Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Abstract

I meccanismi che regolano la traduzione del mRNA sono coinvolti in diversi processi biologici, quali sviluppo di linea del germe, differenziazione cellulare e organogenesi, così come nelle malattie multiple. Numerose pubblicazioni hanno dimostrato in modo convincente che i meccanismi specifici regolano strettamente traduzione degli mRNA. Crescente interesse nella regolazione dell'espressione della proteina indotta da traduzione ha portato allo sviluppo di nuovi metodi per studiare e seguire de novo proteina sintesi in cellulo. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessa, che li rende costosi e spesso limitando il numero di mRNA bersaglio che possono essere studiate. Questo manoscritto propone un metodo che richiede solo reagenti di base e un sistema di imaging di fluorescenza confocale per misurare e visualizzare le modifiche nella traduzione di mRNA che si verificano in qualsiasi linea cellulare in varie condizioni. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per mostrare la versione localizzata nelle strutture subcellulari delle cellule aderenti in un breve periodo di tempo, offrendo così la possibilità di visualizzare la traduzione del de novo per un breve periodo durante una varietà di biologico processi o di convalida delle modifiche in attività traduzionale in risposta a stimoli specifici.

Introduzione

La regolazione della traduzione di diverse funzioni cellulari ha spinto molti gruppi di ricerca per sviluppare nuovi strumenti e metodi per determinare la localizzazione subcellulare di traduzione del mRNA e proteina regolamentato sintesi^{1,2 ,3,4}. Questi recenti progressi tecnologici consentono una migliore comprensione dei meccanismi che coinvolgono il upregulation di traduzione o la repressione di specifici mRNA durante i processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, la risposta ai farmaci e metastasi^{5 ,6,7,8}. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiedono costosi o pericolosi reagenti e attrezzature specifiche che potrebbero non essere disponibili per la maggior parte dei laboratori. Come tale, un metodo conveniente per consentire la rapida valutazione degli eventi di traduzione è stato sviluppato per eludere specificamente questi potenziali problemi. Questo metodo rileva acute modulazioni traslazionale che si verificano durante specifici processi cellulari e permette anche per la localizzazione di traduzione usando la microscopia confocal.

I metodi descritti qui sono stati utilizzati per monitorare la versione localizzata all'interno di compartimenti subcellulari chiamato diffusione iniziazione centri (SIC)⁵. SICs è transitori strutture si trovano in celle teste di serie che sono localizzate in cima a complessi di adesione nascente. Anche se SICs e complessi di adesione sono distinti, i loro destini sono strettamente collegati. Infatti, SICs è noto per gradualmente svaniscono con la maturazione di complessi di adesione focale in un sito di adesione durante la fase iniziale di adesione. Abbiamo scoperto che le proteine RNA-leganti notoriamente per controllare in modo specifico la traduzione del mRNA (ad es., Sam68, FMRP e G3BP1) e poliadenilazione RNAs sono stati arricchiti all'interno di queste strutture⁵. Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo mostrato che il regolamento di SIC-collegata mRNA traduzione agisce come un checkpoint che consente seminato cellule per consolidare l'adesione delle cellule. Questo metodo, basato sull'incorporazione con puromicina, potrebbe essere considerato una versione adattata del rilevamento del superficie di analisi di traduzione (tramonto). Originariamente sviluppato per misurare il tasso di sintesi proteica globale utilizzando un aminoacido non-radioattivo identificato, proteina puromycilation offre un modo efficiente per visualizzare proteine de novo sintesi⁹. Questo metodo si basa sul comportamento intrinseco del con puromicina, un antibiotico che blocca la traduzione attraverso termine chain prematuro nel ribosoma¹⁰. Infatti, con puromicina è strutturalmente analoga alla tyrosyl-tRNA, che consente per l'incorporazione nell'allungamento catene peptidiche attraverso la formazione di un legame peptidico. Tuttavia, associazione con puromicina ad una catena crescente del peptide impedisce un nuovo legame peptidico in formazione con successivo aminoacyl-tRNA, poiché con puromicina ha un legame di ammide non idrolizzabili invece di legame estere idrolizzabile trovato nel tRNA. Così, l'incorporazione di con puromicina allungando polipeptidi provoca il rilascio prematuro di numerosi polipeptidi troncato puromycilated corrispondente al attivamente tradotta mRNA^9,11,12 .

Utilizzando questo metodo, è stato possibile valutare traduzione attiva all'interno di una vedova di breve periodo di tempo (ad es., 5 min) durante l'adesione cellulare, utilizzando un anticorpo specifico diretto contro con puromicina sulle cellule che sono stati completati con l'antibiotico per periodi di 5-min in diversi momenti durante il processo di adesione delle cellule⁵. La precisione di questo test si basa su altamente specifici anticorpi diretti contro la frazione di puromycilated. Immunofluorescente rilevamento del polipeptide puromycilated fornisce una ripartizione subcellulare generale del mRNA appena tradotta, che può anche essere quantificata con grande precisione utilizzando sistemi di imaging confocale.

Quindi, questo metodo offre un'opzione pertinente per un gran numero di laboratori di studiare i meccanismi di regolazione traduzionale coinvolti in processi come un neurone granulazione^{6,13,14, 15}, morfogeno mRNA localizzazione e traduzione durante lo sviluppo^16,17. È anche adatto per studiare traduzione localizzata o compartimenti durante rapidi eventi biologici, come ad esempio la migrazione cellulare, adesione o invasione, o semplicemente valutare trattamenti farmacologici che possano indurre cambiamenti traslazionale^{5, 7 , 18}. nel complesso, questo metodo consente la visualizzazione degli eventi di traduzione localizzata o controllata in modo rapido, preciso e conveniente.

Protocollo

1. determinazione delle condizioni di Puromycilation

Nota: questa tecnica viene descritto il metodo utilizzato per valutare la versione localizzata durante il processo di MRC-5 cella adesione ⁵. Come puromycilation può essere fatto in qualsiasi cella, è importante ottimizzare le condizioni di puromycilation per le linee cellulari specifiche da utilizzare, poiché le condizioni di trattamento non sono identiche per ogni linea cellulare in termini di concentrazione con puromicina e la desiderata tempo di incubazione. Per mostrare come queste condizioni sono definite, tre linee cellulari di esempio (vale a dire, HeLa, MRC-5 e Huh-7) sono stati trattati con aumento delle concentrazioni di con puromicina per tempi diversi di incubazione ( Figura 1).

1. Grow identico numero di cellule in una piastra a 24 pozzetti in 0,5 mL di appropriato completa terreno di coltura 16 h prima del test. Cellule MRC-5 semi 30.000, 50.000 cellule HeLa o 50.000 HuH-7 cellule per pozzetto. Assicurarsi che evitare di superare la confluenza di 60-70% (Figura 1A).
2. Preparare 6 tubi con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare completo con aumento delle concentrazioni di con puromicina (0, 5, 10, 15, 20 e 30 µ g/mL). Pre-riscaldare a 37 ° C.
3. Per ogni concentrazione con puromicina terreno (preparato in passaggio 1.2), di trasferire 0,5 mL da ciascuna tube in 6 nuovi tubi e aggiungere cicloesimmide ad una concentrazione finale di 50 µ g/mL per tutti i 6 nuovi tubi. Pre-riscaldare a 37 ° C.
4. Cambiare il mezzo con 0,5 mL di terreno di coltura completa (riga 1 e 2). Per la terza riga, aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura completa addizionata di 50 µ g/mL di cicloesimmide ( Figura 1B).
   Nota: Il trattamento del cicloesimmide è stato stabilito come il miglior controllo negativo per proteina puromycilation grazie alla sua capacità di bloccare l'allungamento di traduzione. Poiché l'incorporazione con puromicina richiede allungamento di traduzione, il trattamento del cicloesimmide conduce ad una perdita di puromycilated proteina segnali ^{5 , 18}.
5. Incubare per 15 min a 37 ° C (5% CO ₂).
6. Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla seconda riga per ottenere le concentrazioni finali di 0, 2,5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL, rispettivamente, nelle colonne A, B, C, D, E e F. Allo stesso tempo, aggiungere 0,5 mL di con puromicina al medium cicloesimmide-completati (punto 1.3) nella terza riga ( Figura 1).
7. Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
8. Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla prima riga per ottenere le concentrazioni finali di 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL ( Figura 1).
9. Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
10. Lavare ogni bene dal salino righe 1-3 con 1 mL di gelida 1x tamponata fosfato (PBS) 5 min dopo l'aggiunta di con puromicina pozzetti della prima riga (lavare due volte). Aggiungere 75 µ l di tampone X Laemmli 1 (4% sodio dodecil solfato (SDS), 4% 2-mercaptoetanolo, 0.120 M Tris-HCl pH 6.8, 0,004% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) per ottenere lisati di cellule intere per ogni condizione.
Elettroforesi del gel di
11. Esegui 10% SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) con 1/3 dei campioni preparati per valutare incorporazione con puromicina.
    1. Determinare il livello di incorporazione con puromicina mediante Western blot usando un anticorpo anti-con puromicina (12 D 10) diluito in un rapporto di 1: 25 000 in tampone di incubazione anticorpo primario (2% albumina di siero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, Tris 10 mM pH 7.4 e 0,01% sodio azide).
       Nota: Immagini rappresentative, corrispondenti a differenti delle cellule linea estratti completati descritto nel passaggio 1 sono mostrati come esempi in Figura 2.

2. In Cellulo Localizzato visualizzazione traduzione

Nota: la tecnica qui descritta è stata utilizzata per valutare la versione localizzata all'interno di SICs in cellule MRC-5 durante il processo di adesione ⁵. Anche se le cellule MRC-5 sono usate qui, altre linee cellulari possono essere utilizzati con la stessa metodologia descritta nel passaggio 2.1.

1. Preparazione di cell.
   1. Staccare MRC-5 celle utilizzando 0,25% tripsina/2,21 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in Hank ' s soluzione salina bilanciata (HBSS). Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (5 min a 200 x g) in una provetta conica per centrifuga 15 mL e sospenderle in Dulbecco ' Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) a 40.000 cellule/mL dopo che conta con una camera di conteggio di s.
   2. Incubare le cellule sospese a 37 ° C in delicata rotazione utilizzando un rotatore tubo per 20 min per essere mantenute in sospensione.
      Nota: Questo passaggio è fondamentale per consentire la completa dissociazione dei complessi di adesione focale.
   3. Piastra 2 mL di cellule MRC-5 sospese (40.000 cellule/mL) in due piatti di 35mm con fondo di vetro. Utilizzare il primo piatto di 35 mm con fondo di vetro per il dosaggio di puromycilation (Vedi punto 2.1.5) e utilizzare la seconda come controllo negativo (Vedi punto 2.1.6).
   4. Mantenere le cellule a 37 ° C (5% CO ₂) per 55 min consentire adesione cellulare e formazione di SIC.
   5. Con puromicina. Aggiungi al mezzo nei piatti con fondo di vetro 35mm (saggio) usando la concentrazione precedentemente definita nella sezione 1. Per il trattamento di cellule MRC-5, utilizzare con puromicina. 10 µ g/mL per 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
   6. Come controllo negativo, aggiungere cicloesimmide al secondo 35 mm con fondo di vetro piatto 40 min dopo la semina le cellule per pre-trattare con cicloesimmide di 50 µ g/mL ( Figura 2B). 15 min dopo l'aggiunta del cicloesimmide, aggiungere quindi con puromicina al mezzo utilizzando la stessa concentrazione e incubazione data come descritto al punto 2.1.5 (ad es., uso 10 µ g/mL di con puromicina per 5 min a 37 ° C (5% CO ₂) per MRC-5).
   7. Lavare ogni piatto due volte con 2 mL di gelida 1 X PBS e fissare le cellule con 1 mL di formaldeide al 4% (diluito in 1X PBS) per 15 min a temperatura ambiente (TA).
      Attenzione: Paraformaldeide deve essere utilizzato unicamente in una cappa chimica.
2. Immunostaining.
   1. Dopo la fissazione del paraformaldeide, lavare tre volte con 2 mL di 1X PBS e incubare in 500 µ l di PBS-TritonX-100 (0,5%) per 20 min a RT per permeabilize le cellule.
   2. Per impedire il legame non specifico anticorpo, bloccare il campione con 500 µ l PBS – BSA (1%) per 20 min a RT.
   3. Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di 1:12,500 con anti-puromicina anticorpo (12 D 10) diluito in 1X PBS per 1h a RT.
   4. Lavare 3 volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di anti-topo IgG coniugato ad un fluoroforo (qui, 488 nm) diluito in PBS per visualizzare puromycilated polipeptidi e con falloidina coniugata a un altro fluoroforo (qui, 555 nm) per visualizzare F-actina. Incubare per 1 h a RT.
   5. Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi incubare per 5 min a RT a 300 µ l di PBS-Tween20 (0,1%) completati con 1 µ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   6. Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi lavare con 2 mL di 1X PBS. Impedire alle cellule di essiccazione mantenendo il campione in 2 mL di 1X PBS durante acquisizione immagine.

3. Acquisizione di immagini di immunofluorescente

Nota: la seguente metodologia può essere utilizzata con qualsiasi sistema di imaging confocale commercialmente disponibile.

1. Determinare le appropriate impostazioni per ogni fluoroforo per massimizzare la gamma dinamica per quantificazione.
   Nota: Quantificazione rappresentativa può essere ottenuto solo se viene evitata la saturazione di pixel e la soglia di segnale è regolata correttamente. Queste impostazioni possono essere raggiunti regolando accuratamente la potenza del laser, ad alta tensione (HV), guadagno, e l'offset. Fattore di
   1. regolare lo zoom (5x) e il numero di pixel (512x512) per ottimizzare le dimensioni dei pixel.
      Nota: Questo dovrebbe essere almeno 2.3 - volte più piccolo rispetto alla risoluzione ottica, secondo il teorema di Nyquist.
   2. Diminuire la velocità di scansione (12,5-20 µs/pixel) e utilizzare una media (2 - 3 volte) per migliorare il rapporto segnale-rumore secondo le impostazioni di cui sopra.
2. Manualmente determinare alto appropriato e inferiore piani focali lungo l'asse z con la dimensione ottimale passaggio (0,4 µm/fetta).
   Nota: Il piano di dimensioni di passaggio è determinato dalla risoluzione assiale divisa da 2.3, secondo il teorema di Nyquist. In genere, 20-25 strati sono necessari per coprire la profondità intera cella delle celle aderenti.
3. Acquisire un'immagine confocale di un'intera cella singola con un obiettivo a immersione in olio (apertura numerica 1,42) X piano Apo 60.

4. Quantificazione di immagine immunofluorescente

1. determinazione di arricchimento.
   1. Aprire un'immagine corrispondente al layer di z-aereo di interesse dal file di dati di acquistato delle cellule usando il software ImageJ (freeware disponibile presso http://fiji.sc).
   2. Disegnare una linea utilizzando lo strumento di disegno a tratteggio (barra degli strumenti → dritto) attraverso le regioni della cellula dove quantificazione è desiderato. Modificare lo spessore della linea facendo doppio clic su " dritto; " i valori di intensità saranno mediati attraverso la larghezza della linea (fissato a 8 nella Figura 3).
      Nota: Una linea più sottile è preferita per evitare la sovrapposizione di segnale da diverse strutture.
   Profilo di
   3. dopo la riga è impostata correttamente, la densità del segnale lungo l'asse determinato (barra dei menu → Analyze → tracciare il profilo).
      Nota: Una nuova finestra si aprirà che mostra un profilo corrispondente all'intensita di segnale per ogni pixel del canale selezionato (specifico fluoroforo) lungo la linea per la sezione selezionata del piano z.
      1. Ripetere il processo per ogni canale corrispondente il fluoroforo utilizzato (vale a dire una quantificazione per 488, uno per 568 e uno per 405).
         Nota: Il valore di intensità del segnale sempre verrà ordinato seguendo l'orientamento della linea disegnata.
   4. Per ottenere i valori numerici in scala di grigi per ogni pixel del profilo corrispondente per la quantificazioni di livello z-aereo selezionato, copiare i dati del profilo (barra dei menu nella finestra immagine → copia) e incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo.
   4.1.1-4.1.4
   5. ripetere i passaggi per ogni sezione del piano z dell'immagine acquisita confocale ed ogni canale dove è voluto quantificazione.
      Nota: La quantificazione dei diversi strati di z-aereo possa essere riunita per ottenere una valutazione generale dell'arricchimento speciale del segnale calcolando il valore della somma di ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Questo tipo di pool può essere raggiunto solo se la linea tracciata è identica per ogni strato di z-aereo incluso nei valori medi.
   6. Come metodo alternativo per la quantificazione di cellule intere di canali diversi con un gran numero di strati, utilizzare la macro denominata StackprofileData (vedere il File supplementare).
      Nota: Questa macro è accessibile liberamente a https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt e può essere utilizzata come segue:
      1. incollare la macro in un file di testo e salvare esso.
      2. Aprire il file di immagine che include tutti i livelli confocale della cellula.
      3. Disegnare una linea, come descritto al punto 4.1.2, aprire una nuova finestra per importare la macro (barra dei menu → plugin → macro → eseguire), scegliere il file di testo salvato in precedenza corrispondente alla macro StackprofileData e fare clic su " Open. "
         Nota: A seguito di importazione di macro, una nuova finestra denominata " risultati " si aprirà e tutti la quantificazione lungo l'asse determinato saranno elencati per ogni strato di z-plane e canale presenti nei file immagine.
      4. Copiare i dati per ogni canale (barra dei menu → modificare → copia) per ottenere la rappresentazione grafica del profilo corrispondente per la quantificazioni di segnale. Incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo. Calcolare il valore della somma di ogni canale per ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Utilizzare questi valori per creare una rappresentazione grafica simile a quello presentato nella Figura 3.
2. Quantificazione del segnale in un volume o designata zona cellulare.
   1. Aprire il file di immagine con software ImageJ.
   2. Disegnare un'area per indicare l'area di interesse utilizzando la funzione di forma geometrica (barra degli strumenti → " rettangolo, " " ovale, " o " poligono ").
      Nota: Il valore di quantificazione sarà determinato per l'area corrispondente alla forma disegnata.
   3. Regolare il livello di soglia per evitare qualsiasi segnale di fondo (barra dei menu → immagine regolare → soglia); una nuova finestra apparirà per rappresentare le intensità di pixel in forma di istogramma. Modificare i valori per includere o escludere pixel nella quantificazione utilizzando il dispositivo di scorrimento. Selezionare una soglia che Elimina pixel rossi all'esterno della cellula, come evidenziato in rosso pixel sarà incluso nella quantificazione.
   4. Definire i parametri di misurazione per quantificare il segnale di pixel all'interno dell'area selezionata, senza segnale di fondo (barra dei menu → Analyze → impostare misure) e assicuratevi di controllare il " limite di soglia " e il " densità integrata " scatole.
   5. Misurare i valori quantitativi per l'area selezionata (barra dei menu → Analyze → misura).
      Nota: Quantificazione di intensità del segnale sarà presentato in una nuova finestra sotto il " IntDen " identificazione, che rappresenta il prodotto dei valori medi di grigio e il numero di pixel all'interno dell'area selezionata.
   6. Disegnare un'area che include l'intera cella utilizzando una forma geometrica (barra degli strumenti → " rettangolo, " " ovale, " o " poligono ") e procedere con la procedura 4.2.3-4.2.5 per ottenere un valore corrispondente al segnale totale. Calcolare il rapporto del segnale all'interno dell'area selezionata sopra l'intero segnale per ottenere la percentuale del segnale all'interno dell'area di interesse.
   7. Ripetere passaggi 4.2.2-4.2.6 per ottenere la quantificazione del volume di cella per ogni z-plane. Adattare la forma geometrica come necessario.
   8. Copiare/incollare i dati ottenuti dalla " risultati " windows per ogni strato di z-aereo in un foglio di calcolo per la rappresentazione grafica e per trovare un valore medio.

Risultati

Per osservare con precisione gli eventi di traduzione mediante incorporazione con puromicina, è fondamentale per determinare le condizioni ottimali per ogni linea cellulare perché ognuno Mostra diversi con puromicina incorporazione cinetica (Figura 1)^{9,11 ,12,18}. Quindi, per convalidare l'incorporazione con puromicina, è necessa...

Discussione

I recenti progressi tecnologici hanno consentito una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nel upregulation traslazionale o la repressione di specifici mRNA in processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, risposta ai farmaci e metastasi. La metodologia conveniente qui descritta consente traduzione eventi possano essere visualizzati nelle celle per studiare come le proteine RNA-leganti regolano processi metastatici, come adesione cellulare, migrazione e invasione.

Anche se sono sta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500