Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

Riepilogo

Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.

Abstract

Immunoblotting è diventata una tecnica di routine in molti laboratori per la caratterizzazione di proteine da campioni biologici. Il seguente protocollo fornisce una strategia alternativa, capillare isoelettrico (cIEF), di messa a fuoco con molti vantaggi rispetto ai convenzionali immunoblotting. Si tratta di un metodo basati su anticorpi, automatico, rapido e quantitativo, in cui una procedura completa di macchiante occidentale si svolge all'interno di un capillare ultrasottile. Questa tecnica non richiede un gel per trasferire ad una membrana, rimozione delle macchie, o pellicole, che sono in genere necessari per immunoblotting convenzionali a raggi x. Qui, le proteine sono separate secondo la loro carica (punto isoelettrico; pI), utilizzando meno di un microlitro (400 nL) di lisato proteico totale. Dopo l'elettroforesi, proteine sono immobilizzate sulle pareti dei capillari di trattamento della luce ultravioletta, seguita da primario e secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugato) incubazione dell'anticorpo, cui l'associazione viene rilevato attraverso funzionalità migliorata chemiluminescenza (ECL), generando un segnale luminoso che può essere catturato e registrato da una telecamera di charge coupled device (CCD). L'immagine digitale può essere analizzato e quantificati (area del picco) utilizzando il software. Questa procedura di throughput elevato può gestire 96 campioni contemporaneamente; è altamente sensibile, con rilevazione di proteine nella gamma picogrammo; e produce risultati altamente riproducibili a causa di automazione. Tutti questi aspetti sono estremamente utili quando la quantità di campioni (ad esempio, campioni di tessuto e biopsie) è un fattore limitante. La tecnica ha anche applicazioni più ampie, tra cui lo screening di farmaci o anticorpi, scoperta del biomarcatore e scopi diagnostici.

Introduzione

Messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) è un test immunologico automatizzato, basato su capillare che risolve le proteine in base al loro costo^1,2,3. È altamente riproducibile e in grado di risolvere le proteine e loro isoforme traduzionalmente modificate rapidamente e quantitativamente. Presenta un'alternativa ai metodi convenzionali come macchiare occidentale. Mentre macchiare occidentale è molto buono per confermare la presenza di abbondanti proteine in campioni facilmente accessibili; variabilità, il consumo di tempo e tutti i presenti la quantificazione accurata sfide, in particolare quando si esaminano i campioni di tessuto biologico. Infatti, la variabilità è un problema inerente a macchiarsi occidentale, come ci sono numerosi passi coinvolti, quali caricamento e funzionamento del gel di SDS-PAGE, il trasferimento delle proteine sulla membrana, incubazione con vari reagenti (ad es., primaria e secondaria anticorpi, ECL) e sviluppo sulla pellicola di raggi x⁴. Attualmente, la tecnica macchiante occidentale sta migliorando con l'implementazione di registrazione digitale dei segnali a chemiluminescenza (Western digital). Recentemente, è stato sviluppato un sistema automatizzato di macchiante occidentale, vale a dire il capillare occidentale, che è un sistema più hands-free e gel-libero. Il dosaggio intero è automatica dopo il caricamento di un piatto di campione (campioni con tutti i reagenti necessari) nel sistema^3,4. Lo strumento eseguirà tutti i passaggi come la separazione delle proteine, immobilizzazione di proteine sulla parete capillare, le incubazioni dell'anticorpo, lava tra diverse fasi e sviluppo e quantificazione dei segnali a chemiluminescenza. Così, la procedura cIEF qui presentata fornisce una maggiore risoluzione e sensibilità.

Questo metodo è riservato, come segnali possono essere generati e quantificati da picogrammi di proteine¹. L'alta sensibilità con eccellente riproducibilità rende questa tecnologia molto utile per l'analisi di campioni clinici. Può rilevare come pure distinguere post traduzionali (ad es., proteina fosforilata diverse isoforme) delle proteine. Questa tecnologia è stata utilizzata con successo per dissecare diversa segnalazione vie^4,5 negli studi clinici con l'obiettivo di sviluppare nuove terapie cancro³, e ha grandi potenzialità per la scoperta di biomarcatori e droga di proteina .

Protocollo

1. cultura, stimolazione e lisi delle cellule

Nota: Questo metodo può essere utilizzato con molti tipi di cellule. Per illustrare il metodo, è descritto un esempio di utilizzo di cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs).

1. Cultura di HUVECs il rivestite di gelatina, di 10cm Petri in medio basale delle cellule endoteliali con il completamento appropriato (Vedi Tabella materiali) e contenente anche 5% FCS, fattore di crescita epidermico (5 ng/mL), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF: 0,5 ng/mL), base FGF (10 ng/mL), fattore di crescita insulino-simile (20 ng/mL), idrocortisone (0,2 µ g/mL) ed acido ascorbico (1 µ g/mL).
2. Morire di fame le cellule durante la notte con medium basale delle cellule endoteliali, completate con 1% FCS e nessun supplemento di fattore di crescita.
3. Aspirare tutto il mezzo, aggiungere 2 mL di terreno di coltura delle cellule endoteliali senza fattori di crescita (media di fame) in un piatto (controllo), quindi aggiungere 50 ng/mL VEGF in 2 mL di terreno di coltura di fame in un secondo piatto per 7 min.
4. Il mezzo di aspirare e lavare le cellule 2 volte con temperatura ambiente da 10 mL PBS.
5. Garantire le capsule di Petri sono sul ghiaccio e tenerli lì, da questo punto in poi.
6. Aggiungere 250-400 µ l di ghiaccio freddo Lisi buffer (bicina/CHAPS; Vedi Tabella materiali) contenente acquosa proteasi inibitore mix e mix di inibitore di DMSO (inibitori delle fosfatasi; Vedi Tabella materiali) per ogni piatto di 10 cm. Agitare la piastra per garantire una copertura adeguata e tenerlo per 10 minuti in ghiaccio.
   Nota: La concentrazione finale della proteasi e il mix di inibitore di DMSO dovrebbe essere 1 x.
7. Raschiare le cellule dal piatto con un raschietto di cella e il trasferimento ad un tubo di microfuge pre-refrigerati. Pipettare fino e giù 5 volte per lisare cellule.
8. Sonicare brevemente le cellule a 4 ° C. Impostare il sonicatore come segue: numero di cicli = 5, potenza = bassa, su = 5 sec, OFF = 30 s. Questo passaggio è incluso per rompere gli acidi nucleici e non a lisare cellule.
   Nota: Sonicazione deve essere lieve a prevenire la denaturazione delle proteine.
9. Vortice del tubo per 5 s (non continuamente), 2 s in un momento (3 volte) e tenere il ghiaccio.
10. Chiarire lisato mediante centrifugazione a 14.000 x g per 15 min a 4 ° C, quindi immediatamente trasferire il surnatante in una provetta pulita microfuge pre-refrigerati.
11. Misurare la concentrazione di proteine utilizzando un acido bicinconinico (BCA) protein assay kit⁴.
12. Aliquote di marca 10 µ l, snap congelare in ghiaccio secco o azoto liquido e conservano a-80 ° C fino all'utilizzo.

2. Mix preparazione del campione (calcolo per 150 µ l del campione Mix)

1. In primo luogo, preparare una miscela di diluente del campione aggiungendo 1 µ l di miscela di inibitore di DMSO (stock 50 x) e 2 µ l di inibitori della proteasi (stock x 25) a 47 µ l di diluente del campione (Vedi Tabella materiali), cosicché la concentrazione finale di DMSO inibitori e inibitori della proteasi diventa 1 x. Successivamente, diluire i lisati di proteine utilizzando la combinazione di diluente del campione per ottenere la concentrazione desiderata (Vedi punto 2.3).
2. Preparare la miscela di inibitore di anfolita/scala/proteasi inibitore/DMSO aggiungendo 3,325 µ l standard della scala (Vedi Tabella materiali; stock x 60), 6 µ l di inibitore della proteasi (25x), 3 µ l di DMSO (50x) inibitore per premix di anfolita 137.675 µ l (Vedi tabella di Materiali). Vortice il tubo almeno 15 s totale, 5 s alla volta (3 - 4 volte) e tenere il ghiaccio.
3. Mescolare le soluzioni da punti 2.1 e 2.2 in un rapporto di 1:3, in modo che le concentrazioni finali di DMSO, inibitori della proteasi e la scala standard pI diventano 1 X, e le proteine nel capillare raggiungono le concentrazioni finali di desiderata (ad es., 50 µ g/mL è stato utilizzato per Figura 2).
   Nota: La concentrazione di proteine nel capillare e ben sono gli stessi.
4. Caricare 10 µ l di miscela del campione nel pozzetto corrispondente, secondo il layout del modello saggio piastra 384 pozzetti (vedere il passaggio 3 e Figura 1) e mantenere la piastra sul ghiaccio.
5. Diluire il primario (pERK1/2, 01:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) e anticorpi secondari (1: 300) con diluente dell'anticorpo (Vedi Tabella materiali) e Pipettare 10 µ l di primario e 15 µ l di anticorpi secondari in ogni pozzetto.
   Nota: In generale, una maggiore concentrazione di anticorpi sono necessari per saggi cIEF rispetto ai convenzionali western blot.
6. Mescolare il Luminol e perossido XDR (rapporto 1:1; Vedi Tabella materiali) insieme e pipettare 15 µ l in ogni pozzetto.
   Nota: Mescolare queste soluzioni fresco ogni volta prima dell'uso e tenere sul ghiaccio.
7. Una volta che i campioni e tutti i reagenti sono pipettati nella piastra, centrifugare la piastra a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C per rallentare il liquido e rimuovere le bolle. Se le bolle esistono ancora, è possibile rimuoverli manualmente utilizzando un sottile puntale.
   Nota: Non caricare più di 20 µ l di campione o reagenti per pozzetto; in caso contrario, la pipetta di strumento non può essere lavata correttamente. Assicurarsi di seguire il manuale di istruzioni del produttore per preparare tutti i reagenti.

3. progettazione di un nuovo modello di analisi con Software di sistema (Figura 1)

1. Aprire il software di sistema e fare clic su "nuovo" dal menu File.
2. Vai al riquadro layout e assegnare posizioni per reagenti e campioni in una piastra a 384 pozzetti. Utilizzare fino a un massimo di 96 pozzetti per piastra 384 pozzetti.
3. Effettuare un'assegnazione di reagente cliccando ovunque un pozzo nel blocco. Selezionare un blocco di riga di 12 pozzetti ciascuna. Pozzi, ad esempio, da 1-12 o 13-24, sono assegnati come un blocco per impostazione predefinita.
4. Vai alla barra degli strumenti del riquadro di layout e inserire un blocco di riga vuota o un campione primario, secondario o, luminol blocco di riga. Ogni blocco viene assegnato un colore diverso, quindi sono facili da distinguere.
   Nota: Quando si clicca un pozzo, può essere visto un bordo nero intorno all'isolato dove il nuovo blocco verrà inserito nel riquadro. Un blocco di riga può anche essere eliminato.
5. Vai al riquadro di protocollo e selezionare una posizione di reagente nella piastra. Fare clic su una cella nella colonna di esempio, quindi selezionare il reagente dal menu a discesa.
6. In questo stesso modo, selezionare le posizioni di reagente per il primario, secondario e il luminol per ogni ciclo.
7. Fare clic sulle celle, uno alla volta, nella colonna dell'anticorpo primario o secondario e modificare i tempi di incubazione, se necessario.
   Nota: Note di voce per ogni ciclo possono anche aggiungersi.
8. Aggiungere cicli facendo clic sul pulsante 'Aggiungi' nella sezione protocollo. 1 ciclo, 4 cicli o tutti i cicli (un massimo di 8 cicli può essere aggiunto al protocollo).
   Nota: È possibile copiare e incollare informazioni di ciclo in questo passaggio: selezionare un ciclo, andare a modificare, copiare e incollare.
9. Immettere le informazioni relative al campione, quali l'identità degli anticorpi primari e secondari, i loro numeri di catalogo e diluizioni, ecc., nel riquadro modelli. Si tratta di un passaggio facoltativo che è utile durante l'analisi post-esecuzione.
10. Salvare il nuovo file di analisi. Prima di cliccare sul pulsante 'start', verificare rapidamente il layout per assicurarsi che tutto sia corretto.

4. protocollo per cIEF impostazione dello strumento

1. Impostare l'elettroforesi capillare di messa a fuoco isoelettrica condizioni di separazione. Questi dovrebbero essere 15.000 µW e 40 min, e il tempo di immobilizzazione UV dovrebbe essere 80 s. Tuttavia, il tempo di immobilizzazione UV può essere impostato all'interno della gamma di 80-140 s e potrebbe essere necessario essere ottimizzato per la proteina di interesse.
   Nota: Un punto di tempo per l'immobilizzazione di UV può essere impostato per ogni ciclo, ma non per ogni capillare.
2. Set di lavare 1 o 2 lavaggi, per 150 s ogni lavaggio (impostazione predefinita) e l'incubazione anticorpo primario per 120 min.
3. Lavare insieme 2 a 2 lavaggi, per 150 s ogni lavaggio (impostazione predefinita) e l'incubazione di anticorpo secondario per 60 min.
4. Impostare il lavaggio 3, che dovrebbe essere 2 lavaggi, per 150 s ogni lavare (impostazione predefinita).
5. Impostare tempi di esposizione quando verrà rilevata chemiluminescenza; Questi dovrebbero essere 30, 60, 120, 240, 490 e 960 s. Tutti i passaggi (1-8) si svolgerà in un singolo vaso capillare.

5. eseguire il File di test

1. Una volta che tutto è pronto, fare clic su start per iniziare la corsa. Il software vi chiederà di rimuovere i rifiuti, per riempire l'acqua e la casella capillare, per aggiungere anolyte e catolita il vassoio di risorsa, per aggiungere tampone di lavaggio e infine per caricare la piastra nel vassoio di campione raffreddato.
   Nota: Rimuovere il coperchio dalla scatola capillare, ma non rimuovere il coperchio dalla piastra di dosaggio. Il coperchio dalla piastra possa essere rimosse automaticamente dallo strumento quando necessario. Questo aiuta a prevenire l'evaporazione di reagente.
2. È stato avviato un paio di minuti dopo la corsa, una barra di stato dello strumento verrà visualizzata sullo schermo del computer. Messaggi di stato e barre di avanzamento possono essere visto corrispondente alla fase corrente dello strumento.
   Nota: Inizialmente, lo strumento verificherà se tutto è corretto prima di procedere alla dispensazione il anolyte e catolita nel vassoio di separazione, raccogliendo il primo blocco di 12 capillari, rimuovendo il coperchio della piastra e ponendo i campioni dal campione piastra in capillari e poi finalmente nella camera di separazione per elettroforesi.
3. Fare clic sullo schermo di riepilogo run per vedere due riquadri: lo stato e la separazione. Gli utenti possono visualizzare l'avanzamento dell'esecuzione, e film della separazione (12 capillari di ogni ciclo) possono essere memorizzati quando è stato completato il passaggio di elettroforesi di ogni ciclo. Per osservare la separazione di elettroforesi in maniera capillare, è possibile riprodurre il filmato di separazione per quello vaso capillare facendo clic sul pulsante Riproduci nel pannello di controllo, quindi il ciclo desiderato.
4. Il file di esecuzione possa essere salvato automaticamente al completamento della corsa.

6. analizzare i dati (Figura S1)

1. Aprire il file run e selezionare la scheda schermo di analisi. In Figura S1A, i dati visualizzati (cime) del grafico di esempio è dal capillare selezionato (cioè, 4^th capillare dal ciclo 1).
2. Fare clic su modifica e quindi l'analisi (Figura S1B). In questa fase, gli utenti possono modificare l'intervallo di pI, applicare lo standard pI appropriato per un determinato esperimento, aggiungere una misura di picco e aggiungere il nome di una vetta.
   Nota: Quando usando un anfolita pH 5-8 della premiscela (come è il caso qui), la scala standard consigliata da utilizzare è uno con peptidi fluorescente contrassegnati con pIs di 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 e 7.3, e quando si utilizza un pH 3-10 premix, la scala consigliata è uno con pIs di 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 e 7.3. ²
3. Risultati sono visualizzati nella scheda picchi; i valori visualizzati per i campioni sono posizione, pI, picco altezza e Area, % Area, picco larghezza e segnale-rumore (S/N) (Figura S1C). Scegliere quali dati utilizzare ed esportare i dati per ulteriori analisi.
   Nota: I dati possono essere esportati solo dopo l'etichettatura il picco (Figura S1C).

Risultati

Design di un nuovo dosaggio: Un layout di piastra di dosaggio è mostrato in Figura 1A. Al massimo, 96 pozzetti possono essere utilizzati dalla piastra 384 pozzetti in blocchi di 12 pozzi per ogni condizione (anticorpo). Ogni blocco di 12 pozzi può iniziare da A1-A12 o A13-A24. Righe di colore codificate permettono di distinguere i campioni o i reagenti uno da altro. Nel modello di analisi (Figura 1B), le inform...

Discussione

Sensibilità e risoluzione delle proteine sono fondamentali per la ricerca di proteomica su campioni biologici. C'è grande valore nell'essere in grado di rilevare le proteine che sono presenti in piccole quantità nelle cellule. cIEF in grado di offrire una migliore sensibilità e risoluzione per la rilevazione di proteine e loro isoforme⁴.

Questa tecnologia è stata utilizzata con successo in molti proteomica research report^5,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
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