Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit soll eine neuartige Methode, um die Fähigkeit von einigen immunmodulatorischen Molekülen wie antimikrobielle Peptide (AMPs), Förderung der Zellwanderung bewerten zu zeigen. Wichtiger ist die Zellwanderung eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Heilung von Wunden, die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung wieder herzustellen. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der klassischen Test, basiert auf einen manuell gemacht Kratzer in einer Zelle monomolekularen Film, ist, dass die Verwendung von speziellen Silikon Kultur fügt mit zwei Fächern um eine zellfreie Pseudo-Wunde Feld mit einer klar definierten Breite (500 μm zu erstellen ). Durch eine automatisierte Analyseplattform ist es darüber hinaus möglich, quantitative Daten über die Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration schnell zu erhalten. Genauer gesagt, wird die Wirkung von zwei Frosch-Haut-AMPs auf die Migration der bronchialen Epithelzellen angezeigt. Darüber hinaus wird Vorbehandlung dieser Zellen mit spezifischen Inhibitoren auf die molekularen Mechanismen, die solche Ereignisse informieren.

Einleitung

Es ist weitgehend bekannt, dass die Wundheilung bei Tieren ist ein fundamentaler Prozess die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung¹wieder herzustellen. Trotz epithelialen Oberflächen der äußeren Umgebung (z. B. der Atemwege, Haut und Magen-Darm-Trakte) bilden eine schützende Barriere von physikalischen und chemischen Beleidigungen, die Bildung von Wunden kann leicht auftreten, vor allem nach Chirurgie oder mikrobielle Infektionen². Wie beispielsweise Besiedlung des Lungengewebes durch opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas Aeruginosa, vor allem bei zystischer Fibrose (CF) erkrankten führt um zu Schädigungen der Atemwege Epithel mit daraus resultierenden Atemstillstand^{3, 4}. Wundheilung ist eine komplexe Host-Repair-Mechanismus zur Wiederherstellung der normalen Architektur von einem verletzten Gewebe⁵. Es zeichnet sich durch eine anfängliche Entzündung, gefolgt von einer Regenerierung umfasst Epithelisierung, Angiogenese und Gewebe Umbau mit Produktion von Kollagen und Zelle Differenzierung^6,7,8 . Epitheliale Integrität sicherzustellen und mikrobieller Vermehrung kontrollieren, produzieren alle lebenden Organismen Verteidigung Moleküle, einschließlich antimikrobielle Peptide (AMPs)^9,10. Die Wundheilung ist sehr schwierig, in-vitro- aufgrund des Fehlens von Zellenrückstand und komplexen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen zu simulieren. Aber die in-vitro- Fähigkeit eines Peptids durch die Stimulierung die Schließung einer Pseudo-Wunde beschleunigen Migration von Epithelzellen ist bezeichnend für seine Fähigkeit zu heilen eine kompromittierte Epithel. In der Tat Zellwanderung ist eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Wundheilung, und Studium der Faktoren, die Zellwanderung beeinflussen können Ziel Therapien für eine verbesserte Wundheilung hilft.

Hierbei ist ein hoch reproduzierbarer experimentelle Assay vorgesehen, basierend auf Spezialsilikon Kultur Einsätze, Zelle Migration in Vitrozu bewerten. Es basiert auf der Schaffung einer 500 μm Lücke (Pseudo-Wunde) auf einer Monoschicht konfluierende Zelle. Die Zellen am Rand des Feldes künstliche "verletzten" startet in den zellfreien Bereich Migration, bilden neue Zell-Zell-Kontakte. Die Kultur einfügen stellt ein neues Tool für schnelle Wundheilung Experimente. Zwei Stauseen, die durch eine 500 μm Wand getrennt werden, und sie können richtig platziert werden, in einem 3 cm Schüssel Teller oder in den Brunnen von einem 12-Well-Platte. Jedes Fach des Einsatzes mit einer Zellsuspension füllen kann Zellen wachsen in jedem ausgewiesenen Bereich bis zum Zusammenfluss, während Entfernung des Einsatzes eine saubere zellfreie Lücke von etwa 500 μm (die gleiche Breite wie die Trennmauer) zu erzeugen. Eine ordnungsgemäße Zellkulturmedium, ergänzt mit einer Testverbindung können dann hinzugefügt werden, in die Schüssel Teller/gut. Danach kann der Lückenschluss in unterschiedlichen Zeitabständen unter einem inversen Mikroskop, vorzugsweise eine, die mit einer Videokamera ausgestattet, für die Bildaufnahme visualisiert werden. Schließlich ermöglicht die Messung von Veränderungen im Bereich Zelle abgedeckt durch die Web-basierte automatische Bild-Analyse-Programm die Quantifizierung der Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration. Insgesamt ist diese Methode ein Schritt nach vorn in Bezug auf die klassische Assay, wo ein Kratzer erfolgt manuell durch Eingrabung konfluierende Zelle Monolagen mit einer sterilen Nadel oder eine Pipette Tipp¹¹. In der Tat das letzte Verfahren zu zerstören die Kunststoff Boden der Schale Platte/gut und die Oberflächenbeschichtung, Falten zu schaffen. Darüber hinaus muss die "Verletzte" Bereich keine klar definierte Breite über die gesamte Länge der Lücke, da dies stark von den Forschern auf die Nadelspitze ausgeübte Druck abhängig. Darüber hinaus können die verdrängt Zellen an den Rändern des Kratzers Klumpen von lebenden und toten Zellen bilden; Darüber hinaus kann die Verbreitung von lebenden Zellen in den "verletzten" Bereich mit einer Geschwindigkeit von Zellwanderung, Generierung von nicht reproduzierbaren Ergebnisse¹²stören.

Darüber hinaus durch ein Rubbellos Bild-Analyse-Plattform erhalten schnell (innerhalb von Minuten) quantitative Daten über das Wanderungsverhalten der markierten Zellen ohne die Notwendigkeit, zusätzlichen Software zu erwerben Anwender. Diese Plattform ist geeignet zur Analyse von Kontrast Mikroskopie Phasenbilder niedrig (~ 5 X), Medium (~ 10 X) und hoch (~ 20 X) Vergrößerung. Nach dem Hochladen einer Zip-Datei von Bildern (in *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.GIF, *.tiff Format) wird automatisch die Analyse durchgeführt, um eine Übersichtsdatei zu generieren, die den Prozentsatz der Zelle bedeckten Gebiete und Kratzer Gebiete sowie die Geschwindigkeit der Zelle zeigt Migration, in unterschiedlichen Zeitabständen.

In dieser Arbeit mithilfe ein Frosch-Haut AMP-Derivat, d. h. Esc(1-21) und seine Diastereomer Esc(1-21) - 1 c-¹³und eine bronchiale Zell-Linie mit dem Ausdruck der funktionalen CF transmembranen Leitwert Regulator (CFTR)^14,15, ein Beispiel für Peptid-induzierte Zellwanderung im Vergleich zu unbehandelten (Kontrollproben) wird zur Verfügung gestellt. Beachten Sie, dass die Atemwege Epithel und CFTR eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der Lungenfunktion und Wunde Reparatur¹⁶. Darüber hinaus beinhaltet ein Beweis, dass die vorgenannten Peptide Migration bronchiale Zellen verursacht durch selektive Inhibitoren (z. B. AG1478)¹⁷ der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), Aktivierung des EGFR^{12, 18} berichtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen soll das Ziel dieses Verfahrens zeigen, wie die Verwendung von solchen Silikon-Kultur-Einsätze stellt eine schnelle und leicht erreichbare-Assay, Migration von adhärenten Zellen (z. B. bronchialen Epithelzellen) und der molekularen genau zu bestimmen Mechanismen, die solche Ereignisse zu kontrollieren.

Protokoll

1. Zelle-Vorbereitung

1. Samen 2.5x10⁶ Zellen in 10 mL von Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 2 mM Glutamin (MEMg), plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Antibiotika (0,1 mg/mL Penicillin und Streptomycin) und Puromycin (0,5 µg/mL für die Auswahl und Pflege der Zelllinie) in einem Kolben T75. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO₂ , für 2 Tage. Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments, Zusammenfluss von Zellen unter einem inversen Mikroskop.
   Hinweis: Für das Experiment verwendeten Zellen sind unsterblich menschlichen bronchialen Epithelzellen mit einem Lentivirale Vektor verleiht Resistenz gegen Puromycin ausgestrahlt. Sie drücken stabil eine funktionelle CFTR-^14,15.
2. Sobald die Zellen Zusammenfluss 90-100 % erreicht hat, aspirieren Sie das Medium aus der Flasche und entsorgen Sie es in einer Abfallflasche unter eine biologische Kabinett Schutzklasse II. Waschen Sie die Zellen mit 6 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (CMF-PBS). Sanft den Kolben manuell rock und CMF-PBS zu verwerfen.
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht die Zelle monomolekularen Film mit der Pipette zu berühren.
3. 10 mL der CMF-PBS und inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 10 min.
4. Aspirieren Sie CMF-PBS und entsorgen. Fügen Sie 2 mL Trypsin/EDTA in den Kolben.
5. Schütteln Sie die Flasche, so dass die Lösung komplett Beschichten der Zellen, und den Kolben bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 10 min inkubieren, bis die Zellen unter dem Mikroskop sichtbar gelöst werden.
   Hinweis: Am Ende der Inkubationszeit sollte die Zellen abgerundet und nicht an der Kunststoffoberfläche angezeigt. Wenn die Zellen nicht gut gelöst sind, kann die manuelle Erregung notwendig sein.
6. Fügen Sie 10 mL MEMg zuzüglich 10 % FBS Trypsin zu inaktivieren und die Zellen durch Waschen der Unterseite des Kolbens zu sammeln. Übertragen Sie die Lautstärke in einem konischen 50 mL-Tube.
7. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 80 X g.
8. Den Überstand abgesaugt und erneut aussetzen der Zellen in 6 mL MEMg zuzüglich 10 % FBS. Pipette wiederholt, bis Klumpen zu brechen.
9. Nehmen Sie 10 µL Zellsuspension mit einer Mikropipette und injizieren Sie die Lautstärke unter dem Deckglas zuvor über eine Burker oder Neubauer Kammer gestellt.
10. Zählen Sie die Anzahl von Zellen.

(2) Zellen in der Kultur Aussaat fügt

1. Übertragen Sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte die Kultur-Einlage mit einer sterilen Pinzette (Abbildung 1). Benutzen Sie eine Pinzette, um an den Rändern der Einsätze zu drücken, um sie an die Oberfläche der Platte zu beheben.
   Hinweis: Einsätze haben eine klebrige Unterseite, die Adhäsion ermöglicht.

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Silikon Kultur Einsätze, in Vertiefungen einer 12-Well-Platte richtig setzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Richtig verdünnen die Zellsuspension in MEMg zuzüglich 10 % FBS. Jedes Fach des Einsatzes mit 70 µL Zellsuspension (ca. 3.5x10⁴ Zellen/Kammer) füllen.
   Hinweis: Die Dichte der Zellen in jedem Fach Angewandte richtet sich nach der Art der Zellen. Es wird empfohlen, eine Zelldichte verwenden, das führt zum Zusammenfluss innerhalb von 24 h zu vervollständigen.
3. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass Zellen nicht von der einfügen-Fächer undicht sind und inkubieren Sie die 12-Well-Platte für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO₂.

(3) Pseudo-Wunde heilende Assay

1. Visualisieren Sie nach der Inkubation die Zellen unter der inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass konfluierende Zelle Monolagen gebildet haben.
2. Wieder aussetzen Sie Testverbindungen (z. B. Ampere) in 1 mL MEMg.
   Hinweis: Bereiten Sie frische AMPs Verdünnungen ab der Stammlösung bei-20 ° c gelagert
3. Entfernen Sie vorsichtig die Einsätze von sterilen Pinzette. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zelle Monolagen zu brechen. Die Einsätze auf saugfähigem Papier zu übertragen.
   Hinweis: Um die gleichen Einsätze wiederzuverwenden, Sterilisieren sie in 70 % igem Ethanol für mindestens 3 h. Es wird empfohlen, anschließend wegwerfen.
4. Um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL MEMg pro nun mit einer Mikropipette. Schließen Sie die Platte und schütteln Sie es.
   Hinweis: Fügen Sie Medium direkt auf Zelle Monolagen um ihre Störung zu vermeiden.
5. Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es mit 1 mL MEMg pro Bohrloch. Schließen Sie die Platte und visualisieren Sie die zellfreie Lücken (erstellt durch die Einsätze) unter den inversen Mikroskop bei 4 X Vergrößerung mit einer Videokamera ausgestattet. Bilder zum Zeitpunkt Null (T0) zu erwerben und in ein JPG-Format abspeichern.
6. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen, mit 1 mL PBS waschen und entsorgen.
7. Die Brunnen fügen Sie der Testverbindungen (vorbereitet in Punkt 3.2 hinzu). Hinzugeben Sie für unbehandelten Kontrollproben 1 mL MEMg. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO₂.
8. Nach 15, 20 und 24 h Behandlung beobachten die Zellwanderung unter dem Mikroskop bei 4 X Vergrößerung und Abrufen von Bildern.
   Hinweis: Bei diesem Schritt versuchen Sie, Bilder in den gleichen Bereichen wie für T0 zu erfassen. Die Wahl von Zeitintervallen die Aufnahmen hängt von der Zelle Migration Geschwindigkeit.
9. Um die Wirkung von einigen selektive Inhibitoren zu untersuchen, Aspirieren d. h. AG1478, auf Zellwanderung, des Mediums aus jedem Einsatz Fach vor dem Entfernen Einsätze.
   1. Waschen Sie jedes Fach mit frischen MEMg und füllen Sie ihn mit 70 µL MEMg AG1478 ¤ nzt.
   2. Nach 30 min Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂wie ab Punkt 3.3 beschrieben vorgehen.
      Hinweis: Während der Waschschritt und Vorbehandlung der Zelle Monolagen mit spezifischen Inhibitoren, achten Sie nicht auf die Einsätze zu entfernen.

(4) Bildanalyse

1. Wählen Sie nach Abschluss des Experiments Bilder der repräsentativsten Beispiele der verschiedenen experimentellen Gruppen aus, und erstellen Sie eine Zip-Datei enthält einzelne Bilder bei T0, T15, T20 und T24 h.
   Hinweis: Einzelne Bilder sind in den ausgewählten Zeitabständen für alle Proben genommen. Führen Sie Triplicates für jedes Experiment, die mindestens drei Mal wiederholt wird. Am Ende, für alle experimentellen Gruppen, mindestens 3 Bilder ("a", "b", "C", etc., aus jedem unabhängigen Experiment) zu jedem Zeitpunkt werden analysiert.
2. Laden Sie die Zip-Datei in der Bildanalyse-Software sorgt automatisch per E-mail eine Tabellenkalkulationsdatei Zusammenfassung mit den experimentellen Daten der Zelle abgedeckt und Kratzer (in Prozent) zu den ausgewählten Zeitpunkten.
   Hinweis: Die Anerkennung von der Vorderkante und den Spaltbereich basiert weitgehend auf Kante Nachweisverfahren (zur Ermittlung der Punkte, an denen die Bildhelligkeit stark ändert).
3. Sichern Sie Ihre Daten und sammeln sie. Alle Daten in Bezug auf den Mittelwert zum Zeitpunkt Null zu normalisieren. Berechnen Sie den Mittelwert der normalisierten Daten von allen Wiederholungen auf jeden Zeitpunkt und der relative Standardfehler (SEM). Führen Sie mithilfe von zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) statistische Analyse mit einem richtigen Statistik-Software. Unterschiede zwischen Peptid-behandelten Gruppen und Kontrollgruppen in unterschiedlichen Zeitabständen gelten als statistisch bedeutenden für ein p< 0,05.
4. Plotten Sie die gewonnenen Daten in einem Diagramm als ein Histogramm, das dem Prozentsatz der Zelle bedeckten Fläche von allen Probe Gruppen im Vergleich zu die ausgewählten Zeitabständen zeigt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die heilende Wirkung von Esc(1-21) und Esc(1-21) - 1 c in Bezug auf die Zellaktivität Migration induzierten auf bronchialen Epithelzellen, die mit dem Ausdruck der funktionellen CFTR Wunde zu bestimmen. In diesem Test wurden Kultur Einsätze in Vertiefungen der 12-Well-Platte gegeben und jedes Fach war ausgesät mit 35.000 Zellen in MEMg ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen erreicht komplette Zusammenfluss innerhalb 24 Std. danach, eine 500 μm Lücke wu...

Diskussion

Zellmigration ist ein wesentlicher Prozess in vielen physiologischen und pathologischen Veranstaltungen einschließlich der Wundheilung, Embryonalentwicklung und Krebsmetastasen. Das grundlegende Verfahren zur Zelle Migration in-vitro- Studie beinhaltet: (i) die Schaffung einer Zelle Monolage, (Ii) die Produktion einer Pseudo-Wunde in der konfluierende Schicht von Zellen, (Iii) die Erfassung der Bilder in unterschiedlichen Zeitabständen bis Wunde Schließung erreicht ist , und (iv) die Analyse der Bildfolge um ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimal essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0