Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

Resumen

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Resumen

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

Introducción

Autoantibodies are present in many disease states and can often have direct pathogenic activity¹. Identification of autoantibodies is important for diagnosis of certain diseases, for prognosis of disease outcome, and for the classification of patients who may benefit from specific therapies². Autoantibodies are typically identified in patient serum using the ELISA technique; however, screening for multiple antigens with this technique is laborious and consumes a large quantity of patient sample. New technologies are therefore needed to profile autoantibodies on a larger scale.

The antigen microarray technique is a proteomic technology that allows autoantibodies to be profiled in a multiplex fashion³. In the first step of this process, an antigen library is arrayed onto a slide surface using a robotic microarrayer. The slides are probed with diluted serum and then fluorescent-labeled secondary antibodies are added. Antibody reactivities are visualized by scanning the slides with a microarray scanner and quantified by fluorescent intensities. Antigen microarrays offer multiple advantages over the ELISA technique in screening for autoantibodies: 1) they require only microliters of serum to profile autoantibodies to multiple antigens simultaneously, 2) they use antigen sparingly, as only nanoliters of antigen are spotted onto the arrays, 3) they have enhanced sensitivity³ compared to ELISA and 4) they allow for the simultaneous yet, separate detection of more than one antibody isotype. Antigen microarrays have been used to profile autoantibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus^4-6. In all three of these diseases, new insight into disease pathogenesis was obtained from profiling autoantibodies on a large scale with the arrays.

Here we describe a protocol to generate antigen microarrays using nitrocellulose-coated slides. A variety of antigens including proteins, peptides, and cell lysates can be arrayed onto the slides using this technique. The arrays can be easily customized by including antigens of interest in the source plate that holds the antigen library. In addition, we show how a pair of secondary antibodies can be used to separate IgG and IgM reactivities on the same slide surface. We have now optimized this technique to measure autoantibodies in both humans and mice.

Protocolo

1. La dilución de antígenos y la generación de antígeno Microarrays

1. Diluir antígenos en PBS a una concentración final de 0,2 mg / ml. Imprimir hasta 162 antígenos únicos en duplicado con una configuración microarrayer con 9 pines. Incluyen antígenos de IgG e IgM en la biblioteca de antígeno como controles positivos. Incluir PBS únicamente como un control negativo.
2. Añadir 20 l de cada antígeno a la placa de fuente de 384 pocillos. Añadir antígenos a la placa de fuente en grupos que reflejan la configuración del cabezal de impresión (por ejemplo, organizar antígenos en grupos de 9 cuando se utilizan para la impresión de 9 pines).
3. placa de fuente de la cubierta con papel aluminio y congelar a -80 ° C hasta que esté listo para imprimir matrices.
4. Limpiar pasadores microarrayer sólidos mediante su incubación en un baño de sonicación con agua desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pines en rejilla para que se seque y luego ordenar alfileres en la cabeza de impresión de microarrays. Por 9 pines, utilice una configuración de 3 x 3.
5. microarrayer programa para ejecutar la impresión mediante el establecimiento de botones número de cabezal de impresión,número de diapositivas para imprimir, el número de pastillas en cada diapositiva, y el número de manchas idénticas para cada antígeno. Por lo general, el uso de 9 pines, 70 toboganes, 2 almohadillas / deslizante, y 2 puntos idénticas para cada antígeno. microarrayer programa para sonicar pasadores en el agua entre los diferentes grupos de antígenos.
6. placa de fuente de deshielo y la placa después centrifugar durante 1 min a 100 x g. Coloque la placa de origen en lugar designado en microarrayer. Retire la sección de papel de aluminio que cubre el primer grupo de antígenos para ser impreso.
7. Organizar las diapositivas impresas en la superficie arrayer y ejecución del programa de impresión. Imprimir diapositivas a temperatura ambiente con humedad establecido en el arrayer al 55 - 60% con la estructura en humidificador de la máquina matriz.
8. Después de cada grupo de antígenos se imprime en todas las diapositivas, hacer una pausa en la microarrayer. Cubrir los antígenos que se acaban de imprimir con papel de aluminio (para evitar la evaporación) y descubrir el siguiente grupo de antígenos que se desea imprimir. Continuar programa de impresión.
9. Después de que se impriman todas antígenos, fuente cubierta de plcomió con el nuevo trozo de papel de aluminio y se congelan a -80 ° C. Coloque las diapositivas impresas en la caja portaobjetos y sellado al vacío. Las diapositivas se puede usar al día siguiente o hasta un mes después.

2. Sondeo de antígeno diluido con micromatrices Sera

1. Colocar los portaobjetos en tramas utilizando cámaras de incubación. Añadir 700 l de tampón de bloqueo (2,5% [vol / vol] de suero de ternera fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 en PBS) a cada superficie de la matriz.
2. Coloque película adhesiva sobre el marco y colocar en un recipiente sellado con un trozo de tejido húmedo. Incubar O / N a 4 ° C en un agitador.
3. Diluir las muestras de suero 1: 100 en tampón de bloqueo. Aspirar la solución de bloqueo de las matrices y añadir 500 l de muestra diluida a cada superficie de la matriz.
4. Cubrir con film adhesivo y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con agitación.
5. Diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo. Para los estudios en humanos, se diluye un anticuerpo de cabra IgG Cy3 anti-humana marcada a 0,33 g / ml y un Cy5 etiquetados de cabra anti-human anticuerpo IgM a 0,25 g / ml. Para los estudios del ratón, diluir una Cy3 marcado anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón a 0,38 g / ml y un anticuerpo marcado con Cy5 anti-IgM de ratón de cabra a 0,7 g / ml.
6. muestras de aspirado de matrices y enjuagar las superficies de matriz 4 veces con tampón de lavado (0,1% Tween 20 en PBS). Vierta en tampón de diapositivas y con un tirón rápidamente.
7. Añadir 700 l de tampón de bloqueo para lavar cada superficie de la matriz e incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Repita el paso de lavado dos veces más.
8. Añadir 500 l de anticuerpo secundario diluido a cada superficie de deslizamiento y cubrir con film adhesivo. Incubar 45 min a 4 ° C con agitación.
9. Aspirar mezcla secundaria de anticuerpos a partir de diapositivas y enjuague 4 veces más arriba. Lavar los portaobjetos 3 veces con 700 l de tampón de bloqueo / dilución que el anterior.
10. Retirar los portaobjetos de marcos y lugar en la parrilla corrediza de metal que se encuentra inmersa en PBS. Incubar 20 min a RT con agitación orbital. Colocar en nuevo contenedor de PBS y se incuba otros 20 mcon agitación.
11. rejilla deslizante depositarlo en un recipiente de agua desionizada 15 seg. Coloque la parrilla en un nuevo recipiente con agua y se incuba otros 15 seg.
12. Para secar los portaobjetos, coloque el estante deslizante en un adaptador de placa de ELISA en centrífuga y centrifugado a 220 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.
13. Colocar los portaobjetos en la caja hermética a la luz hasta que esté listo para escanear.

3. Escaneo antígeno Microarrays y exportación de datos

1. diapositivas de escaneo mediante un escáner de microarrays que puede detectar señales fluorescentes Cy3 y Cy5. Con el fin de ajustar los niveles de tubo fotomultiplicador (PMT) del scanner, pre-escanear una diapositiva que sólo se sondeó con anticuerpos secundarios.
   Nota: Esta diapositiva debe tener la biblioteca antígeno completo impreso en ella incluyendo positivo (IgG e IgM), así como controles negativos (PBS). El pre-scan es una exploración de baja resolución, que permite al usuario encontrar rápidamente a los ajustes óptimos PMT.
2. Establecer los valores de PMT para que las funciones humanas IgG (en el canal de Cy3) y el zumbidouna características IgM (en el canal Cy5) tienen una intensidad media de fluorescencia similares, menos de fondo (IMF-B) (típicamente 40.000). Los niveles de PMT se ajusta pulsando el botón de "hardware". Una vez establecido, mantener estos ajustes PMT constante.
3. Escanear las diapositivas experimentales en los dos canales pulsando el botón "Scan". Guardar las imágenes de diapositivas (ambos canales) después de cada escaneo.
4. Cargar la diapositiva a analizar en el software de microarrays utilizando el botón "archivo".
5. Cargar el archivo de lista de conjunto de genes (GAL) utilizando el botón "archivo". El archivo GAL tiene el diseño de la matriz con la identidad de las características de la matriz.
6. Colocar la plantilla de matriz sobre la imagen escaneada de manera que las matrices de características coinciden con la plantilla lo más estrechamente posible.
7. Alinear características en todos los bloques con la plantilla pulsando el botón "align". El programa general, encontrar el resumen de las características circulares pero algunos ajustes manuales, puede ser necesario. Estos ajustes se pueden hacer entrando al modo de función. El software calculará entonces un MFI-B para cada uno de los antígenos.
8. Utilice el botón "archivo" para exportar estos resultados como un archivo de texto.

4. Análisis de datos de matriz con el análisis de la importancia microarrays (SAM)

1. Cargar archivos de texto individuales en Excel e identificar las columnas que tienen MFI-B para los canales de Cy3 y Cy5.
2. Calcular la media de las funciones duplicadas.
3. Para cualquier negativa MFI-B, reemplace el número negativo con 10. Transformar los datos en bruto dividiendo MFI-B por 100 y después mediante el cálculo de logaritmo en base 2.
4. Analizar los datos transformados logarítmicamente con el análisis de la importancia microarrays (SAM) como se ha descrito previamente ^7.
5. Para un estudio con dos grupos (por ejemplo, controles sanos frente a pacientes), la etiqueta de un grupo "1" y el grupo "2." Utilice una de dos clases, el análisis no apareado en el SAM para identificar los antígenos que son reactividades significantly diferente entre los dos grupos (valor q <0,05).
6. Utilice el software de clustering y de generación de calor de ruta para hacer imágenes para su presentación ^8.

Resultados

Los antígenos están dispuestos en una placa de 384 pocillos y se imprimen en portaobjetos por un microarrayer robótico, como se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra las diapositivas colocados en un marco con cámaras de incubación y una diapositiva explorada después del procesamiento. La figura 3 muestra portaobjetos de control positivo y negativo. La corredera negativo solamente se sondea con anticuerpos secundarios, y el co...

Discusión

El protocolo descrito aquí permite la cuantificación de autoanticuerpos utilizando la técnica de microarray antígeno. microarrays de antígeno ofrecen varias ventajas sobre ELISA convencional en la detección de autoanticuerpos. En primer lugar, una variedad de antígenos, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, y los lisados ​​celulares se puede vestida sobre los portaobjetos de nitrocelulosa recubierto, lo que permite la detección de autoanticuerpos multiplexada. Además, sólo microgramos de ant...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG	Jackson Immuno	009-000-003	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG	Sigma-Aldrich	I5381	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM	Biolegend	401601	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D1626	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA	Sigma-Aldrich	D8899	dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	many types of arrayers are suitable
solid printing pins	Arrayit Corporation	SSP015
software for robotic microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST slides (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
FAST frame	GVS Northa America	10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 well plates	Whatman	7701-5101
plate sealers	VWR	60941-062
foil plate covers	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fetal calf serum	Invitrogen	12483020
Cy3 goat anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG	Jackson Immuno	115-165-071	use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM	Jackson Immuno	115-175-075	use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray statistical software	Stanford University	SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)