behaviour of a SNARE protein. Traffic. 2, 606-611 (2001).
  57. Shitara, A., et al. VAMP4 is required to maintain the ribbon structure of the Golgi apparatus. Mol Cell Biochem. 380, 11-21 (2013).
  58. Thibault, C., Levasseur, M. C. . La reproduction chez les mammifères et l'homme. , 928 (2001).
  59. Truchet, S., Wietzerbin, J., Debey, P. Mouse oocytes and preimplantation embryos bear the two sub-units of interferon-gamma receptor. Mol Reprod Dev. 60, 319-330 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

106

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены