Turbidimetría en plaquetas humanas lavadas: El efecto de la Pannexin1-inhibidor de azul brillante FCF sobre la agregación inducida por colágeno

Resumen

Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Resumen

Turbidimetría es una técnica de laboratorio que se aplica para medir la agregación de plaquetas en suspensión en cualquiera de plasma (plasma rico en plaquetas, PRP) o en tampón (plaquetas lavadas), por el uso de uno o una combinación de agonistas. El uso de plaquetas lavadas separados de su entorno de plasma y en ausencia de anticoagulantes permite estudiar las propiedades de plaquetas intrínsecas. Entre el gran panel de agonistas, ácido araquidónico (AA), adenosina difosfato (ADP), la trombina y colágeno son los más utilizados. La respuesta de agregación se cuantifica midiendo la densidad óptica relativa (OD) con el tiempo de suspensión de plaquetas bajo agitación continua. Las plaquetas en suspensión homogénea limitan el paso de la luz después de la adición de un agonista, el cambio de forma de plaquetas se produce la producción de un pequeño aumento transitorio de la OD. Después de esta etapa de activación inicial, la formación de coágulos de plaquetas forman gradualmente, lo que permite el paso de luz a través de la suspensión como una resULT de la disminución de OD. El proceso de agregación se expresa en última instancia como un porcentaje, en comparación con la OD de plasma o tampón pobre en plaquetas. calibración rigurosa tanto, es esencial al comienzo de cada experimento. Como regla general: calibración a 0% se establece mediante la medición de la DO de una suspensión no estimulada de plaquetas mientras se mide la DO del medio de suspensión que no contiene plaquetas representa un valor de 100%. La agregación plaquetaria es generalmente visualizado como una curva de agregación en tiempo real. Turbidimetría es una de las técnicas de laboratorio más comúnmente utilizados para la investigación de la función plaquetaria y se considera como el estándar de oro histórico y se utiliza para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos dirigidos a la inhibición de la agregación plaquetaria. A continuación, describimos protocolos detallados para 1) la preparación de plaquetas humanas lavadas y 2) análisis turbidimétrico de la agregación inducida por colágeno de plaquetas humanas lavadas previamente con el colorante alimenticio azul brillante FCF que fue recientemente idenficados como un inhibidor de Pannexin1 canales (Panx1).

Introducción

Las plaquetas son componentes cruciales de la sangre y su principal función junto con factores de coagulación-es para detener el sangrado después de una lesión de los vasos sanguíneos. Las plaquetas son fragmentos pequeños (2-3 m) anucleares derivadas de megacariocitos de la médula ósea ^1. Las plaquetas circulan en estado no activado, durante el que aparecen como estructuras en forma de lente. Tras la interrupción del endotelio, las plaquetas se reúnen para el sitio de la lesión de los vasos sanguíneos para tapar el agujero, un proceso llamado hemostasia primaria. Inicialmente, las plaquetas se adhieren a las moléculas de sub-endotelial, como el colágeno y el factor de von Willebrand, que se exponen como resultado de la etapa de lesión-adhesión ^2. Luego, se cambian de forma y secretan paso mensajeros-activación química. Finalmente, se conectan entre sí por puentes paso receptores de agregación. hemostasia primaria es seguida por un proceso secundario que implica la activación de la cascada de coagulación con la deposición de fibrina, que estabilizans trombo inicial ^2.

Eventos isquémicos agudos tales como infarto de miocardio ³ menudo el resultado de los trombos que se forman a causa de la interrupción física (ruptura) de una placa aterosclerótica. fármacos antiplaquetarios actuales son la piedra angular del tratamiento de esta enfermedad muy extendida pero su beneficio clínico está limitado por un aumento del riesgo de sangrado. Los fármacos más prescritos en pacientes cardiovasculares, compuestos de aspirina y anti-P2Y12, Target el tromboxano A2 y las vías de ADP ^4, respectivamente, que son las principales vías que conducen a la activación plaquetaria. Sin embargo, la investigación innovadora hacia nuevos objetivos que equilibrar de manera óptima los efectos antitrombóticos y el riesgo hemorrágico sigue siendo necesaria.

Desde la década de 1960 hasta la actualidad ^5, agregometrıa turbidimétrico ha jugado un papel crucial en la investigación, mejorar nuestro conocimiento de la reactividad plaquetaria y yon el seguimiento de la potencia de los reactivos anti-trombóticos en los seres humanos. Turbidimetría se aplicó inicialmente a PRP extraído de muestras de sangre. De hecho, la recogida de sangre a cabo en tubos que contienen citrato permite una producción rápida y grande de PRP sin tener ningún efecto sobre la integridad de las plaquetas y la función. Sin embargo, la estabilidad a corto plazo (aproximadamente 3 h) de PRP y las enzimas plasmáticas restantes, tales como trombina, y la baja concentración de calcio asociado con perfiles de agregación potencialmente artefactual son de gran inconveniente para la utilización de PRP. Un avance importante ha sido el desarrollo de un método para el aislamiento de plaquetas con centrifugación y etapas de lavado ⁶ adicional. En resumen, PRP está aislado de la sangre total extraída en ácido-citrato-dextrosa (ACD) y las plaquetas se aisló después de etapas de centrifugación de serie antes de ser resuspendido en un tampón iso-osmótica fosfato (tampón de Tyrode) que contenía glucosa, albúmina de suero humano y divalente cciones (Ca2 ⁺ y Mg2 ^+). Para evitar cambios en la reactividad de las plaquetas, el pH del tampón de Tyrode es cuidadosamente mantenida a 7,35 hasta 7,4. Además, la activación no deseada de las plaquetas se evita mediante la adición de la prostaciclina (PGI ₂₎ antes de que algunos pasos de centrifugación. Finalmente, la adición de apirasa evita que las plaquetas lavadas se vuelvan resistentes contra la acción de ATP / ADP. La suspensión de plaquetas resultante carece de factores coagulantes y la estabilidad de las plaquetas se aumenta en al menos dos veces en comparación con soluciones de PRP. Además, el hecho de que las plaquetas son órdenes inactivos pero intactas la reproducibilidad de las mediciones turbidimétricos y proporciona la capacidad para estudiar la acción de los agonistas o antagonistas de la agregación de plaquetas de una manera óptima.

Usando este método, hemos demostrado en un estudio reciente que la inhibición de la formación de canales Panx1 por un enfoque genético (knock-out ratones) o disminuyendo la actividad del canal Panx1 por farmacológicaenfoques reducida agregación plaquetaria inducida por colágeno ^7. Panx1 forma canales de liberación de ATP, que se expresan ubicuamente en muchos tipos celulares, incluyendo plaquetas humanas ^{7, 8.} De hecho, hemos demostrado por turbidimetría en plaquetas humanas lavadas que una preincubación de 7 min con un panel de más o menos específicos bloqueadores químicos (probenecid, mefloquina y ¹⁰ péptidos Panx1) antes de la adición de diversos agonistas, inhibido específicamente inducida por colágeno- la agregación de plaquetas mientras que las respuestas de plaquetas a AA y ADP no se vieron afectados. Hemos demostrado que la liberación de ATP a través de canales Panx1 interfiere específicamente en la vía de señalización GPVI conduce a la agregación inducida por colágeno. Curiosamente, varios compuestos aprobados por la FDA con aplicaciones en otras enfermedades (probenecid, mefloquina) afectan a la actividad de los canales Panx1 en plaquetas. Por un lado, esto abre nuevas perspectivas terapéuticas para seleccionarIvely modificar la reactividad plaquetaria. Por otro lado, se debe considerar los posibles efectos secundarios de estos compuestos. En este contexto, el colorante alimentario seguro Brilliant Blue FCF utiliza en múltiples dulces y bebidas energéticas se ha descrito como un inhibidor selectivo de Panx1 ^9. Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de plaquetas lavadas humanas y mediciones turbidimétricas de la agregación plaquetaria adaptado para investigar el efecto del colorante azul de FCF Brilliant como un antagonista de la agregación plaquetaria.

Protocolo

Cinco voluntarios sanos no relacionados se reclutaron para el muestreo de sangre para pruebas de aislamiento y la agregación plaquetaria. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito y el protocolo fue aprobado por el Comité Central de Ética de los Hospitales Universitarios de Ginebra. Todos los voluntarios certificados estén sanos y no han tomado ningún medicamento de plaquetas de interferencia durante al menos los 10 días anteriores los experimentos.

1. Preparación de búfer para extracción de sangre humana y se lavó Aislamiento de plaquetas

1. Preparar una solución acuosa de 100 ml de ácido-citrato-dextrosa (ACD) por disolución de 1,4 g de monohidrato de ácido cítrico (C ₆ H ₈ O ₇ • H ₂ O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trisódico dihidrato (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • 2 _H2O, 85 mM) y 2 g de D anhidro (+) - glucosa. El pH de la solución es aproximadamente 4,5.
2. Preparar soluciones madre de tampón de Tyrode de la siguiente
   1. Preparar la solución stock 1 mediante la disolución de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de _NaHCO3 y 0,58 g NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O en 500 ml de _H2O destilada Las concentraciones finales respectivas son 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM y 8,4 mM. Mantener la solución a 4 ° C.
   2. Preparar solución madre 2 mediante la disolución de 10,15 g de MgCl ₂ * 6 H ₂ O (100 mM) en 500 ml de _H2O destilada Mantener solución a 4 ° C.
   3. Preparar solución madre 3 por disolución de 10,95 g (100 mM) CaCl ₂ * 6 H ₂ O en 500 ml de _H2O destilada Mantener solución a 4 ° C.
3. Preparar tampón de Tyrode diluyendo 2,5 ml de solución madre de 1 en un volumen final de 50 ml con _H2O destilada Esto corresponde a concentraciones finales de NaCl 136,5 mM, KCl 2,68 mM, 11,9 mM de _NaHCO3 y 0,42 mM NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O. Ajustar el pH a 7,35 y esterilizar por filtración con 0,22-m fILTROS.
4. Preparar albúmina 0,35% de tampón de Tyrode (tampón TA ⁷⁾ diluyendo 5 ml de solución madre de 1, 1 ml de solución madre de 2, 2 ml de solución madre de 3, 0,5 ml de HEPES 1 M, 1,8 ml de 200 g / albúmina de suero humano L y 0,1 g de D anhidro (+) - glucosa en un volumen final de 100 ml destilada H ₂ O.
   1. Ajustar el pH a 7,35 con HCl 1 N y ajustar la osmolaridad a 295 mOsm / L mediante la adición de _H2O destilada (10% del volumen total). Las concentraciones finales en esta solución son: NaCl mM 124, KCl 2,44 mM, 10,82 mM _NaHCO3, 0,38 mM NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O, MgCl 0,91 mM ₂ * 6 H ₂ O, 1,82 mM CaCl ₂ * 6 H ₂ O . Mantenga tampón TA a 37 ° C durante todo el experimento.

Colección 2. Sangre

1. Recoger 45-50 ml de sangre venosa, de la vena antecubital usando una aguja 19 G y ninguna o baja torniquete, en tubos de 50 ml de ConTaining anticoagulante ACD (1 volumen ACD para 6 volúmenes de sangre). Desechar la primera 1-2 ml de sangre para evitar la presencia de trombina y factor tisular.
   1. Después de la recogida, se mezcla la sangre con la ACD invirtiendo suavemente el tubo. Incubar la muestra durante 10 min a 37 ° C.

3. Preparación de plaquetas humanas lavadas

1. Pre-calentar la centrifugadora a 37 ° C. Todos los pasos de centrifugación a continuación se llevan a cabo a esta temperatura.
2. Despachar la sangre recogida en tubos de 15 ml (5 ml por tubo) y se centrifuga a 250 xg durante 13 min para obtener PRP.
   NOTA: esta centrifugación paso resulta en la producción de tres capas en la muestra: 1) la capa superior, compuesta de plasma, plaquetas, y una pequeña fracción de células blancas de la sangre. 2) La capa intermedia, una parte rica en células blancas de la sangre. 3) La capa inferior, que se compone esencialmente de las células rojas de la sangre.
3. Recoger el PRP con la pipeta la parte superior layer cuidadosamente en un nuevo tubo de 15 ml para evitar al máximo la contaminación con células rojas y blancas de la sangre, y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
4. Centrifugar el PRP a 2200 xg durante 12 min (para 5 ml PRP).
   NOTA: Este paso de centrifugación se debe realizar con una baja de freno o sin freno.
5. Eliminar el sobrenadante (plasma pobre en plaquetas), y resuspender cuidadosamente el sedimento con 10 ml de tampón TA que contiene 2 l / ml de heparina (5000 U / ml) y 2,5 l / ml de 25? M PGI ₂ usando una pipeta de plástico Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
6. Añadir 2,5 l / ml de 25? M PGI ₂ y centrifugar durante 8 min a 1.900 xg (con baja freno o sin freno).
7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 ml de tampón TA que contiene 2,5 l / ml de 25? M PGI ₂ usando un plástico pipeta Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
8. Durante el periodo de incubación, pipetear 150 l de la suspensión de plaquetas ena un tubo de 1,5 ml y el recuento de plaquetas, utilizando un contador de células automatizado (que detecta el tamaño de células de la sangre mediante la medición de los cambios en la resistencia de corriente continua).
9. Después de la 10 min de incubación, añadir 2,5! L / ml de 25? M PGI ₂ a la suspensión de plaquetas y se centrifuga inmediatamente a 1900 xg durante 8 min.
10. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet a una concentración de 250.000 plaquetas / mu l con un volumen adecuado de tampón TA (es decir, si el recuento de células es de 500.000 por ml, resuspender en 10 ml de tampón TA) que contiene 32 l / ml de apirasa a 0,01 U / ml (concentración final 0,32 U / ml).
    NOTA: La alta concentración de apirasa se utiliza para evitar la desensibilización de los receptores P2X1 inducidas por la secreción espontánea de ATP ^{10, 11} en ausencia de agonistas. Esto es importante porque las respuestas de colágeno inducida son inducidas por paracrina rápido / activación autocrina de P2X1 por ATP liberado from activa las plaquetas. Si la vía de señalización de plaquetas no requiere críticamente preservación de la función P2X1, utilice 0,02 U / ml de apirasa. Varios estudios (revisado en Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ demostraron que 0,02 U / ml de apirasa evita ADP desensibilización P2Y1 receptor con respuestas P2X1 insignificantes.
11. Incubar la suspensión de células durante al menos 30 min a 37 ° C antes de realizar las mediciones aggregometric. La preparación es estable durante 5 a 8 h.

4. agregometría

1. Preparar fibrinógeno (56 mg / ml) en tampón de Tyrode.
2. Pipetear 260 l de suspensión de plaquetas en cubetas de vidrio (Figura 1A; cubeta izquierda) que contiene 10 l de fibrinógeno (56 mg / ml) y una varilla de agitación magnética, a continuación, se incuba la suspensión durante 2 - 3 min a 37 ° C en pocillos de incubación presentes en el agregómetro (Figura 1B y 1C).
3. Pre-incubar con el Panx1inhibidor de Brilliant Blue FCF mediante la adición de 10 l de una 2,8 mM o 28 mM solución madre (concentración final 100? M y 1 mM, respectivamente) durante 7 minutos a 37 ° C.
4. Calibrar el agregómetro a un valor de agregación assumptive 100% en la medición de la DO de una cubeta que contiene 10 l de fibrinógeno (56 mg / ml), 10! L azul brillante FCF (2,8 mM o 28 mM) y tampón TA sin plaquetas.
   1. Colocar la cubeta en una agregación bien bajo agitación automática y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro (es decir prensa F1 si se usa bien la agregación 1).
      NOTA: Este experimento se describe a continuación incluye azul brillante FCF. El compuesto utilizado para la calibración tiene que ser ajustado a la condición experimental.
5. Calibrar el agregómetro a un valor de agregación assumptive 0% mediante el uso de la misma muestra de plaquetas que será utilizado para el experimento bajo stirrin automáticagramo.
   1. Colocar la cubeta en la agregación bien y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro. Espere unos 20-30 s antes de continuar. Este retraso sirve para asegurar que ninguna agregación ocurre antes de la adición de los agonistas.
      NOTA: Como cualquier diferencia en el número de plaquetas puede tener un efecto sobre el diámetro exterior medido, la etapa de calibración 0% necesita ser repetido para cada medición individual.
6. Añadir 20 l de agonista se desea, colágeno / ml, tal como 15 g (1 g definitiva / ml) o 1,125 mM de ácido araquidónico (75? M final), en la cubeta. Inmediatamente iniciar la grabación con agitación automática continua pulsando el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro.
   NOTA: La adición del agonista induce la activación de plaquetas. Agregados de plaquetas se distinguen claramente en la cubeta de vidrio al final del experimento (Figura 1A; right cubeta).
7. La grabación se detiene automáticamente después de 6 min. En este punto, guardar los datos haciendo clic en el icono de guardar de la computadora.
   NOTA: El cálculo de la velocidad de agregación se lleva a cabo por el ordenador, que expresa los resultados finales del proceso de agregación como porcentaje.
8. Analizar los datos.
   1. Para obtener información adicional extensa sobre los protocolos para la preparación de suspensiones de plaquetas lavadas y medición turbidimétrico de la agregación plaquetaria, referirse a otros documentos publicados por expertos en el campo ^{12, 13.}

Resultados

El software agregómetro produce automáticamente las curvas de agregación y da los valores para la agregación máxima en porcentaje. Los valores se pueden copiar en un software de análisis de datos con el fin de realizar análisis estadísticos y visualizar valores máximos de agregación en forma de gráficos de barras. Opcionalmente, cada punto de las curvas de agregación individual puede ser exportado sucesivamente en un software de hoja de cálculo y luego a software estadístic...

Discusión

Hay un gran interés en la búsqueda de nuevos fármacos capaces de modular la función de las plaquetas con el fin de prevenir la trombosis sin aumentar el riesgo de hemorragia. Para este propósito, in vitro pruebas de laboratorio que fiable y reproducible pueden monitorear las respuestas de agregación en plaquetas humanas son absolutamente necesarias. agregometrıa turbidimétrico es una técnica fácil de realizar. Sin embargo, algunas precauciones deben tenerse en cuenta. Las mediciones deben realizarse c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-