Le modèle Pilocarpine d’épilepsie du Lobe Temporal et EEG surveillance d’un système de télémétrie chez la souris

Résumé

Cet article décrit une méthode d’induction d’état de mal épileptique par injection systémique pilocarpine et du contrôle des convulsions récurrentes spontanées des animaux vivants à l’aide d’un système de l’électroencéphalogramme et de télémétrie sans fil vidéo. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie chronique, épileptogenèse et les crises aiguës.

Résumé

Épilepsie du lobe temporal (TLE) est un trouble neurologique commun à l’âge adulte. Pour les études translationnelles d’épilepsie chronique, pilocarpine induite par l’état de mal épileptique (SE) est souvent choisi pour récapituler les convulsions récurrentes spontanées (SRS). Nous présentons ici un protocole d’induction SE par injection intrapéritonéale (i.p.) de pilocarpine et le suivi des chroniques convulsions récurrentes des animaux vivants à l’aide d’un électroencéphalogramme (EEG) système et télémétrie sans fil vidéo. Nous avons démontré des changements comportements notables qui ont besoin d’attention après injection de pilocarpine et leur corrélation avec la perte neuronale hippocampique à 7 jours et la pilocarpine après 6 semaines. Nous décrivons également les procédures expérimentales de l’implantation d’électrodes pour la vidéo et l’enregistrement de l’EEG et analyse de la fréquence et la durée des crises récurrentes chroniques. Finalement, nous discutons les raisons pouvant expliquer pourquoi les résultats attendus ne sont pas atteints dans chaque cas. Ceci fournit un aperçu de la modélisation d’une épilepsie chronique chez les souris et les lignes directrices pour le dépannage. Nous croyons que ce protocole peut servir de référence pour des modèles appropriés d’épilepsie chronique et épileptogenèse.

Introduction

TLE est l’un des plus communs acquis les épilepsies¹. Personnes souffrant d’épilepsie l’expérience des crises récurrentes à la suite des activités neuronales anormales dans le cerveau^2,3. Étant donné que TLE est souvent insoluble, il est crucial de comprendre les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent le développement de l’épilepsie.

Des modèles animaux qui peuvent récapituler les caractéristiques clés de TLE humaine peuvent offrir mieux apprécier physiopathologie TLE, ce qui nous permet de facilement contrôler et manipuler les facteurs critiques épileptogenèse. Parmi eux, S’induite par le chemoconvulsants a été largement utilisé^4,5. Contrairement aux autres modèles de l’épilepsie, telles que la stimulation électrique qui montre sans sclérose hippocampique et SRS robuste^6,7,8, l’injection systémique de chemoconvulsants peut imiter les clinique pathogenèse des ELT humaine, c'est-à-dire, lésions cérébrales initiales, une période de latence et une épilepsie chronique scène manifestant SRS^5,9,10. Par conséquent, cette technique peut être utilisée dans diverses études expliquant les mécanismes de la lésion cérébrale aiguë, épileptogenèse ou suppression de la saisie. En outre, altérations histopathologiques induites par chemoconvulsants sont semblables à ceux observés chez les humain TLE, fournissant une justification supplémentaire pour utilisation de TLE modèles de rongeurs^10,11,12. Notamment, des dommages structuraux impliquant l’hippocampe ont été systématiquement reproduites dans les deux modèles d’acide pilocarpine induite et SE kaïnique. Toutefois, par rapport à l’injection acide kaïnique, le modèle pilocarpine peut produire SRS plus robuste chez les souris, qui peuvent offrir des avantages assez importantes pour l’étude de l’épilepsie chronique lorsqu’on examine la disponibilité large des lignées de souris transgéniques^{5, 13 , 14 , 15}. en outre, la progression de saisie après injection de pilocarpine est généralement plus rapide que dans le modèle acide kaïnique, fournissant des éléments de preuve supplémentaires pour l’utilisation efficace d’un modèle de pilocarpine d’épilepsie.

Ici, nous démontrons une méthode d’induction SE par l’injection intrapéritonéale de la pilocarpine et en effectuant des vidéo et EEG suivi dans l’épilepsie chronique.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université catholique de Corée et ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n° 80-23).

1. SE Induction

1. Acheter souris C57BL/6NHsd mâles de 8 semaines et pèsent chacune des souris. Ensuite, utilisez un stylo marqueur pour marquer les queues des souris pour leur faciliter l’identification durant l’induction SE.
2. Calculer la quantité de bromure de méthyle de scopolamine (scopolamine ; 2 mg/kg), hemisulfate de terbutaline (terbutaline ; 2 mg/kg) et le chlorhydrate de pilocarpine (pilocarpine ; 280 mg/kg) selon le poids de la souris et ajouter une solution saline (0,9 % NaCl, 10 mL/kg) pour faire des solutions.
   Remarque : Par exemple, si le poids de la souris est 25 g, les montants suivants sont appliqués : Scopolamine et terbutaline : 2 mg/kg * (25 g/1 000 g) = 0,05 mg, solution Saline : 10 mL/kg * (25 g/1 000 g) = 0,25 mL, Pilocarpine : 280 mg/kg * (25 g/1 000 g) = 7 mg , Saline : 10 mL/kg * (25 g/1 000 g) = 0,25 mL.
3. Charger le mélange scopolamine et terbutaline dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G. Injecter la solution par voie intrapéritonéale dans chaque souris et puis retournez les souris dans leur cage. À 30 min après l’administration de scopolamine et terbutaline, injecter la solution de la pilocarpine dans chaque souris (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G). Immédiatement après l’injection de la pilocarpine, placez les souris dans un incubateur (28-30° C) pour l’observation.
4. Surveiller attentivement le comportement des souris jusqu'à ce que S’est induite. Si limbiques saisies moteurs correspondant à l’étape 3 ou supérieur selon l’échelle de Racine sont détectés, enregistrer le temps et surveiller les souris pour déterminer si les crises se produisent plus fréquemment. Une fois saisies moteurs continus durent plus de 2 min, placer la souris dans une nouvelle cage à température ambiante et garder le contrôle pendant 3 h déterminer si leurs crises convulsives continuent et S’est induite. Euthanasier les souris qui n’a pas pu entrer SE à environ 2 h après l’injection de la pilocarpine.
   Remarque : Échelle de racine ; étape 1, la bouche et les mouvements du visage ; étape 2, tête, hochant la tête ; étape 3, clonus membres antérieurs ; étape 4, élevage avec clonus membres antérieurs ; étape 5, élevage et tombant avec des membres antérieurs clonus¹⁶. Si la souris n’est pas transférée à la cage à la température ambiante immédiatement après l’induction SE, la souris peut mourir à cause de l’hyperthermie.
5. Résilier comportementales crises aiguës à 3 h après le début SE par l’injection de solution de diazépam (i.p., 10 mg/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G). Faire la solution de diazépam en diluant 5 mg/mL de diazépam pour polyoxyl 10 % huile de ricin hydrogénée 35 en ajoutant une solution saline (i.p., 10 mL/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G).
   Note : solution de huile de ricin polyoxyl 10 % 35 hydrogéné : 1 mL de solution d’huile de ricin hydrogénée 35 polyoxyl + 9 mL de solution saline. Conserver la solution à température ambiante. Par exemple, si le poids de corps de la souris est de 25 g, injecter 250 µL de solution de diazépam : 50 diazepam 5 mg/mL µL + ricin hydrogénée de polyoxyl 10 % 35 200 µL d’huile solution = diazépam de 1 mg/mL 250 µL.
6. Pour les souris de l’imposture, effectuer une injection intrapéritonéale du bromure de méthyle et terbutaline mélange hemisulfate scopolamine (i.p. ; les deux 2 mg/kg, seringue de 1 mL, 10 mL/kg ; aiguille 30 G). 30 min plus tard, injecter la solution saline par voie intrapéritonéale (i.p., 10 mL/kg, seringue de 1 mL ; aiguille 30 G).
   Remarque : Si le poids de corps de la souris est de 25 g, injecter 250 µL de solution saline au lieu de pilocarpine.
7. Après l’injection de diazépam (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G), administrer 1 mL de dextrose 5 % par les souris (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G).
   Note : 1 mL de l’injection de dextrose 5 % donne source d’énergie et d’hydratation qui peut augmenter le taux de survie.
8. Au cours de soins post dans l’incubateur (28-30 ° C), essuyez les sécrétions excessives comme la salive, les larmes et les fèces.
9. Au jour 1 après l’induction SE, peser les souris et gardez-les dans l’incubateur (28-30 ° C) pendant une journée supplémentaire. Au jour 2, après l’induction SE, peser les souris et les retourner à leur domicile cage. Fournir des chow humide afin de faciliter leur récupération.
   Remarque : Dans cette expérience, le taux de mortalité pour C57BL/6NHsd après résiliation SE fut 8,57 % en moyenne (3 sur des 35 souris testés).
10. Mesurer tous les jours du poids corporel des animaux jusqu'à la pilocarpine après 7 jours et injecter les souris avec dextrose 5 % (seringue de 1 mL, i.p. ; aiguille 26 G) lorsque le poids corporel n’a pas augmenté. Cesser de corps poids surveiller quand les souris commencent à reprendre du poids du corps et consommer chow humide sans difficulté à 2 jours après l’injection de la pilocarpine.
    Remarque : Si le poids du corps d’une souris n’a pas augmenté jusqu'à 7 jours post SE, exclure la souris de l’expérimentation et euthanasier de dioxyde de carbone. Selon le fond de la souris, la mort peut occasionnellement survenir ; Cependant, dans le cas de C57BL/6NHsd, moins de 1 % des souris sont morts lors de ces expériences. Avec une survie de plus de 7 jours après l’induction SE, les souris meurent rarement au cours de la période de latence.

2. implantation chirurgicale pour la surveillance de vidéo-EEG

1. Préparer des souris 12 semaines (4 semaines après l’induction SE) pour effectuer l’implantation de télémétrie pour la surveillance EEG.
   Remarque : Calendrier d’implantation peut être modifié selon les fins expérimentales et les souches de souris.
2. Avant la chirurgie, anesthésier la souris avec un mélange (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) solution dissoute dans une solution saline à la dose de 2,5 µL/g de poids corporel (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G). Surveiller la fréquence respiratoire et l’effort respiratoire de la souris à intervalles réguliers (intervalle de 15 minutes maximum) et d’évaluer la profondeur de l’anesthésie par le réflexe de retrait pédale.
3. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec barres d’oreilles et une plaque de morsure et pommade vétérinaire sur les deux yeux pour éviter la cécité.
4. Pour maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie, raser des sites chirurgicaux à l’aide d’une lame de rasoir. Veillez à éviter toute contamination de la fourrure du champ chirurgical. Après le rasage, désinfecter la peau avec solution à 70 % d’éthanol et de l’iode.
   Remarque : La chirurgie doit être effectuée de façon aseptique, porter des gants stériles et masques, à l’aide de matériel stérilisé et des techniques aseptiques.
5. Après la confirmation de la profondeur de l’anesthésie, faire une incision médiane de la peau pour exposer le crâne. Deux bavures percer avec un foret joint à l’appareil stéréotaxique au point de coordonnées de la Bregma dans l’axe antéro-postérieur (AP) : +0,1 mm, axe médio-latérale (ML) : +0,1 mm (référence) et AP : −0, 2 mm, ML : +0,22 mm (cortex pariétal gauche)¹³.
   1. Essuyer la peau avec des swaps de coton imbibé de PBS, suivie de la solution à 70 % d’éthanol et de l’iode. Faire une incision longitudinale au milieu de la tête avec des ciseaux pour exposer le Lambda (le point où se rencontrent la sagittale et la suture lambdoïde), le Bregma (au point d’intersection de la suture coronale de la suture sagittale) et l’emplacement cible.
   2. Identifier des repères anatomiques tels que Lambda et Bregma. Placez la mèche au Bregma et note le X, Y coordonne pour ce point.
   3. Utiliser un cerveau atlas livres ou publié des références pour déterminer les coordonnées appropriées des régions cérébrales pour l’enregistrement de l’EEG. Puis, calculer les coordonnées des vis (référence et enregistrement) en utilisant les coordonnées de Bregma mesuréà étape 2.5.2.
   4. Abaissez lentement la mèche pour faire un trou de trépan en prenant soin d’éviter d’insérer la mèche trop loin à l’endroit où le crâne devient plus mince.
6. Insérer le corps de la monocanal sans fil émetteur EEG derrière la nuque par voie sous-cutanée, placer le flexible conduit près du crâne.
7. Placer une vis inox (2 mm de longueur) dans chaque trou de trépan avec des pincettes et serrez-le à l’aide d’un tournevis par rotation vers la droite. Assurez-vous que la vis n’est pas insérée trop bien profondément par le degré de rotation de la vis de réglage afin d’éviter d’endommager les tissus du cerveau ou de la dure-mère.
8. Dépouillez le manteau isolant 2 mm de l’extrémité du conduit et étirer le fil assez longtemps pour compléter l’arbre de vis pour une bonne connexion entre le fil et la vis. Connectez le fil de référence pour la vis avant et l’enregistrement à la vis dans le cortex pariétal. Ensuite, appliquez un ciment dentaire pour fixer l’ensemble en place sans exposer les parties métalliques.
9. Après avoir vérifié que le ciment dentaire a complètement séché par inspection visuelle, suture de la peau et appliquer la pommade mupirocine topique. Placez votre souris dans une étuve à 30 ° C seul jusqu'à ce qu’il se remet de la chirurgie (environ 30 min). Ensuite, retourner la souris à la cage jusqu'à ce que la surveillance de vidéo-EEG continu commence.
   Remarque : Après l’opération, chaque souris sont injecté (i.p., seringue de 1 mL, aiguille 30 G) avec 5 mg/kg de gentamicine (antibiotiques) et 5 mg/kg de kétoprofène (analgésiques). Animaux doit être surveillés jusqu'à ce qu’elles deviennent pleinement ambulants. Émetteur-implanté les souris ont une période de récupération d’environ 1 semaine.

3. jeux vidéo surveillance EEG et analyse

1. Placer une souris dans une cage individuelle et la cage sur le dessus des plaques de récepteur sans fil où la cage de Faraday est installée pour éviter l’interruption des signaux électriques de toutes les sources dont un ordinateur, lignes ca et récepteurs adjacents.
   Remarque : Consultez le manuel fourni par le fabricant. Il faut éviter les angles morts.
2. Enregistrer l’activité électrique en utilisant le système de télémétrie de vidéo-EEG sans fil.
   1. Ouvrez le logiciel pour l’enregistrement de vidéo-EEG. Cliquez sur « Matériel » puis sélectionnez « Editer la configuration ». Correspondre le récepteur et l’émetteur implanté dans chaque souris. Cliquez sur « Channel configuration » et vérifiez que tous les canaux sont actifs. Cliquez sur « Configuration de la vidéo » pour synchroniser la vidéo avec les données de l’EEG (résolution de 40 x 480 et la cadence de 30,00).
      Remarque : Installez une caméra IP avec la sensibilité élevée s’il est essentiel de recueillir des qualités de bonne image qui identifient les subtils changements de comportement des souris pendant la nuit.
   2. Cliquez sur « Setup » et « P3 setup » pour information animale individuelle d’entrée, une caméra apparié et graphique.
   3. Cliquez sur « Acquisition » et « A/fréquence d’échantillonnage de D » aux fréquences d’échantillonnage d’installation. Cliquez sur « Data set name » pour désigner chaque expérience.
      Remarque : Fréquence d’échantillonnage pour EEG doit être supérieur à 500 Hz. en raison de la grande vidéo et la taille de données EEG, il est recommandé que seuls 24 h de données sont gérées par session plutôt que d’utiliser 2-semaine-enregistrement continu en un seul fichier. Données peuvent être enregistrées séparément à intervalles de 8 heures ou 12 heures en cas de manque de mémoire RAM.
   4. Activer l’émetteur avec un barreau magnétique, puis cliquez sur « Start acquisition » pour recueillir l’enregistrement de vidéo-EEG. Surveiller en permanence la souris par le système de vidéo-EEG pendant au moins 2 semaines.
      Remarque : Chez les souris C57BL/6, SRS a tendance à se produire dans les clusters que dernière environ 5,2 jours et la durée de la période exempte de saisie est d’environ 6,7 jours¹⁷.
3. Déterminer la fréquence des crises et la durée de l’inspection manuelle en utilisant le logiciel d’analyse.
   1. Délimiter la zone montrant SRS et exporter les données pour l’analyse statistique. Soyez prudent d’exclure les artefacts d’EEG qui peuvent être générés par se gratter la tête ou à chiquer ; ils peuvent être supprimés en vérifiant les données vidéo.
      Remarque : SRS est définie comme l’apparition soudaine d’épileptiforme répétitive activité de fortification (≥ 3 Hz) qui continue d’exister pour plus de 10 s. comportements convulsifs peuvent se faire accompagner fréquemment dans un sursaut d’activité de fortification. Crises convulsives-non peuvent démontrer aussi électrographiques activités dopage sans comportements convulsifs. Fin de saisie est définie comme le moment où les pointes de cuisson retournent à activité basale.
   2. Pour l’analyse de la fréquence des crises, divisez le nombre total de cas SRS détectés durant les 2 semaines par le nombre total de jours d’enregistrement pour chaque animal.
   3. Pour l’analyse de la durée de la saisie, mesurer le temps de l’apparition à la fin de l’épileptiforme activités de fortification.
4. Après l’achèvement de l’enregistrement de vidéo-EEG, fixer le cerveau avec 4 % paraformaldéhyde par perfusion de transcardial. Pour anesthésier la souris, injecter une solution (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) dissous dans une solution saline à la dose de 10 μL/g de poids corporel (i.p., seringue de 1 mL, aiguille de 26 G). Une fois que la souris est confirmée pour être profondément anesthésiés, effectuer une perfusion transcardial.
5. Avant d’isoler le cerveau de souris, récupérer l’émetteur de la souris pour être réutilisés après nettoyage.
   1. Enlever le ciment dentaire autour des prospects à l’aide de pinces.
   2. Tremper l’extrémité du conduit avec du ciment dentaire dans l’acétone 100 % jusqu'à ce que le ciment dentaire est dissoute.
   3. Retirer les contaminants des tissus autour de l’émetteur en les rinçant avec de l’eau distillée.
   4. Rincer l’émetteur avec l’éthanol à 70 % pour 3 h et l’air sec il pour le stockage. Immédiatement avant la prochaine utilisation, rincer la vis et l’émetteur avec l’éthanol à 70 %, suivie de l’eau distillée et placez-les dans une solution saline.
      Remarque : Il faut pour éviter de couper les fils souples en décapitant la souris depuis, si les câbles souples sont trop courtes, le bruit dans la prochaine implantation et l’enregistrement de vidéo-EEG peut augmenter.

Résultats

SE réussie peut induire la mort des cellules hippocampiques et SRS (Figure 1 et Figure 2). Nous terminé comportementales aiguës saisies par injection de diazépam à 3 h après le début SE et sacrifié les souris 7 jours ou 6 semaines plus tard.

Pour la surveillance de vidéo-EEG, les souris ont reçu l’implant chirurgie à 4 semaines après SE et cas SRS ont ét?...

Discussion

Cet ouvrage décrit les procédures expérimentales pour l’induction SE et l’évaluation des crises chroniques.

Plusieurs facteurs peuvent affecter l’induction SE réussie. La surveillance comportementale précise selon l’échelle de la Racine est critique pour le développement du SRS. Tête en hochant la tête, clonus du membre antérieur, élevage et en baisse sont les caractéristiques comportementales des crises aiguës se développant en phase SE^4,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
Scopolamine methyl nitrate	Sigma	S2250	Make 10X stock
Terbutaline hemisulfate salt	Sigma	T2528	Make 10X stock
Pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Ketamine hydrochloride	Yuhan corporation
Xylazine hydrochloride	Bayer Korea
Diazepam	SAMJIN
Castor oil (Kolliphor EL)	Sigma	C5135	Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil
Saline	Daihan pharm. Co.
5% Dextrose	Daihan pharm. Co.
Iodine solution (Povidin)	Firson
vet ointment (Terramycin)	Pfizer
Blue Nylon	AILEE	NB617
Mupirocin (Bearoban)	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
Ketoprofen	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
Gentamicin	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL syringe	Sung shim medial Co., Ltd.
26 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30 guage needle	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
Razor blade	Dorco
Drill	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K (speed)
Telemetry video/EEG system	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
Implantable transmitter	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
Screw	Sungho Steel		M1.4, 2 mm length stainless steel
Vertex dental material	Dentimex
Acetone	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
Paraformaldehyde (PFA)	millipore	1.04005.1000	4 %
Sucrose	Sigma	S9378	30 % solution in 0.01 M PBS
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Ethanol	EMD Millipore Co.	UN1170
xylene	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
Acetic acid glacial	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 Clear	Leica biosystems		OCT compound for tissue freezing
DPX Mounting for histology	Sigma	6522
Forceps	Fine science tools	11002-12
Scissors	Solco biomedical	02-2445
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	E51070012