في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

Summary

ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.

Abstract

في معظم النباتات المزهرة، الزيجوت والجنين مخفية في أعماق نسيج الأم، وهكذا منذ فترة طويلة كان لغزا لكيف تتطور بشكل حيوي؛ على سبيل المثال، كيف اقحه نمطين لإنشاء محور الجسم وكيف يحدد الجنين مصائر خلية مختلفة أثناء تكوين الجهاز. ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule ثقافة أسلوب القيام بتصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة من نبات التمويل. المتوسط زراعة محسنة يسمح zygotes أو الأجنة في وقت مبكر أن تنمو لتصبح نباتات خصبة. عن طريق الجمع بين ذلك مع جهاز صفيف ميكروبيلار poly(dimethylsiloxane) (PDMS)، يعقد في ovule في المتوسطة السائل في نفس الموضع. هذا التثبيت أمر حاسم لمراقبة ovule نفسه تحت مجهر لعدة أيام من شعبة زيجوتيك إلى أواخر مرحلة الجنين. يمكن استخدام التصوير تعيش الخلية الناتجة لرصد ديناميات الاستقطاب الزيجوت، مثل الهجرة النووية وإعادة ترتيب سيتوسكيليتون، وأيضا توقيت انقسام الخلايا ومواصفات مصير الخلية أثناء الزخرفة الجنين في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج هذا النظام زراعة ovule مع العلاجات مثبط لتحليل آثار العوامل المختلفة على وضع الجنين والتلاعبات البصرية مثل انقطاع الليزر لدراسة دور خلية خلية الاتصال.

Introduction

خطة الهيئة الأساسية للكائن الحي يتطور من اقحه أحادي الخلية. في معظم النباتات المزهرة، يولد شعبة زيجوتيك قمي وخلية القاعدية، التي تتطور إلى تبادل لإطلاق النار والجذر، على التوالي¹. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف يتم تشكيل هيئة النبات أثناء امبريوجينيسيس، ولكن لم يكن هناك أداة فعالة لمراقبة ديناميات zygotes الحية والأجنة مباشرة نظراً لتطورها في أعماق الزهرة. في العديد من أنواع مونوكوت، مثل الذرة والأرز، وأسلوب إخصاب في الأنابيب قد المنشأة^2،3. في هذا الأسلوب، عزل الحيوانات المنوية والخلايا البيض تنصهر فيها كهربائياً أو كيميائيا، والخلية التي تم إنشاؤها يمكن أن تتطور إلى مصنع خصبة. ومع ذلك، في مصانع ديكت، يوجد أي في المختبر التسميد أسلوب التي يمكن إنتاج أجنة سليمة، يفترض أنه بسبب حالة عدم مزامنة دورة الخلية الأمشاج الذكور والإناث^4،5. وبالإضافة إلى ذلك، يلعب الأنسجة المحيطة بالجنين (السويداء) أدواراً هامة في تنمية الجنين⁶.

في أنواع ديكت نموذجي، ألف-التمويل، وضعت طريقة زراعة في المختبر بالتركيز على أبل كله، الذي يتضمن كلا من الجنين والسويداء⁷. استخدمت هذا النظام بنجاح تحليل آثار مختلف الكواشف الكيميائية على امبريوجينيسيس، ولكن أنها ليست مناسبة للوقت الفاصل بين التصوير لأنه يحتوي على معدل منخفض البقاء على قيد الحياة. ولذلك، تم وضع نظام زراعة ovule رواية في المختبر بغية البدء في أقرب وقت مرحلة الزيجوت، وإنتاج النباتات الخصبة في ارتفاع نسبة⁸. بعد محاكمات مختلفة، أنه تم العثور على تلك الوسيلة نيتش وتريهالوسي تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة من البويضات⁸. وبالإضافة إلى ذلك، لأنه توسع ovule كما أنها تنمو وهكذا كثيرا ما يتحرك بعيداً عن ميدان المراقبة المجهر، وضعت جهاز PDMS لإصلاح في أبل في المتوسط⁹. تمكين الجهاز PDMS تصوير طويلة الأجل لمدة 3-4 أيام، وكافية لتتبع التنمية من الزيجوت إلى جنينا قلب-مرحلة. باستخدام هذه الطريقة، يصبح من الممكن تصور ديناميات الاستقطاب الزيجوت والجنين الزخرفة، ليس فقط في ظل الظروف العادية، ولكن أيضا حضور مثبطات الكيميائية أو في مختلف الخلفيات متحولة^{8،10 ،11}.

الشكل 1: رسم تخطيطي "علامات نيون المحددة" المستخدمة لتصور زيجوتيس والأجنة من خلال أوفولي.
اقحه نبات تتطور إلى جنين في أبل، التي يتم إنشاؤها داخل الزهرة. في هذا المختبر في زراعة النظام، لوحظت الزيجوت والجنين من خلال أبل، وبالتالي من المهم أن تستخدم علامات نيون المحددة التي لم يتم التعبير عن الأنسجة ovule الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

1. إعداد من "مستنبت Ovule في المختبر"

1. جعل الوسط السائل لثقافة أوفولي في المختبر (" المتوسطة N5T ") الذي يحتوي على 1 x Nitsch القاعدية الملح المخلوط، 5% (w/v) تريهالوسي ثنائي هيدرات، 0.05 % (w/v) 2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك (مس)-كوه (5.8 درجة الحموضة)، و 1 x Gamborg ' حل فيتامين s-
2. ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 مع كوه.
3. تعقيم المتوسطة بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة)، أو التصفية فإنه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة معقمة عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر.

2. إعداد الجهاز الصفيف ميكروبيلار PDMS

1. قطع الجهاز ميكروبيلار PDMS سكين أو شفرة حلاقة أو مقص لتناسب الجزء الزجاج (14 مم φ) صحن أسفل الزجاج 35 مم-
   ملاحظة: يرد وصف للإجراءات الكاملة لبناء جهاز PDMS في الورقات السابقة ^{8 ، 9}، وهكذا يتم حذف التفاصيل هنا. أطباق الزجاج السفلي مع أحجام أصغر، مثل لوحات 4-جيدا أو 96-جيدا، يمكن أن تستخدم لتصوير قصيرة الأجل دون الجهاز.
2. تعقيم الجانب العلوي من الجهاز PDMS تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على 15 دقيقة
3. تشغيل الجهاز PDMS استولت عليها استخدام الملقط نصيحة مربعة، وإبقائه تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة لتعقيم الأسفل.
4. نقل الجهاز PDMS معقمة في طبق ثقافة 35 ملم وإضافة المتوسطة N5T حتى الجهاز هو تماما غارقة في الأجل المتوسط (حوالي 5-7 مل)-
5. وضع الطبق في فراغ غرفة، والحد من الضغط ديغا. تبقى كنس ل 3 (ح) بين عشية وضحاها حتى يتم استبدال الهواء في الجهاز بواسطة.
   ملاحظة: يمكن فصل الجهاز بفقاعات الهواء تحت فراغ قوية.
6. تأخذ الجهاز من الطبق خلال عقد مع ملاقط نصيحة مربعة ووضعها على منشفة ورقية لإزالة وسيلة إضافية على الجانب السفلي-
   ملاحظة: لا يجب إزالة المتوسطة في الصفيف ميكروبيلار (السطح العلوي) لأن هذا سوف تستخدم لزراعة أبل.
7. نقل الجهاز على زجاج شريحة 76 ملم × 26 مم، وضمان للحفاظ على جزء ميكروبيلار كالجانب العلوي، ويشمل الجهاز مع غطاء صحن الثقافة 35 ملم للحيلولة دون المتوسط من الجفاف أثناء استخراج ovule التالية.

3. تشريح خردلة واستخراج أوفولي

1. تعقيم إبرة (0.40 مم ز) وملاقط غرامة بالمسح مع الإيثانول 70%. الإبرة هو التعامل معها بسهولة عن طريق إرفاق ذلك بعصا المحاقن أو الخشب.
2. التحقق من نورات المصنع، وحدد سيليكويس السليم للتجربة. سيليكويس مم تقريبا 5 يتضمن zygotes، وسيليكويس 8-10 مم وتشمل الأجنة كروي الشباب-
3. المكوس سيليكويس باستخدام الملقط، ووضعها على وجهي الشريط على زجاج شريحة 76 × 26 مم. يتضمن خردلة واحدة حول البويضات 40-60، و 3-4 سيليكويس (أي، البويضات 120-240) غير كافية لجهاز واحد.
4. فتح خردلة (جدار المبيض) لرؤية البويضات داخل باستخدام إبرة معقمة وملاقط تحت ستيريوميكروسكوبي. قص الجدار المبيض فقط حتى أن لم تكن معطوبة البويضات.
5. نقل خردلة تم فتحها في المتوسط N5T على الجهاز PDMS (أعد الخطوة 2.7)، وإطلاق سراح البويضات في المتوسط بإبرة أو بالملقط.
6. وضع كوب غطاء صغيرة (18 ملم × 18 ملم) على الجهاز PDMS لدفع البويضات في المساحات في الصفيف ميكروبيلار.
7. تقلع زجاج الغطاء عن طريق سحب أفقياً باستخدام الملقط أو الأصابع لإزالة متوسطة إضافية.
8. اقلب الجهاز PDMS ووضعه في طبق زجاج-أسفل 35 ملم واضغط قليلاً الجهاز عن طريق دفع استخدام الملقط مربع تلميح إلى التمسك بها للزجاج-
9. المتوسطة من أجل N5T برفق في الزجاج-الأسفل طبق بالصب زجاجة متوسطة حتى الجهاز PDMS هو تماما غارقة في الأجل المتوسط، وختم الطبق مع الفيلم البارافين.
   ملاحظة: يمكن أن يكون الجهاز PDMS المعاد تدويره، ولكن يتم فصل الأجهزة التي قديمة جداً بسهولة من أسفل الزجاج. بالإضافة إلى ذلك، قد تطفو الجهاز إذا لم يطرد تماما في الخطوة 2، 5 أو المتوسطة يسكب بسرعة كبيرة جداً-

رقم 2: الإجراء التخطيطي لإعداد نموذج.
ويناظر هذا التدفق التخطيطي الخطوات 3.5 إلى 4.1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

4-"الوقت الفاصل بين التصوير"

1. مكان الطبق أسفل الزجاج الذي تم إعداده في الخطوة 3، 9 على مجهر مقلوب، وحدد البويضات المناسبة للتركيز على-
   ملاحظة: نظراً لاختلاف البويضات في مرحلة والموقف والاتجاه، ينبغي إيجاد البويضات مناسب عن طريق فحص هذه الأسفار ماركر.
2. بدء تصوير العيش وفقا للشركة المصنعة ' s تعليمات نظام المجهر.
   ملاحظة: المعدات مجهر والمعلمات متنوعة، وهكذا ينبغي أن المستخدمين اختيار الإعدادات المناسبة التي تلائم الغرض التجربة. على سبيل مثال، يتم سرد الإعدادات المستخدمة في هذه المخطوطة في الجدول 1-

< td > الفرقة-تمرير مرشحات؛ 534/30 نانومتر و 578/105 نانومتر

معدات/إعداد	الشكل 3 (أ) وتكميلية كليب 1 و 4	الشكل 3 (ب) والتكميلي فيديو 2	تكميلية الفيديو 3
مجهر	مسح ليزر مقلوب المجهر (A1R MP)	القرص الغزل المجهر المقلوب [كنفوكل] (الاتحاد الاجتماعي المسيحي-W1)	نوع مربع مقلوب نظام المجهر [كنفوكل] مع غرفة حضانة ثابتة (CV1000)
ليزر	Ti:sapphire femtosecond نبض الليزر	الليزر LD 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561	الليزر LD 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561
س عدسة المرحلية	40 × عدسة الهدف غمر المياه (NA = 1.15) مع الغمر المتوسطة	60 × سيليكون النفط غمر عدسة الهدف (نا = 1.30)، شنت على محرك تركيز بيزو	عدسة الهدف X 40 (NA = 0.95)
كشف أو	الخارجية PMT جاسب غير ديسكانيد للكشف عن	الكاميرا امككد	كاميرا امككد
مرآة ديتشرويك	DM495 و DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
تصفية	مرشحات تمرير الفرقة؛ 520/35 نانومتر، و 593/46 نانومتر	مرشحات تمرير الفرقة؛ 520/50 نانومتر و 617/73 نانومتر
الشريحة على طول محور ع	z 31-مداخن مع فواصل 1 ميكرومتر	مكدسات z 17 مع 3 ميكرومتر في جملة فاليه	مكدسات ض 7 مع فترات 5-ميكرومتر
الفاصل الزمني	دقيقة 20	دقيقة 5	دقيقة 10

الجدول 1: نظم مجهر والإعدادات المستخدمة في هذه المخطوطة.
المجاهر والمعلمات المتنوعة، وهكذا ينبغي أن يختار كل مستخدم نظام مناسب للتجربة-

3. التحقق من تسلسل الصورة المكتسبة، وتحويله إلى تنسيق الفيلم عامة، مثل.avi أو موف للعرض التقديمي.
   ملاحظة: إذا كان لا يمكن إخراج البرنامج مجهر الصور كتنسيق فيلم، من الممكن لحفظ الصور ك.tif ثم فتح لهم في إيماجيج، أحد برامج مصدر مفتوح مستوحاة من صورة المعاهد الوطنية للصحة، تغيير نوع الملف. إيماجيج يرد على: https://imagej.nih.gov/ij/. يمكن أيضا استخدام إيماجيج لجعل Z-sالثنية الفيلم، مثل إسقاط أقصى حدة، كما هو موضح في: https://imagej.net/Z-functions-

النتائج

باستخدام هذا النظام زراعة ovule، يمكن تتبع هذا الأسلوب المعيشة ديناميات الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين. وهذا يعد إنجازا لأنه كانت هناك لا تقنية لتصور في الوقت الحقيقي سلوك الزيجوت والأجنة، التي كانت مخبأة في عمق النسيج الأم. الشكل 3 ألف و التكميلي ف?...

Discussion

ويدخل هذه المخطوطة بسيطة في المختبر ovule زراعة بروتوكول فعال للاستخدام في تصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة.

قد تحتاج إلى تصميم الجهاز PDMS الأمثل وفقا لمرحلة الجنين. كان الجهاز المتقدمة أول مجموعة ميكروكاجي لضبط الاتجاه وتحديد الموقف من البويضات⁹، وثم تم بناء...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84