Mucine Agarose Gel Electrophoresis: Western Blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire,

Résumé

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Résumé

Mucines, les protéines fortement glycosylées qui tapissent la surface des muqueuses, ont évolué comme un élément clé de la défense innée en protégeant l'épithélium contre les agents pathogènes envahisseurs. Le rôle principal de ces macromolécules est de faciliter le piégeage des particules et de dégagement, tout en favorisant la lubrification de la muqueuse. Au cours de la synthèse des protéines subissent une intense mucines O-glycosylation et multimérisation, ce qui augmente considérablement la masse et la taille de ces molécules. Ces modifications post-traductionnelles sont critiques pour les propriétés viscoélastiques du mucus. En raison de la nature biochimique et biophysique complexe de ces molécules, en travaillant avec des mucines fournit de nombreux problèmes qui ne peuvent pas être résolus par des méthodes d'analyse des protéines classiques. Par exemple, leur haut poids moléculaire empêche la migration électrophorétique par des gels de Polyacrylamide réguliers et leur nature collante provoque l'adhérence à un tube expérimental. Cependant, étudier le rôle des mucines dans la santé(Par exemple., Le maintien de l' intégrité des muqueuses) et de la maladie (par exemple., Hyperconcentration, mucostase, cancer) a récemment suscité un intérêt et mucines sont à l'étude comme cible thérapeutique. Une meilleure compréhension de la production et la fonction des macromolécules mucine peut conduire à de nouvelles approches pharmaceutiques, par exemple, les inhibiteurs de la mucine exocytose de granules et / ou agents mucolytiques. Par conséquent, des protocoles cohérents et fiables pour étudier la biologie mucine sont essentiels pour le progrès scientifique. Ici, nous décrivons des méthodes classiques pour séparer les macromolécules de mucine par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose, transfert des protéines dans une membrane de nitrocellulose, et à détecter le signal avec des anticorps spécifiques de la mucine, ainsi que l'infrarouge lecteur de gel de fluorescence. Ces techniques sont largement applicables pour déterminer la mucine quantification, multimérisation et de tester les effets des composés pharmacologiques sur mucines.

Introduction

Les mucines sont normalement produites par des surfaces muqueuses qui tapissent les cavités exposées à l'environnement extérieur (par exemple., Respiratoires, digestifs, les secteurs de la reproduction, la surface oculaire), ainsi que les organes internes (par exemple, le pancréas, la vésicule biliaire, les glandes mammaires). La présence de ces glycoprotéines maintient l'hydratation de la surface et forme une barrière physique contre les agents pathogènes. Bien que la production de mucine est essentielle à la santé des muqueuses, mucine hyperconcentration et / ou des propriétés de mucus aberrantes peut conduire à obstruction du canal, la colonisation bactérienne et l'inflammation chronique, qui peut causer des lésions irréversibles des tissus. Une cascade d'événements semblables sont observés dans plusieurs maladies, par exemple., La fibrose kystique ^1, otite moyenne chronique ² et l' infection cervico ^3. Par conséquent, il est important de comprendre le rôle des mucines dans la santé et la maladie, et d'établir des protocoles de routine pour l'identification des protéines.

À ce jour, 19 mucines gènes ont été identifiés et codent pour de grandes chaînes de polypeptides allant de 1200 (par exemple., MUC1) à 22.000 (par exemple, MUC16) acides aminés. La famille des gènes de mucine peut être divisé en deux sous-types: les mucines associées à la membrane, impliqué dans la signalisation cellulaire et la surface de blindage, et les mucines formant un gel, responsable des propriétés viscoélastiques du gel de mucus. mucines associées à la membrane sont essentiellement monomère et se fixent sur les surfaces cellulaires par l'intermédiaire d'un domaine transmembranaire hydrophobe. En revanche, les mucines formant des gels possèdent plusieurs facteur Willebrand (FvW) -comme et riches en cysteine ​​des domaines qui sont essentiels pour la formation de réseaux polymères dynamiques. Grandes glycanes sont attachés à la sérine et thréonine répartis dans la apomucine. Ces oligosaccharides O-liés denses peuvent contribuer jusqu'à 80% du poids moléculaire ^4. Intra- et inter-moléculaires des liaisons disulfure reliant les monomères mucine assurent l'intégrité du networ de gel de mucinek. À la suite de glycosylation lourd et multimérisation, mucines sont parmi les plus grandes molécules dans le monde animal et ne peuvent pas être analysés par électrophorèse sur gel standard en utilisant un gel SDS-PAGE polyacrylamide classique et échelles de protéines standard. Ces méthodes résolvent / protéines séparées avec des poids moléculaires inférieurs à 250 kDa tandis que les monomères mucine peuvent atteindre jusqu'à 2 MDa dans le cas de MUC16. Cependant, à haute masse moléculaire échelles de protéines peuvent être utilisées pour étudier les petits monomères mucine (ie., MUC1).

Diverses techniques peuvent être appliquées pour étudier la taille de la mucine, la conformation et de l'interaction. Traditionnellement, la caractérisation biochimique des mucines est réalisée par isolement mucine par l' intermédiaire isopycnique en gradient de densité centrifugation dans un tampon dénaturant, suivie d' une Chromatographie d'exclusion de taille et immunodétection (par ex., Un slot blot) ^5. Dynamique et / ou la diffusion de lumière multi-angle fournir des informations sur l'état oligomérique d'échantillons de mucine riche ^{1. En outre, les taux zonal centrifugation couplé à l' immunodétection et la microscopie électronique à transmission sont communément utilisés pour déterminer la conformation macromoléculaire de mucines 6. La spectrométrie de masse est également utilisée pour quantifier les mucines, détecter le clivage protéolytique et d' analyser la composition oligosaccharide 1,7,8. De telles techniques sont coûteuses, prennent du temps et exigent souvent de grands volumes et / ou des concentrations élevées d'échantillon. La méthodologie décrite ici, à savoir., Mucine séparation par électrophorèse, reproductible, peu coûteuse et peut être utilisée dans les études à haut débit pour fournir mucine par rapport quantification et d' étudier l' assemblage du polymère. Cependant, ce test nécessite de haute affinité, de haute spécificité des anticorps de mucine qui peuvent ne pas être disponibles pour les mucines rares (par exemple., MUC19) ou certaines espèces (par exemple., Porc, furet).}

Agarose Western blot est adapté pour résoudre une grande variété d'échantillons de mucine riche avec concentrations allant de 50 pg / ml (par ex., des lavages cellulaires) à 5 mg / ml (par ex., du crachat). Cet essai a été introduit dans les années 1990 et n'a été réalisée dans quelques laboratoires spécialisés ^9,10. Dans un premier temps , cette technique a permis d' identifier des sous - populations de monomères de mucine dans les sécrétions respiratoires humaines ^11,12 et a confirmé le procédé d'oligomérisation dans des cellules caliciformes, qui comprend la formation du dimère dans le réticulum endoplasmique suivie dimère multimérisation dans l'appareil de Golgi ^13. Plus récemment, la production d'anticorps polyclonaux contre mucines murins facilité des études sur des petits modèles animaux (par exemple., Mucine modèles de souris déficientes, βENaC, OVA contestées) et a ouvert un nouveau champ de recherche pour les études précliniques composés d'essais pharmacologiques visant à éliminer le mucus les poumons ^14-17. En raison de l'intérêt croissant pour la mucine biologie et la génération de nouveaux anticorps de mucine plus spécifiques, nous décrivons herein la méthode pour séparer les mucines par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sous vide à la nitrocellulose et à deux couleurs de détection de fluorescence infrarouge.

Protocole

1. Préparer Tampons pour Gel mucine Western blot

1. Préparer 1 litre de 50x TAE (Tris-acétate-EDTA) tampon.
   1. Dans 700 ml d'eau distillée (dH ₂ O) , ajouter 242 g de base Tris (0,4 M), 57,1 g d'acide acétique glacial (peser liquide) (0,2 M) et 14,61 g d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (50 mM).
   2. Ajuster le pH à 8,0 et rendre le volume jusqu'à 1 litre avec dH ₂ O.
2. Préparer 10 ml de 10 x tampon de charge.
   1. Préparer 5 ml de tampon TAE 1X. Pour ce faire, ajouter 5 ml de glycérol (50%), 25 mg de bleu de bromophénol (0,25%) et 100 mg de dodécylsulfate de sodium (SDS) (1%).
3. Préparez 2 litres de 20x sodium salin citrate (SSC) tampon.
   1. Dans 1,5 litres de dH ₂ O, ajouter 350,6 g de NaCl (3 M) et 176,4 g de citrate trisodique (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Ajuster le pH à 7,0 et porter le volume à 2 litres avec dH ₂ O.
4. Préparer 1 litre de tampon 1x TAE-SDS à 0,1%.
   1. Ajouter 20 ml de 50x TAE à 980 ml ​​de dH ₂ O. Ajouter 1 g de SDS pour faire une solution SDS-TAE 0,1%.

2. TAE-SDS Agarose Gel Préparation

1. (. -À- dire, 150 ml) verser un volume suffisant de tampon SDS 0,1% TAE 1x dans un erlenmeyer micro - ondes pour faire un 5 - Gel de 7 mm d'épaisseur. Ajouter 0,8% (1,2 g) de poudre d'agarose.
2. flacon à micro-ondes dans intervalles de 30 s avec tourbillonnant intermittente jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous (généralement 1 - 3 min). Utiliser des tampons à main chaude pendant ce processus. Faites attention à ébullition éruptive tout en faisant tourbillonner.
3. Laisser la solution d'agarose refroidir pendant 5 - 10 min. Remarque: La solution d'agarose sera prête à être versée lorsque le fond du flacon peut être laissé sur la paume pendant 5 sec.
4. Préparer plateau de coulée d'électrophorèse (10 x 15 cm) en scellant les bords avec du ruban adhésif et en plaçant bien peigne en position.
5. Verser la solution d'agarose lentement dans til plateau de coulée pour éviter la formation de bulles. Retirer les bulles à l'aide d'une pointe de pipette. Attendez que le gel pour refroidir et complètement solidifier. Une fois solidifié, enlever le peigne lentement pour éviter l'effondrement des puits par aspiration et enlever le ruban à partir des bords du plateau.
6. Placez un gel d'agarose dans la boîte de gel et de remplir l'unité d'électrophorèse avec un tampon 1x TAE-SDS à 0,1% jusqu'à ce que le gel est entièrement couvert.

3. L'échantillon en cours de chargement et Électrophorèse Séparation

Remarque: Dans notre laboratoire, nous utilisons couramment des échantillons provenant de la souris et les humains, y compris fluide bronchoalvéolaire de lavage (LLBA; les deux espèces), les lavages cellulaires à partir de cellules humaines épithéliales bronchiques (HBE), et des échantillons de salive et les expectorations humaines. Les échantillons peuvent être dénaturés dans 6 M d'urée lors de la collecte ou stockées pendant de courtes périodes de temps (6 heures) en ajoutant un inhibiteur protéinase de cocktail.

1. Préparer des échantillons pour le chargement en ajoutant 10% de colorant de charge à chaque échantillon (ie., 30 pl d'échantillon et 3pi de colorant). Homogénéiser les échantillons par pipetage vers le haut et vers le bas. Brièvement centrifuger les tubes à 5000 rpm pour recueillir des gouttelettes.
2. charger soigneusement volume égal d'échantillons dans les puits.
   1. des conseils et / ou utiliser des pipettes volumétriques pour faciliter le chargement d'échantillons très visqueux pré-humides. Lentement aspirée 80 - 90% de la solution échantillon de colorant (ie, 27 - 30 pi) afin d' éviter les bulles de pipetage.
   2. charger lentement au fond des puits et se déplacer progressivement la pointe de la pipette vers le haut. Pour les échantillons qui restent attachés à la pointe de la pipette, passer à un angle de 45 ° et allongé droit au-dessus du puits ou doucement utiliser le côté du puits à briser le mucus filandreux. Ne pas surcharger les puits.
3. Raccorder les électrodes dans la zone de gel pour le générateur d'énergie d'électrophorèse. Vérifiez que les électrodes sont connectées correctement (ie., Le fil rouge branché à la sortie positive du générateur) pour permettre chargé négativement mucines à courir vers le positif électrode.
4. Exécutez le gel à 80 volts pendant 90 min pour un gel de peigne unique, ou 60-75 min pour un gel double peigne pour éviter le chevauchement entre les deux rangées.
5. Mettez le générateur hors tension et débranchez les électrodes de la source d'alimentation.
6. Retirez délicatement le gel de la boîte de gel avec une main de chaque côté du plateau de coulée pour assurer le gel reste en place.

4. Réduire Agarose Gel efficace Transfert mucine

1. Placez délicatement le plat de gel dans un récipient en verre. Rincer le gel avec dH ₂ O pour éliminer les traces de tampon TAE-SDS.
2. Préparer 1 litre de tampon SSC 4x par addition de 200 ml de SSC 20X dans 800 ml d'dH ₂ O. Faire 200 ml de dithiothréitol 10 mM (DTT) solution 4x SSC en ajoutant 309 mg de frais DTT dans 200 ml de tampon SSC 4x.
3. Faire tremper le gel avec un tampon TNT-4x SSC et le couvercle. Agitez doucement pendant 20 min (10 rotations par minute). Rincer le gel avec du tampon TNT sans 4x SSC.

"> 5. Aspirer Assemblée buvard et le transfert de l'échantillon à une membrane de nitrocellulose

1. Préparer buvard à vide pour le transfert.
   1. Découpez soigneusement membrane de nitrocellulose à des dimensions légèrement plus larges que le gel (ie., 10 x 15 cm).
   2. Mat poreux humide avec dH ₂ O et placez - le lisse côté-up dans le buvard.
   3. membrane de nitrocellulose humide avec un tampon de SSC 4x TNT gratuite et le placer au centre du tapis poreux.
   4. Recouvrir le mat poreux avec le joint en caoutchouc, en laissant l'ouverture du joint d'étanchéité précisément alignée avec la membrane de nitrocellulose. Si mat poreux est encore visible, ajuster soigneusement la membrane pour assurer ne reste aucun espace entre le joint et la membrane.
2. Placez délicatement le gel d'agarose sur le dessus de la membrane. Veiller à ce gel se forme un joint étanche avec le joint et les puits du gel sont positionnés sur la membrane pour le transfert.
   1. Éviter la formation de bulles entre la membrane et le gel. Pour réduire au minimum leformation de bulles, gicler quelques gouttes de 4x SSC tampon sur la membrane et faites glisser le gel de haut en bas pour vider toutes les bulles formées. Évitez de déplacer le gel sur la membrane sous forme de protéines vont commencer à effacer immédiatement.
3. couvrir délicatement le gel avec un tampon 4x SSC.
4. Commencez le transfert mucine par aspiration.
   1. Mettez buvard ON sous vide et la pression fixée à 40 - 50 mBar. Ajouter quelques gouttes de tampon 4x SSC sur le gel tous les 5 - 10 min pour empêcher le gel de se dessécher. transfert d'exécution pendant 90 min. Facultatif: Une fois terminé, marquer les puits avec un crayon pour l'orientation.
5. Éliminer le gel et récupérer membrane de nitrocellulose en utilisant des pinces en plastique sur le bord de la membrane.

6. Membrane Blocage et détection

1. Rincer la membrane avec du sérum physiologique immédiatement 1x tamponnée au phosphate (PBS). Ne pas laisser la membrane sécher.
2. Immerger la membrane dans 50 ml de 3% de lait-PBS tampon de blocage et déposer sur une rocker à la température ambiante pendant 1 h. Après incubation, jeter le tampon de blocage.
3. Immerger la membrane dans du lait-PBS à la solution d'anticorps primaire à 1%. Incuber la membrane dans la solution d'anticorps primaire pendant une nuit sur un agitateur à 4 ° C. Après incubation, jeter la solution d'anticorps primaire. Diluer les anticorps primaires à un rapport 1: 2000 d'une solution d'anticorps à un tampon de blocage. Remarque: Pour les échantillons provenant de souris, nous utilisons UNC 222 de lapin anti-MUC5B et de chèvre anti-protéine fluorescente verte (GFP). Pour les échantillons provenant de l'homme, nous utilisons des anticorps primaires H300 anti-MUC5B et 45M1 anti-MUC5AC.
4. membrane Laver 3 fois avec du PBS pendant 10 minutes sur une bascule.
5. Immerger la membrane dans du lait-PBS à la solution d'anticorps secondaire de 1%. Diluer les anticorps secondaires à un rapport 1: 7500 d' une solution d'anticorps à un tampon de blocage et on incube à température ambiante pendant 1 heure sur une bascule (par exemple, 700 anti-lapin et anti-chèvre 680.). Protéger de la lumière par incubation dans une co non-transparentntainer. Jeter la solution secondaire d'anticorps après 1 h.
6. membrane Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min. Rincer la membrane avec dH ₂ O pour éliminer le sel.
7. Lire la membrane sur un système de fluorescence infrarouge selon les instructions du fabricant.

Résultats

Nous montrons des résultats représentatifs de l' expression de la mucine après électrophorèse sur gel d' agarose dans BALF des poumons de souris (Figure 1). Dans cet exemple, nous avons utilisé le gel d'agarose pour montrer la régulation positive de la production de mucine suivant l'IL-13 le traitement du modèle de la souris Tg-MUC5AC. Le Western Blot montre une représentation visuelle de l' expression de la mucine, qui peut être utilisé po...

Discussion

Le protocole de mucine par Western Blot décrit dans cette vidéo combine les techniques classiques utilisées en biologie moléculaire pour séparer et transférer des macromolécules telles que l' ADN, par des techniques normales pour la détection des protéines, à savoir., Immunotransfert. La même technique peut être appliquée pour étudier la biologie des glycosaminoglycanes complexes, telles que la dégradation de l' acide hyaluronique de haut poids moléculaire ^18. Bien que cette t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50g
20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1L
NaCl	Fisher	S271-1	1kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500mL
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200ug
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100ug
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences