Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Zusammenfassung

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Zusammenfassung

Acid Pneumonitis ist eine Hauptursache für sterile akuten Lungenschädigung (ALI) beim Menschen. Säure Pneumonitis erstreckt sich über die klinische Spektrum von asymptomatischen zu akutem Atemnotsyndrom (ARDS), durch neutrophile Alveolitis gekennzeichnet, und die Schädigung sowohl Alveolarepithels und vaskuläre Endothel. Klinisch ARDS wird durch akute Hypoxie, bilaterale fleckige Lungeninfiltrate und nicht-kardiogene Lungenödeme definiert. Studien am Menschen haben uns mit wertvollen Informationen über die physiologischen und entzündlichen Veränderungen in der Lunge von ARDS verursacht, die zu verschiedenen Hypothesen über die Untergebener Mechanismen geführt hat. Leider haben Schwierigkeiten der Bestimmung der Ätiologie von ARDS, sowie eine breite Palette von Pathophysiologie in einem Mangel an kritischer Informationen geführt, die bei der Entwicklung von therapeutischen Strategien nützlich sein könnte.

Translational Tiermodelle sind wertvoll, wenn ihre Pathogenese und Pathophysiologie genau Reprodukea Konzept in sowohl in vitro als auch klinischen Umgebungen erwiesen. Obwohl Großtiermodellen (zB Schafe) Aktien Eigenschaften der Anatomie des menschlichen Trachea-Bronchialsystem, murine Modelle bieten eine Vielzahl weiterer Vorteile , darunter: niedrige Kosten; kurze Fortpflanzungszyklus Kreditvergabe selbst zu einer größeren Datenerfassung; ein gut verstanden immunologisches System; und ein gut charakterisiertes Genom führt zu der Verfügbarkeit einer Vielzahl von Gendeletion und transgenen Stämmen. Ein robustes Modell mit niedrigem pH-induzierten ARDS erfordert eine murine ALI, die vor allem die Alveolarepithels abzielt, in zweiter Linie das vaskuläre Endothel, sowie die kleinen Atemwege zu den Alveolen führt. Weiterhin ist eine reproduzierbare Verletzungen mit großen Unterschieden zwischen den verschiedenen schädlichen und nicht schädigenden Beleidigungen ist wichtig.

Die murine Magensäure Aspiration hier vorgestellte Modell mit Salzsäure verwendet einen offenen Tracheotomie und erschafft eine pathogene Szenario, das den niedrigen pH-Wert pneumon reproduziertitis Verletzungen beim Menschen. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden Wechselwirkung eines niedrigen pH - Beleidigung mit anderen Lungen schädigenden Einheiten zu untersuchen (zB Nahrungsmittelpartikel, pathogene Bakterien).

Einleitung

ARDS ist durch weit verbreitete Lungenentzündung gekennzeichnet und ist klinisch als akute Atemnot mit Hypoxämie gesehen. Diese Symptome treten oft weniger als 24 h nach einer Anstiftung Ereignis wie Trauma, Sepsis, Bluttransfusion bedingte Reaktionen oder Aspiration. Es ist gekennzeichnet histologisch durch neutrophile Alveolitis (dh weit verbreitete Entzündung) lokalisiert Alveolarepithels und vaskuläre Endothel führt zu Protein Leckage und anschließend hyaline Membranbildung. Aspiration als chemische Pneumonitis oder Aspirationspneumonie kategorisiert. ¹ Die saure Komponente des Magen - Aspiration trägt sowohl der Pneumonitis und Vorliebe eine sekundäre bakterielle Lungenentzündung zu entwickeln. Aspirationspneumonie ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für ALI und die anschließende Entwicklung von ARDS. ²

Magen-Aspiration ist eine akute Ereignis definiert als das Einatmen von Materialien von ter Magen mit oder ohne oropharyngeale Flora in die Atemwege über die Stimmbänder. Die absaugen Inhalte enthalten niedrigen pH Magen Flüssigkeit, Bakterien, Blut oder Speisereste. Magen-Aspiration tritt häufig bei Patienten in der Intensivstation (ICU), den typischerweise in einem nüchternen Zustand sind und somit auf einem Protonenpumpenhemmer platziert Aspiration von Mageninhalt angesäuerten zu begrenzen. Die Inzidenz von ALI auf der Intensivstation Bevölkerung in den USA ist von 2,5 bis 5-mal höher im Vergleich zu der allgemeinen Patientenpopulation. ³ Leider führen diese Prädisposition oft in einen Zustand der bakterielle Überwucherung im Magen , die zu schweren Folgeerkrankungen in der Lunge nach einer Aspiration Ereignis führen können, wie Magen - Aspiration ist ein unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung von sekundären bakteriellen Pneumonie (SBP) , ALI und ARDS.

Magen-Aspiration hat zwei Hauptkomponenten: Salzsäure und Mageninhalt, die Bakterien können oder nicht enthaltenoder Speiseteilchen. Im Nagetiermodell erzeugt die Säurekomponente allein von Magen-Aspiration eine anfängliche Entzündungsreaktion als Folge der direkten ätzende Verletzungen von niedrigem pH-Wert auf Luftwegsepithel. Dies wird durch eine neutrophile Infiltration gefolgt und eine Entzündungsreaktion bei 4 - 6 h. ⁴ Diese beiden Faktoren letztlich zur Zerstörung der pulmonalen mikrovaskulären Integrität führen somit zu Austritt von Flüssigkeit und Proteinen in Alveolen und Atemwege führen. Um diese Pathophysiologie verstehen und weitere mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen, ist es wichtig, ein Tiermodell zu entwickeln und zu charakterisieren, die die zugrunde liegenden Mechanismen erläutert. Eine saure absaugen allein muss voluminös oder mit einem ausreichend niedrigen pH-Wert sein, um die Pufferkapazität des Atmungs Baum zu umgehen und die Alveolen erreichen. Wenn dies nicht auftritt, nur eine vorübergehende oberen, leitenden airways Verletzung auftritt, die weniger wahrscheinlich an den schweren Folgen von ARDS zu führen. ^{5 <}/ Sup>

Um eine Aspirationsereignis genau mit verletzten Alveolarepithels emulieren, ist es wichtig, ein Tier die natürlichen Abwehrkräfte zu umgehen. Mit Hilfe eines Maus Aspiration Modell ein ALI zu erzeugen, die die Magensäure Verletzungen bei Menschen gesehen imitiert, muss man für die Unterschiede berücksichtigen in der Trachea-Bronchialsystem. Die offene Tracheostomie Technik, die dieses Verfahren verwendet, umgeht die Unterschiede zwischen den murinen und humanen respiratorischen Bäume und Modelle der Verletzung in einer Weise, die ALI sowohl physiologisch als auch histologisch reproduziert. Historisch wurde die intratracheale Intubation verwendet ALI zu erzeugen, aber es ist schwierig angesehen wird bei Mäusen ohne Larynx-Verletzungen durchzuführen. Daher bietet dieses Verfahren eine mögliche Alternative, die konsistente Ergebnisse über mehrere Forscher und mit minimalen Verfahren zurückzuführen Sterblichkeit geführt hat.

Protokoll

Alle Materialien und Geräte müssen gesammelt werden und ausreichend vor dem Verfahren organisiert. Das Verfahren ist von einem Schritt zum nächsten, um eine nahtlose Übergänge durchgeführt werden, konsistente, reproduzierbare Daten zu liefern. Dieses Protokoll folgt institutionelle Politik festgelegt von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Buffalo Veterans Affairs Medical Center.
HINWEIS: Sowohl männliche als auch weibliche C57BL / 6-Mäuse für dieses Protokoll verwendet wurden. Es gibt keinen signifikanten Unterschied von Albumin eine Leckage zwischen Geschlechtern.

1. Salzsäure Vorbereitung

1. Machen 56,2 mM HCl _sterile durch Zugabe von 281 ul 1 N HCl auf 4,72 ml steriler normaler Kochsalzlösung (SNS). Titrieren auf pH 1,25 mit 1 N HCl (≈ 0 - 50 & mgr; l).
2. Machen Sie diese Zubereitung frisch vor der Verletzung. Wie niedrigem pH-Wert SNS gepuffert ist es nicht die Beleidigung Salzsäure Verletzung sorgt für vergänglich ist.

2. Anästhesie und Trachea-Belichtungstechnik

HINWEIS:Stellen Sie sicher, dass die Verletzung Verfahren wird in einer Abzugshaube mit Holzkohle-Filterung für Anästhesiegas-Spülung durchgeführt. Wartung von sterilen Bedingungen ist wichtig, da dies ein Überleben Chirurgie. Verwenden Sie sterile Handschuhe und sterilisieren alle Instrumente in einer Glasperle chirurgisches Instrument Sterilisator vor an jedem Tier zu Chirurgie. Die Verwendung von Vorhängen die Operationsstelle zu isolieren, wird empfohlen, die Sterilität aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie Isofluran als Narkosegas, da es eine relativ niedrige Blutgas Löslichkeit ermöglicht eine schnelle Einleitung der Narkose der Verletzung folgt, sowie eine schnelle Wiederherstellung bietet.

1. Beginnen Sie mit der Anästhesie in einer Kammer mit 2,75% Isofluran in Sauerstoff mit Strömungsgeschwindigkeit von 2 l / min zu induzieren.
2. Sobald die Maus ausreichend (nicht mehr auf Zehen kneifen stark genug, um die Haut nicht zu brechen oder tiefe Gewebeschäden verursachen) anästhesiert wird, die Aussetzung der Maus durch den höheren Schneidezähne mit einer 15 cm Länge von 1-0 geflochtenen Seidennaht in Rückenlage auf einem 60 ^o Neigung Dissektion Bord.
3. Stellen Sie sicher, dass der Anästhesie wird während der Operation gewartet von Isofluran durch einen Nasenkegel liefern. Bewerben Veterinär Salbe auf Auge des Maus Trockenheit zu verhindern.
4. Shave den ventralen Teil des Halses mit einem elektrischen Trimmer und gelten topische antiseptische Lösung (dh PVP-Jod). Entfernen Sie überschüssiges Antiseptikum mit Gaze und trocknen lassen (~ 15 - 30 s).
5. Infiltrieren Sie die Mittellinie des Halses von der sternalen Kerbe unteren Teil des Kiefers mit 100 & mgr; l 0,5% Bupivacain (um prä-, peri- und postoperativen Analgesie).
6. Machen Sie eine 1-1,5 cm Längsmittelschnitt in den Hals mit einem Skalpell oder gebogenen feinen Schere. Dringen die Faszien-Membran zwischen den Speicheldrüsen durch stumpfe Dissektion mit zwei gekrümmten gezackten Zange in die Trachea zu belichten (durch die weißen Knorpelspangen identifiziert).
7. Immer noch die 2 Fächer einer Pinzette, einer Seite der paratracheal Muskulatur erfassen und ihn zur Seite zu ziehen, während zwischen dem Mus SezierenCLE Fasern in Längsrichtung neben der Trachea.
8. Sobald Dissektionsfläche etabliert, auch weiterhin die paratracheal Muskel Einfahren als das zweite Paar der Zange unter der Luftröhre gearbeitet wird. Verwenden Sie diese Zange 15 cm Strang von 1-0 geflochtenen Seidennaht platziert in die Spitze der Zange und ziehen durch die Naht hinter der Trachea zu platzieren.

3. intratracheale Instillation Verfahren

1. Bereiten Sie die Verletzungs Instillation Spritze durch eine 0,5-ml-Spritze mit einer 22 G-Nadel mit 0,2 ml Luft, gefolgt von 3,6 ml / kg Salzsäure befestigt füllt. Die Luft wirkt in Dispersion des Fahrzeugs zu unterstützen, sowie eine alveoläre Rekrutierungsmanöver für die Alveolen, die während der Anästhesie Verabreichung Atelektase laufen haben kann.
   HINWEIS: Beachten Sie die örtlichen IACUC Richtlinien in Bezug auf die postoperative Analgesie und wenden Sie sich an Ihren örtlichen Tierarzt. Seien Sie vorsichtig, keine Analgetika mit mit entzündungshemmenden Eigenschaften vor beschäftigening dieses Modell der sterilen Lungenverletzung.
2. Um die Verletzung zu verwalten, zuerst Isofluran Verwaltung einzustellen. Erlauben Maus der Narkosetiefe etwa 10 steigen - 15 s, bis sie zu einer Pinzette toe pinch zu reagieren beginnt.
3. Unmittelbar Einträufeln Schritte Verletzungs beginnen. Wenn der Narkosetiefe zu tief ist, wird das Tier nicht spontan nach einer Verletzung Einträufeln atmen, die Salzsäure enthält Verletzungen besonders wahr ist.
4. Haben Sie ein Assistent den Brustkorb drücken Vitalkapazität zu vertreiben.
5. Verwenden Sie das 1-0 geflochtenen Seidennaht platziert zuvor um die Trachea Traktion zu bieten , indem sie kranial ziehen und legen Sie Spritzennadel in Luftröhre zwischen dem ^1. und ^2. Knorpelringe unterhalb des Larynx. Die Nadel Abschrägung sollte der Operateur und vorab Gesicht, bis die Abschrägung nur über die Luftröhre mit der Nadel als parallel mit der Trachea wie möglich ist.
6. Lassen Sie die Brust kurz vor BolusgabeSalzsäure, um Dispersion und Ablagerung in den distalen Atemwege und Alveolen zu gewährleisten. Kaution den Bolus in etwa 0,5-0,75 s. Halten der Nadel in die Luftröhre bis die erste spontanen Atemzug genommen wird, um sicherzustellen, dass die gesamte Verletzungs Bolusvolumen in die Lungen inhaliert wird.
7. Schließen Schnitt entweder 1 mit - 2 Hautklammern oder Nähte.

4. Wiederherstellungs

1. Mit einem 5-ml-Spritze mit einer 26 G-Nadel, injizieren 1 ml SNS subkutan in Genick Hals für Flüssigkeitszufuhr. Obwohl es minimal während des Verfahrens Fluidverlust ist, neigt der Maus nach der Operation nicht zu trinken und potentiell dehydrieren kann. Alternativ liefern SNS über eine intraperitoneale Injektion.
2. Bewegen Sie die Maus in beheizten Kammer bei 37 ° C perfundiert mit 100% O _2. Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen wieder in platziert gewonnen Gehäuse, bevor sie. Überwachen Tiere und nicht unbeaufsichtigt lassen während dieser Zeit, bis die ambulante und vollständig recovered.

5. Bronchiallavage und Lungenverarbeitung

1. Induce und Isofluran-Narkose erhalten, wie beschrieben in Schritt 2.1 und Schritt 2.2. Bestätigen angemessene Ebene der Anästhesie toe Prise Methode in Schritt 2.2 beschrieben ist.
2. Sichern Sie sich einen Rückenlage auf einer Sezieren Bord in und eine Schleife von 1-0 geflochtenen Seidennaht auf den höheren Schneidezähne verhakt verwenden, um den Hals verlängern. Bewerben Veterinär Salbe auf die Augen Trockenheit zu verhindern.
3. machen die Haut am Hals Heftklammern Nach dem Entfernen einer Mittellinie Längsschnitt durch die Haut von der unteren Bauchwand durch den vorherigen Halsschnitt zum Unterkiefer mit einer Schere.
4. Machen Sie einen Mittelschnitt in der Bauchmuskulatur mit einer Schere und ziehen sich die Bauchorgane mit Schwämmen den Retroperitonealraums zu belichten. Wenn Blut benötigt wird, sammeln aus der Bauchaorta oder untere Hohlvene an dieser Stelle.
5. Euthanize das Tier über Ausbluten durch die Abdom Trenneninal Aorta und untere Hohlvene. Durch den Einsatz wird ein bilaterales Thorakotomie im folgenden Schritt eine sekundäre Bestätigungsverfahren Euthanasie artgerecht von IACUC Richtlinien festgelegt werden abgeschlossen.
6. Perforieren der Membran Lungenkollaps verursachen. Dann unter Verwendung von Knochenschere, weggeschnitten, um die Membran und Schnitt durch den Brustkorb parallel zu und auf beiden Seiten des Brustbeins zu schneiden. Verwenden einer Verriegelungs hemostat die sternal Klappe zurückzuziehen die Lungengefa zu erleichtern Injektion 5 ml warmem (37 ° C) Hanks Balanced Salzlösung mit Calcium und Magnesium in den rechten Ventrikel zu spülen.
   1. Da das Blut aus der Aorta erhalten peripheren Cytokinspiegel vor dem Verfahren in diesem Papier beschrieben zu bewerten, machen einen kleinen Schnitt in der linken Ventrikels notwendig Abfluss zu schaffen für Blut in den Kreislauf ausreichend spülen die Lungengefäße zu verlassen, wenn kein Blut zu erhalten .
7. Prop die Dissektion Bord zu einer 60 ° Neigung und verwenden the Verfahren in Schritt 2.2 beschrieben eine 20 G Einsetzen zu erleichtern x ½ "Edelstahlkanüle in die Trachea und sicher mit einer 1-0 Naht.
8. Legen Sie die Dissektion Bord horizontal und führen Sie eine Bronchiallavage (BAL).
   1. Zur Durchführung der BAL befestigen zwei 5-ml-Spritzen auf eine 3-Wege-Hahn. Füllen Sie eine Spritze mit 5 ml SNS und Schraube in den Hafen von Hahn. Bringen Sie eine leere 5 - ml - Spritze zu einem ^2. Port und schließlich Verbinden offenen Port von Hahn an den inner Trachealkanüle gelegt in Schritt 5.6. Instill 1 ml NS in die Lunge und Spülung mit zweite Spritze.
   2. Wiederholen Sie dies für 5 insgesamt 1 ml NS instillations vorsichtig, dass die Trachealkanüle bleibt gesichert und parallel zu der Luftröhre, so dass es nicht in die Luftröhre nicht abreißt.
9. Für die histologische Analyse, kanülieren die Luftröhre, wie in Schritt 5.7. Befestigen Sie die Lungen von mit 10% neutral gepuffertem Formalin bei 20 cm H ₂ O für 24 h Insufflation.
10. Entfernen Sie jede Lungenlappen Töully Schere und Pinzette Bronchus in der Nähe des Nabels durch Durchtrennen. Platzieren Sie jede Lungenlappen (5 insgesamt) in einer Histologie Kassette vor in Paraffin eingebettet wird. Schneiden 5 & mgr; m Gewebeschnitten mit einem Mikrotom und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin histologischen Standardtechniken. ⁶ Morphometrie können auch auf die histologischen Objektträger durchgeführt werden , um die Schwere Entzündung zu quantifizieren. ⁴
11. Verarbeiten des gewonnenen BAL durch bei 4 ° C bei 1.500 × g für 3 min zentrifugiert. Aliquot der zellfreien BAL Stände in äquivalenten Mengen in 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen für eine spätere Analyse. Bei -80 ° C.
12. Analysieren Sie den BAL für Albuminkonzentration mittels ELISA oder einem anderen biologischen Produkt von Interesse. ¹¹ Die pelletierten Zellen aus der BAL mit Wright-Giemsa-Beize für weiße Blutkörperchen Differenzzahlbestimmung gezählt, cytoslide Proben erzeugt, und gefärbt werden , um die Lungen zu beurteilenEntzündungsreaktion.

Ergebnisse

Pulmonale Histopathologie des murinen Modell von Säure Aspirationspneumonie

Die Mäuse wurden wie oben beschrieben verletzt und Lungen wurden 24 Stunden nach der niedrige pH - Wert Beleidigung entfernt, geschnitten und H & E gefärbt (Abbildung 1). Nekrotischen Zellen, Verlust der Lungen parenchymal Architektur, Zellen und Trümmer in airspaces und signifikante PMN-Infiltration sind deutlich zu beobachten. ?...

Diskussion

Das Ziel war es, ein ALI Tiermodell unter Verwendung von Magensäure Aspiration zu entwickeln, die eng an die Pathophysiologie ähnelt, die während der Entwicklung von Säure Pneumonitis und anschließender ARDS beim Menschen auftritt. Bei der Entwicklung eines Modells, haben wir uns für eine Tierart , die einen hohen Durchsatz der Datenerfassung bietet aufgrund seiner geringen Kosten, kurze Fortpflanzungszyklus und ein gut verstanden immunologische System mit einer Fülle von Ermittlungsinstrumente (dh,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator