二维和三维胚体小鼠胚胎干细胞的维甲酸诱导神经分化的分析

摘要

我们描述了使用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维的胚状体的技术。然后，我们解释如何以诱导胚状体细胞视黄酸，以及如何的神经分化由祖细胞标志物的免疫荧光和免疫印迹来分析其分化状态。

摘要

从胚泡（通常在一天E3.5）的内质分离的小鼠胚胎干细胞（ESC），可以用作体外模型系统用于研究早期胚胎发育。在不存在白血病抑制因子（LIF）的，胚胎干细胞分化默认成神经前体细胞。它们可以积累成三维（3D）的球形聚集体称为胚状体（EB），由于其相似性的早期胚胎中。的EB可在纤连蛋白包被的盖玻片接种，在那里它们通过生长的二维（2D）扩展展开，或在3D胶原基质在那里继续成长为球状体，并分化成三个胚层注入:内胚层，中胚层和外胚层。三维胶原文化更加接近地模拟体内环境比2D日圆。所述2D EB培养通过免疫荧光和免疫印迹来跟踪分化促进分析。我们已经制定了两步神经不同点重刑协议。在第一步骤中，的EB通过悬滴技术生成的，并且，同时，被诱导通过暴露于视黄酸（RA）进行区分。在第二步骤中，在不存在RA的2D或3D格式神经分化前进。

引言

胚胎干细胞从胚泡内细胞团起源。这些细胞是多能的， 即它们具有分化成起源的生物体的任何细胞类型的能力。 ESC 体外分化为广泛兴趣，作为调查的发育途径和机制的实验系统。它提供了一个强有力的和灵活的模型系统来测试的细胞和组织功能障碍修正新的治疗方法。 EB的早期胚胎发育过程中重演细胞分化的许多方面。具体地，可以当胚胎致死性使得难以确定胚胎缺陷^1,2的蜂窝式的基础上使用的EB。的EB可以通过悬滴或液体悬浮液技术³形成。前者的优点是，以产生一致的大小和密度的EB中，从而有利于实验的再现性的能力。

与细胞外基质（ECM）粘附蛋白相互作用可能会影响贴壁细胞的运动性和存活。在2D培养系统，纤连蛋白经常被应用以增加对基底细胞粘附。纤连蛋白是由10种细胞表面的整联异二聚体⁴识别的基底膜成分。

RA是诱导神经分化^5,6维生素A的一小的亲脂性代谢物。高浓度的RA的促进神经基因表达和在EB形成^7,8阻遏中胚层的基因表达。 RA是由维生素A的氧化通过任一醇或视黄醇脱氢酶，随后醛氧化成最终产品通过醛脱氢酶⁹醛生产。神经分化需要从细胞质RA的运输由蜂窝RA-结合蛋白2（CRABP2）细胞核。在细胞核中，RA结合由一个RAR-RXR异二聚体¹⁰的其同源受体复合物。这导致招聘转录共激活因子和转录^9,11的开始。此外，RA促进磷酸化的（活性）SMAD1的降解，从而拮抗BMP和Smad信号^12。除了这些活动，RA增加Pax6的表达，支持神经分化¹³的转录因子。 RA信令由沉默调节蛋白1（Sirt1的），核烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）调制-即deacetylates CRABP2，以其易位干扰到细胞核依赖性酶，并因此与RA结合RAR-RXR异二聚体^{14,15 16。}

e_content">我们在设计这里所述的RA处理的EB协议的目标是为了便于调节ESC分化成神经元前体细胞中的信号传导途径的体外分析，以优化神经分化，其中一个这种协议的优点之一是便利细胞功能的免疫荧光。3D的EB的分析不能很好地穿透抗体和难以成像。EB解离成在特定的时间点的2D单层期间神经分化通过共聚焦显微镜促进免疫标记和细胞的成像。

研究方案

1.培养小鼠胚胎成纤维细胞的（MEF中）

1. 制备MEF培养基，Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM，高葡萄糖），补充有15％胎牛血清（FBS）。
2. 外套百毫米细胞培养皿以在室温下（RT）30分钟0.5％的明胶溶液。
3. 计数使用流式细胞仪的MEF。除去明胶溶液，并立即倒入MEF培养基预先加热至37℃。迅速解冻丝裂霉素C处理的MEF的小瓶在37℃水浴中2分钟，然后播种每100mm明胶包被的培养皿2.8×10 ⁶的MEF。如果使用其它尺寸的菜肴相应调整细胞数。孵育的MEF，在37℃，5％CO ₂过夜。
4. 变化对第二天的媒介。培养2-3天，直至MEF层汇合。

2.鼠标ESC文化

1. 制备ESC培养基，Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM），补充了15％FBS和103 U / mL的白血病抑制因子（LIF），0.1mM非必需氨基酸，55毫摩尔2-巯基乙醇，青霉素（100U / ml），链霉素（100微克/毫升），庆大霉素（200微克/毫升），和0.2％支原体抗生素。
2. 从在步骤1中制备的盘除去MEF培养基，并用37℃下预热的ESC培养基更换。
3. 除霜的ESC小瓶和种子细胞在MEF层的顶部。孵育在37℃，5％CO _2，直至胚胎干细胞达到汇合。
4. 编写包含的MEF融合单层新的细胞培养皿。到通道中的胚胎干细胞，用PBS洗一次，并用0.25％胰蛋白酶/在37℃，5％CO ₂分离EDTA 2-5分钟。加入新鲜IMDM有15％FBS的分离细胞停止胰蛋白酶消化，在160×g下在室温下转移细胞悬液至15mL管中，离心5分钟。
5. 去除上清，重悬胚胎干细胞用新鲜的IMDM和通道中的细胞对每个新的MEF涂覆的培养皿的五分之一;孵育直至细胞达到汇合（通常4-5天）。

3.撤回明胶包被的平板的MEF和胚胎干细胞培养

1. 一旦ECSS达到汇合，用0.25％胰蛋白酶/ EDTA分离它们，将MEF如在步骤2.4，重悬在新鲜的IMDM细胞，转移到非粘性细菌培养皿，并在37℃，5％CO孵育40分钟_2。
2. 小心转移含有的MEF培养基的胚胎干细胞和一个新的明胶包被的平板使用5毫升吸管，避免反复吹打。留在培养皿中的细胞是MEF中，由于胚胎干细胞不坚持。
3. 通道的每3-4天的胚胎干细胞。较少见的传代可以减少ESC多能性。不超过60％汇合，因为它可能有利于分化。
4. 重复步骤3.2-3.3三次或更多，根据需要，直到MEF中不再检测通过细胞培养显微镜使用20倍的目标，以确保MEF中不存在。
5. 验证ESC多能性通过检查ESC培养以查看是否细胞形成致密的集落与典型ESC的多边形形态（ 图1A）。通过定量反转录酶聚合酶链式反应^{（qRT-PCR）17，17}的免疫印迹，或核心的多能性转录免疫荧光试验细胞干性因子^17（ 图2）。

4. EB形成

1. 准备以10mM DMSO全反式 - RA贮备液，并等分入1.5mL的光保护的微量离心管中。解决的办法是在-80℃下长达两周稳定。避光保存它。
2. 胰蛋白酶化胚胎干细胞如在步骤2.4; replate在无LIF新鲜IMDM，作为单细胞悬浮液。
3. 计数使用血球细胞，并在IMDM与0.5μMRA制备5×10 ⁵细胞/ mL的悬浮液。
4. 板100，每100毫米培养皿20-μL滴用8通道移液器和200μL的提示，转化菜，和填充用PBS倒盖，以防止干燥悬滴。避光含有RA-培养基。
5. 培养的EB在悬滴，在37℃，5％CO _2，4天。

5. 2D EB文化

1. 外套12毫米圆形玻璃盖玻片上，用30微克/毫升纤连蛋白在室温下30分钟。放置每个盖玻片的24孔板的孔中，并且每孔加入1个毫升IMDM。
2. 收获3天生长由一个用200μL移液器吸头悬滴的EB一个和种子他们在纤连蛋白包被的盖玻片上，20级的EB每孔，使用相同的移液管尖端。
   注意:因为他们更好地附着在盖玻片3天的EB超过4天的EB的优选。
3. 继续用IMDM-15％FBS培养无LIF。媒体更换，每3-4天。根据需要收集蛋白质分泌分析所使用的平台。

6.分泌蛋白的检测

1. 转移EB中介的500微升微米至10kDa截止离心过滤器，旋在20000×g离心60分钟，4℃。
2. 检查剩余的离心过滤器内的每次15-20分钟，以防止过度丰富的媒介。停止离心当剩余介质的体积已经下降到25微升。
3. 反相滤波器，并在4℃以160×g下旋转时，按照制造商的说明书后收集剩余的浓缩介质。
4. 通过用特异性抗体进行免疫印迹¹⁷检测分泌的蛋白质。

7. 3D EB文化

1. 收集在如步骤5.2中所述悬滴培养4天的EB，并将其放置在1.5毫升离心管（每管30个EBS）。
2. 以下所述3D胶原培养试剂盒的（见材料/设备表 ）中的说明制备胶原凝胶溶液。稀释的胶原溶液和5倍DMEM（试剂盒成分）适当卷;添加n个eutralization溶液（试剂盒成分）和井立即混合，并保持此冰上。
3. 吸取冷冻胶原溶液到含有的EB的1.5mL管中的适当体积，并轻轻地用1个毫升移液管尖端转移至6孔板的孔中。避免气泡。
4. 立即将板转移到37℃，5％CO _2，60分钟以引发聚合胶原。
5. 覆盖用IMDM含EB-板。
6. 更换培养基每3-4天。

8. EB解离

1. 由一个收集一天4的EB（来自步骤4）之一，用200μL移液器吸头，并将它们传送到有15％FBS的非粘合含IMDM细菌培养皿;培养在37℃，持续4天以上5％CO _2。检查将EB每天两次，以确保他们不重视的底部;轻轻摇动培养皿防止EB附接至底部。
2. 离心机中以185×g下将EB在5分钟RT，在台式离心机。
3. 取出上清液。将沉淀不应超过在每个管100μL。
4. 添加到沉淀的EB 1毫升0.25％的I型每管胶原酶，补加在PBS中的20％FBS。
5. 孵育1个小时EB-胶原酶混合物在37℃，5％CO _2，轻轻吹打它每隔20分钟，用1ml移液管尖端。
6. 洗涤细胞，用PBS轻轻三次。如果细胞聚集体存在，使用细胞滤过器以100μm的网格，以除去它们。
7. Replate在IMDM明胶包被60mm的培养皿的细胞。然后孵育在37℃，5％CO _2。

9.转染分离性EB的

1. 对于qRT-PCR的和免疫印迹，涂布6孔板用0.5％明胶。
2. 对于免疫荧光，涂层的玻璃盖玻片上，用30微克/毫升纤连蛋白在室温下30分钟。放置每个盖玻片的24孔板的孔中。加入IMDM。
3. 种子4.75×10 ⁵或1×10 ⁵ 解离的EB细胞（步骤8.4-8.7）每孔中的5,6或24孔板中，分别。
4. 转染前生长的细胞至70％汇合。
5. 由非脂质体脂类干细胞最佳试剂¹⁷转染细胞（见材料/设备 表 ），按照制造商的说明进行操作。
   注意:我们使用的试剂通常达到50％的转染效率（参见代表性结果 ）。
6. 分析通过qRT-PCR或通过免疫印迹法分别转染后¹⁷ 2〜3天，将样品。

通过免疫荧光EB分化10.分析

1. 洗涤2D的EB或解离的EB 3D用PBS并用4％多聚甲醛固定在PBS中在RT下30分钟。洗涤固定的细胞用PBS 3倍，以除去漂浮的细胞碎片。
   注意:多聚甲醛是一种对皮肤和眼睛有刺激性;操作时务必小心。
2. 加入1％的Triton X-100的PBS透化20分钟将细胞在RT，然后用PBS洗3次。
3. 除去PBS并用PBS中5％BSA于30分钟阻断。
4. 制备在1％BSA的第一抗体稀释/ PBS补充有0.03％的Triton X-100。代替由初级抗体溶液中的封闭溶液。孵育3小时，在室温，或过夜，在4℃，然后洗细胞3次，用PBS。
5. 根据制造商的说明书在PBS申请第二抗体。在室温下孵育1个小时，然后洗涤细胞，用PBS 3倍。
6. 安装在玻璃载玻片上的盖玻片与光学显微镜的抗褪色平台。

结果

OCT4，NANOG，SOX2和是赋予ESC自我更新和多能性的核心转录因子。我们应用上述协议ESC的神经分化从野生型和从那里SYX，一个基因编码的RhoA特定交换因子SYX，被破坏基因改造的小鼠的菌株进行比较。我们曾在¹⁸血管牵连三亚。我们注意到，在EB的行为差异从三亚^{+ / +}和三亚汇总^{- / -}胚胎干细胞，并且进行了测试，如?...

讨论

在这个协议中，我们提出一个相对简单的和方便的方法来研究的鼠胚胎干细胞的神经分化。在先前的协议中，RA在第2天或EB悬滴⁸的第4天或由悬浮培养⁷加入到培养基中，分别或后立即EB悬滴聚集^21。在我们设计的方案，RA较早加入。尽管较早引进RA的到的EB通过悬浮培养形成的，这个方案产生的神经分化标记⁸更高的表达。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging