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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Abstract

Regolamento di abbondanza di proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l'integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine ​​(per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l'uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine ​​nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine ​​in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine ​​cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.

Introduzione

Le proteine ​​svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l'abbondanza di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine ​​che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari, le cellule utilizzano meccanismi di controllo della qualità degradativi di eliminare mal ripiegate, non montati, o in altro modo aberranti molecole proteiche 3. Controllo di abbondanza di proteine ​​comporta regolazione sia la sintesi macromolecolari (trascrizione e traduzione) e la degradazione (RNA decadimento e proteolisi). degradazione delle proteine ​​deteriorate o eccessivo contribuisce a molteplici patologie, Tra cui il cancro, fibrosi cistica, malattie neurodegenerative, disturbi cardiovascolari e 4-8. Meccanismi proteolitici rappresentano quindi bersagli terapeutici promettenti per una serie di malattie 9-12.

L'analisi delle proteine ​​in un unico punto di tempo (ad esempio, da Western Blot 13, citometria a flusso 14, o microscopia a fluorescenza 15) fornisce un'istantanea di costante abbondanza di proteine ​​stato senza rivelare i relativi contributi di sintesi o degradazione. Allo stesso modo, le analisi giornalista di crescita a base riflettono costanti i livelli di proteina stato più di un periodo di tempo prolungato senza discriminazioni tra le influenze di sintesi e degradazione 15-20. È possibile dedurre il contributo dei processi degradativi a livelli proteici stato stazionario confrontando abbondanza prima e dopo inibendo componenti specifici del meccanismo degradativa (ad esempio, dal farmacologicamente inattivando la proteasome 21 o buttare giù un gene ipotizzato per essere necessari per la degradazione 13). Un cambiamento nei livelli di proteina regime permanente dopo inibendo percorsi degradativi fornisce una forte evidenza per il contributo della proteolisi per il controllo delle proteine ​​dell'abbondanza 13. Tuttavia, una tale analisi ancora non fornisce informazioni per quanto riguarda la cinetica del turnover proteico. Chase Cycloheximide seguita da western blotting supera queste debolezze, consentendo ai ricercatori di visualizzare la degradazione delle proteine ​​nel tempo 22-24. Inoltre, poiché la rilevazione delle proteine ​​seguente cycloheximide Chase è in genere eseguita da western blotting, isotopi radioattivi e passaggi immunoprecipitazione lunghi non sono necessari per cycloheximide caccia, a differenza di molte tecniche di inseguimento di impulso comunemente utilizzate, che sono anche eseguite per visualizzare la degradazione delle proteine ​​25.

Cycloheximide è stato identificato come un composto anti-fungine correttalegami prodotte dai Streptomyces batterio gram-positivo griseus 26,27. Si tratta di una molecola cellula-permeabile che inibisce specificamente citosolico eucariote (ma non organelli) Traduzione alterando ribosomiale traslocazione 28-31. In un esperimento cicloesimide chase, cycloheximide viene aggiunta alle cellule, e aliquote di cellule vengono raccolti immediatamente e in punti temporali specifici seguenti aggiunta del composto 22. Le cellule sono lisate, e l'abbondanza di proteine ​​in ogni punto viene analizzato, in genere western blot. Diminuisce in abbondanza di proteine ​​dopo l'aggiunta di cycloheximide può essere tranquillamente attribuita alla degradazione delle proteine. Una proteina instabile diminuirà in abbondanza nel tempo, mentre una proteina relativamente stabile esporrà piccolo cambiamento in abbondanza.

Meccanismi di degradazione delle proteine ​​selettivo sono state altamente conservata in tutta Eukarya. Molto di ciò che si conosce la degradazione delle proteine ​​primo è stato appreso inil modello eucariote unicellulare, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito) 25,32-36. Studi con il lievito sono suscettibili di continuare a fornire spunti nuovi ed importanti nella degradazione delle proteine. Un metodo per cicloesimide inseguimento in cellule di lievito seguita da Western blot di abbondanza di proteine ​​è presentato qui.

Protocollo

1. La crescita e Harvest delle cellule di lievito

  1. Se non analizzando la cinetica di degradazione di una proteina endogena lievito, trasformare ceppo di lievito desiderato (s) con un plasmide codificante la proteina di interesse. Metodi affidabili per il lievito di trasformazione sono stati precedentemente descritti 37.
  2. Seminare lievito in 5 ml di terreno appropriato (ad esempio, definito (SD) mezzo sintetico selettivo per manutenzione plasmide di cellule trasformate o) medium lievito non selettivo extract-peptone-destrosio (YPD per le cellule non trasformate). Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
    NOTA: 30 ° C è la temperatura di crescita ottimale per tipica wild-type ceppi di laboratorio di lievito 38. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di lievito mutanti non crescono in modo ottimale a 30 ° C e alcune proteine ​​subiscono degradazione dipendente dalla temperatura, le temperature utilizzate per la crescita cellulare del lievito e cicloesimide chase dovrebbero essere determinati empiricamente 39.
  3. misurare °densità ottica e a 600 nm (OD 600) di ogni cultura durante la notte.
    NOTA: Le cellule possono essere in fase di crescita logaritmica o stazionaria ma avrebbe minimamente raggiunto una densità che permetterà di diluizione ad una OD 600 = 0.2 in 15 ml di mezzo fresco.
  4. Diluire le culture durante la notte per un valore di 600 OD di 0,2 a 15 ml di terreno fresco.
  5. Incubare lievito a 30 ° C, agitando fino a quando le cellule raggiungono fase di crescita medio logaritmica (cioè, un OD 600 tra 0,8 e 1,2).
  6. Durante la crescita delle cellule di lievito, eseguire le seguenti in preparazione per la procedura cicloesimide chase:
    1. Impostare un blocco di calore che può ospitare 15 ml provette coniche da 30 ° C per l'incubazione delle cellule in presenza di cicloesimide. Aggiungere l'acqua ai pozzi del blocco di calore per consentire la distribuzione di calore efficiente alle culture. Aggiungere acqua a ciascun pozzetto tale che un tubo da 15 ml causerà il livello dell'acqua a salire a, ma non troppo pieno, il bordo del pozzo.
    2. Impostare un secondo blocco di calore che può ospitare provette da 1,5 ml microcentrifuga a 95 ° C per la denaturazione proteica seguenti lisi cellulare.
    3. medio Pre-caldo crescita fresco (1,1 ml per punto di tempo per la cultura per essere analizzati) a 30 ° C.
    4. Aggiungere 50 ml 20x stop Mix di pre-etichettati microprovette (un tubo per volta punto per ogni cultura deve essere analizzato). Mettere i tubi in ghiaccio.
      ATTENZIONE: sodio azide, un ingrediente in 20x arresto Mix, è tossico tramite ingestione o contatto dermico. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e sodio azide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
  7. Quando le cellule hanno raggiunto una crescita mid-logaritmica, raccogliere 2,5 OD 600 unità di ogni cultura per ogni punto di tempo per essere analizzato (ad esempio, 7,5 OD 600 unità per analizzare l'abbondanza di proteine ​​a tre punti di tempo). Centrifuga raccolte le cellule in 15 ml provette coniche a 3,000 xg a temperatura ambiente per 2 min.
    NOTA: Un OD 600 unità è uguale alla quantità di lievito presente in 1 coltura ml ad una OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere X OD 600 unità (V) può essere determinato utilizzando la seguente equazione: V = X OD 600 unità / OD 600 misurato. Ad esempio, per raccogliere 7,5 OD 600 unità di coltura cellulare di lievito ad una OD 600 di 1,0, raccogliere 7,5 OD 600 unità / 1,0 = 7,5 ml coltura di lievito.
  8. Risospendere ogni pellet di cellule in 1 ml di 30 ° C (pre-riscaldato) mezzo di crescita fresco per 2,5 OD 600 unità di cellule (ad esempio, 3 ml per 7,5 OD 600 unità).

2. Cycloheximide Chase

  1. Equilibrare sospensioni cellulari di lievito mediante incubazione per 5 minuti nel blocco C di calore 30 °.
  2. Preparare un timer a contare da 0:00.
  3. Per iniziare l'inseguimento cicloesimide, premere il tasto "Start" sul timer. rapidamente,ma attenzione, effettuare le seguenti operazioni:
    1. Aggiungere cicloesimide ad una concentrazione finale di 250 mg / ml di sospensione cellulare prima di lievito (ad esempio, aggiungere 37,5 ml di 20 mg / ml di cicloeximide a 3 ml di sospensione cellulare), e vortex brevemente per miscelare.
      ATTENZIONE: Cicloeximide è un irritante cutaneo ed è tossico tramite l'ingestione orale. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e cicloesimide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
    2. Immediatamente dopo l'aggiunta di cicloesimide e vortex, trasferire 950 ul (~ 2,4 OD 600 unità) della sospensione di cellule di lievito con cicloesimide aggiunto ad una provetta di pre-etichettati contenente 50 ml mix 20x fermata ghiacciata. Agitare la provetta, e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti.
    3. Riportare la sospensione cellulare di lievito a 30 ° C.
  4. Ripetere passaggi 2.3.1 attraverso 2.3.3 Per ciascuno dei restanti sospensioni cellulari di lievito a intervalli di tempo regolari (ad esempio, ogni 30 secondi, in modo tale che viene aggiunto al campione cycloheximide 1 # alle 0:00, Esempio # 2 alle 0:30, Esempio # 3 a 1:00 , ecc.).
  5. Ad ogni punto di tempo successivo, le sospensioni vortice di cellule di lievito e il trasferimento di 950 ml per provette da microcentrifuga etichettati contenenti 50 ml di pre-raffreddata 20x stop Mix. Vortex e cellule di posizione raccolti su ghiaccio. Rientro 15 ml provette coniche a 30 ° C blocco di calore.
    1. Ad esempio, per la raccolta di cellule 30 min dopo l'aggiunta cicloesimide (supponendo 30-sec intervalli tra oltre cicloesimide per sospensioni di cellule di lievito all'inizio del corso tempo), vortex e rimuovere 950 ml di sospensione cellulare da Esempio # 1 a 30:00 . Ripetere per esempio # 2 a 30:30, e così via.
      NOTA: per impedire sedimentazione di lievito, sospensioni cellulari vortice in 15 ml provette coniche circa ogni 5 min durante tutto il corso della caccia. In alternativa, la sospensione cellula di lievitos può essere mantenuta in un bagno di acqua di continuo agitazione per tutta la durata dell'esperimento cicloesimide caccia.
  6. Quando tutti i campioni sono stati raccolti, pellet raccolte le cellule per centrifugazione a 6.500 xg a temperatura ambiente per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. Le cellule sono ora pronti per lisi alcalina. In alternativa, le cellule pellet in azoto liquido e conservare freeze scatto a -80 ° C.

3. Post-alcalina Protein Extraction (Modificata da 16,40)

  1. Aggiungere 100 ml di acqua distillata a ciascun pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex.
  2. Aggiungere 100 pl di 0,2 M NaOH per ogni campione. Mescolare pipettando su e giù o vortex.
  3. Incubare le cellule in sospensione a temperatura ambiente per 5 min. In questa fase, le cellule di lievito non sono state lisate, e proteine ​​non sono stati rilasciati 40.
  4. Cellule pellet per centrifugazione a 18.000 xg a carattere localeature per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
  5. Per lisare cellule, aggiungere 100 ml di tampone campione Laemmli a ciascuna pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex.
    NOTA: l'incubazione sequenziale delle cellule con il tampone rilascia NaOH e Laemmli proteine ​​in una forma compatibile con dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone di corsa Tris-glicina.
  6. Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente.
    NOTA: incubazione a 95 ° C può non essere adatto per l'analisi di proteine ​​che sono inclini a aggregazione (ad esempio, proteine ​​con diversi segmenti transmembrana). Queste proteine ​​possono diventare insolubile quando incubate a temperature elevate 41. Così, per l'analisi di tali proteine, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio, 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 minuti, come determinato empiricamente.
  7. lisati centrifugare a 18.000 xga rotemperatura om per 1 min per far sedimentare il materiale insolubile. Il supernatante (proteina estratta solubilizzati) è pronto per separazione mediante SDS-PAGE e successiva analisi western blot. In alternativa, conservare lisati a -20 ° C.

4. Rappresentante SDS-PAGE e Western Blotting procedura (Adattato da 16)

  1. Carico proteine ​​standard di peso molecolare e determinato empiricamente volume di lisati su un gel SDS-PAGE.
    NOTA: Scegliere la percentuale di acrilamide e bis-acrilammide nel gel SDS-PAGE in base al peso molecolare della proteina di interesse. In generale, più bassi gel percentuali sono più adatti per risolvere superiori proteine ​​peso molecolare.
  2. Eseguire gel a 200 V fino a quando il fronte del colorante ha raggiunto il bordo inferiore del gel.
  3. Trasferire proteine ​​dal gel di fluoruro di polivinilidene membrana (PVDF) mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C.
  4. Bloccare membrana incubando in Tris-Buffered Saline (TBS) contenente 5% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C durante la notte.
    NOTA: per evitare la crescita microbica in presenza di una membrana incubate durante la notte, si raccomanda di includere azide di sodio nella soluzione di blocco ad una concentrazione finale di 0,02%.
  5. Incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) e 1% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  7. Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
    NOTA: Fluorofori sono sensibili alla luce. Pertanto, diluizioni di anticorpi coniugati a fluorofori devono essere preparati al buio, e l'incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati a fluorofori e successive fasi di lavaggio dovrebbe avvenire a tenuta di luce (ad esempio, un foglio-avvolto) containers.
  8. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  9. membrana delle immagini con LI-COR Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), seguendo le raccomandazioni del produttore.
  10. Dopo immagine membrana acquisizione, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per una proteina di controllo di carico in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
  11. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  12. Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
  13. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  14. Immagine membrana come al punto 4.9.

Risultati

Per illustrare la metodologia caccia cicloesimide, la stabilità del Deg1 -Sec62 (figura 1), un substrato modello di lievito reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD), è stato analizzato 42-44. In ERAD, il controllo di qualità enzimi ubiquitina ligasi covalente attribuiscono catene del piccolo ubiquitina proteine ​​di proteine ​​aberranti localizzate alla membrana ER. Tali proteine ​​polyubiquitylated vengono successi...

Discussione

In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine ​​è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine ​​degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino ...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubesFisher Scientific14-961-32Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)New BrunswickM1053-0450A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004For use with tube roller
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropyleneSarstedt62.554.205Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubesEppendorf22364120Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath HeatersFisher Scientific1172011AQIt is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubesFisher Scientific11-473-70For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubesFisher Scientific11-718-9QFor use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membraneWill vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)Li-Cor9140-01Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Will vary by lab and application

Riferimenti

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