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요약

이 문서에서는 DNA 분리 및 매우 가난한 품질 DNA의 구조를 포함 하 여 식물 표본 상자 물자에서 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축을 위한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다.

초록

Herbaria는 다양 한 생물 학적 연구에에서 사용할 수 있는 공장 설비 재료의 귀중 한 소스. 표 본관 표본을 사용 하 여 샘플 보존 품질, 성능이 저하 된 DNA 및 희귀 표본의 파괴적인 샘플링을 포함 하 여 과제의 번호와 연결 됩니다. 큰 시퀀싱 프로젝트에서 식물 표본 상자 물자를 더 효과적으로 사용 하려면 DNA 고립과 라이브러리 준비는 신뢰할만 하 고 확장 가능한 방법 필요 합니다. 이 종이 DNA 분리 및 높은 처리량 도서관 건설 표 본관 표본에서 개별 샘플에 대 한 수정 요구 하지 않는 대 한 강력 하 고, 시작-투-엔드 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 기존 방법의 낮은 질 건조 식물 재료와 소요 장점에 대 한 최적화, 조직 분쇄 라이브러리 크기 선택, 수정 하 고 낮은 수율 라이브러리에 대 한 선택적 reamplification 단계를 도입 하 여 지어진 다. 낮은 수익률 DNA 라이브러리의 reamplification 샘플 인지할 시퀀싱 바이어스 공통에 대 한 소개 없이 추가 파괴적인 샘플링에 대 한 필요성을 negating 대신할 및 잠재적으로 귀중 한 식물 표본 상자 견본에서 파생 된 구조 수 있습니다. 계통 발생 응용 프로그램입니다. 프로토콜 잔디 종, 수백에서 테스트 되었습니다 하지만 확인 후 다른 식물 계보에 사용 하기 위해 적응 될 것으로 예상 된다. 이 프로토콜 어디 조각 원하는 크기로 범위에 존재 하지 않는, 매우 저하 DNA와 보조 metabolites 일부 공장 설비 재료에 깨끗 한 DNA 분리를 억제 하는 제한 될 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 DNA 분리 및 활성 실습 시간 최소한의 수정만 8 h 13 h 24 샘플 라이브러리 준비 수 신속 하 고 포괄적인 방법을 소개 합니다.

서문

표 본관 컬렉션은 종 및 계통학1,2,3, 인구 유전학4,5, 보존을 포함 하 여 연구에 대 한 게놈 다양성의 잠재적으로 귀중 한 소스 생물학6, 침략 적인 종의 생물학7, 그리고 특성 진화8. 다양 한 종, 인구, 지리적 위치, 및 시간 포인트를 얻을 수 있는 식물 표본 상자 "보물 상자"9 를 강조 표시 합니다. 역사적으로, 표 본관 파생 DNA의 저하 자연 PCR 기반 프로젝트, 종종 높은 복사, 엽록체 게놈 또는 ribosomal의 내부 베낀된 스페이서 (ITS)의 지역 등에 마커를 사용 하 여 연구자를 일하고 방해 했다 RNA입니다. 표본 및 DNA의 품질 보존9,10, 더블-좌초 나누기와 손상의 가장 흔한 형태 되 고, 건조 과정에서 사용 되는 열에서 조각화의 방법에 광범위 하 게 따라 다는 소위 90 %DNA 잠금 업 된 PCR 기반 연구11지 장 있다. 조각화, 외 표 본관 유전체학에서 두 번째로 가장 널리 퍼진 문제는 오염, 그13 endophytic 균 류 파생 된 또는 수집 후 하지만 그래도 표 본관12에 장착 하기 전에 곰 팡이 사후 인수 이 문제 해결된 bioinformatically 바로 곰 팡이 데이터베이스 (아래 참조) 제공 될 수 있습니다. 세 번째, 및 보다 적게 일반적인 문제는 비록 표 본관 표본11(~ 0.03%) 낮은 것으로 추정 된다 시 토 신 탈 (C/G→T/A)14, 통해 시퀀스 수정 이다. 높은 처리량 시퀀싱 (HTS)의 출현, 조각의 문제는 짧은 읽기 및 시퀀싱 깊이12,15, 낮은 질을 가진 수많은 표본에서 게놈 수준의 데이터 수집을 허용으로 극복할 수 있습니다. DNA, 그리고 때로는 심지어 전체 게놈 시퀀싱15허용.

식물 표본 상자 견본 더 자주 사용 되 고 있으며 계통 발생 프로젝트16의 큰 구성 요소. HTS에 대 한 식물 표본 상자 견본을 사용 하 여 현재 도전 개인에 대 한 메서드를 최적화 하지 않고도 충분 한 더블 좌초 DNA 시퀀싱 프로토콜에 대 한 필요한 필수 적절 한 시기에 수많은 종에서 얻는 지속적으로 표본입니다. 이 논문에서는, DNA 추출 및 표 본관 표본 라이브러리 준비에 대 한 프로토콜을 기존의 방법의 활용 및 결과 신속 하 고 복제할 수 있도록 그들을 수정 시연입니다. 이 방법은 완전 한 13 h 8 h 실습 시간, 또는 9 h 실습 시간 때 옵션 reamplification 단계는 필요와 함께 16 h 24 샘플 라이브러리에 견본에서 처리 수 있습니다. 더 많은 샘플의 동시 처리는 달성, 비록 제한 요소는 원심 분리기 용량 및 기술. 프로토콜은 DNA를 전단에 대 한만 전형적인 실험실 장비 (thermocycler, 원심 분리기, 마그네틱 스탠드) 대신 분무기 또는 sonicator, 특수 장비를 요구 하도록 설계 되었습니다.

DNA 품질, 조각 크기 및 수량 표 본관 표본 높은 처리량 시퀀싱 실험에서의 사용에 대 한 요인 제한. 식물 표본 상자 DNA를 분리 하 고 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 만들기 위한 다른 방법을 10 만큼 약간을 사용 하 여 유틸리티를 증명 하고있다 ng의 DNA16; 그러나 라이브러리 준비에 필요한 사이클 그들은 실험적으로 PCR의 최적 수를 결정 해야 합니다. 이것은 된다 허무 다루는 상당히 적은 양의 가능한 더블 좌초 DNA (dsDNA) 때 일부 표 본관 표본 단일 라이브러리 준비에 대 한 충분 한 DNA를 생산. 여기에 제시 된 방법 아무 DNA 라이브러리 최적화 단계에서 분실 된다 그래서 샘플 품질에 사이클의 단일 번호를 사용 합니다. 대신, reamplification 단계 라이브러리 시퀀싱에 필요한 최소 금액을 충족 하지 않는 경우 호출 됩니다. 많은 식물 표본 상자 견본 드물다 고 많은 경우에 파괴적인 샘플링을 정당화 하기 어려운 작은 재료를가지고. 이 카운터, 제시 프로토콜 허용 dsDNA 입력 크기 미만 1.25 ng 도서관 준비 과정, 높은 처리량 시퀀싱 및 표본의 파괴적인 샘플링에 대 한 필요를 최소화에 대 한 실행 가능한 샘플의 범위를 확대.

다음 프로토콜 잔디에 최적화 되었고 비록 우리가 기대 하는 다른 많은 식물 그룹에 프로토콜을 적용할 수 있는 식물 표본 상자 견본에서 다른 종의 수백에 테스트. 그것은 낮은 품질 및 희귀 표본 저장 하는 데 사용할 수 있는 선택적 복구 단계를 포함 합니다. 이상 2 백 표 본관 표본 테스트에 따라,이 프로토콜 표본 낮은 조직 입력 및 품질, 최소한의 파괴적인 샘플링을 통해 희귀 한 표본의 보존에 대 한 허용에 작동 합니다. 여기이 프로토콜 phylogenomics 기반 프로젝트에 대 한 시퀀싱 할 수 있는 높은 품질 라이브러리를 제공할 수 있습니다 표시 됩니다.

프로토콜

1. 시작 하기 전에

  1. 신선한 cetyl trimethylammonium 브 로마 이드 (CTAB) 버퍼17 CTAB, polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100.0 mL 1 M 트리 스 8.0, 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0 280.0 mL 40 mL의 pH 5의 10 g의 20 g을 추가 하 여 확인 M NaCl, 그리고 시 약 물 400.0 mL 함께, 물 1 l 시 약-등급을 사용 하 여 전체 볼륨을가지고. PH 8.0에 조정 합니다.
    참고: 추가 시 약 수에 추가 될 CTAB 개별 taxa에 보조 화합물에 따라. 알 렌 그 외 참조 18 첨가제 시 약의 철저 한 목록에 대 한.
  2. β-mercaptoethanol CTAB 버퍼의 5 mL 당 10 µ L를 추가 합니다.
    참고:이 수 수 50 mL의 일괄에서 준비 및 3-4 주 동안 실내 온도에 저장.
    1. 65 ° C 물 욕조에 CTAB 솔루션을 열.
  3. 박격포와 적어도 20 분 동안-20 ° C에 pestles 진정.
  4. N 2 mL 튜브 x 2의 4 세트를 레이블 (여기서 n = 샘플의 수). 얼음에 레이블이 튜브의 1 세트를 넣어.
  5. 소 프로 파 놀 얼음에 또는-20 ° C 냉장고에 침착 해.
  6. 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 구슬 ( 재료의 표참조), 냉장고에서 제거 하 고 실내 온도 (적어도 30 분)에 equilibrate 수 있도록.
  7. 80% 에탄올을 준비 합니다.
  8. 표 본관 표본 추출에 대 한 선택 하 고 ~ 1 cm2또는 10 mg, 견본, 잎 소재 선호 당 조직의 검색.

2. DNA 추출

  1. 갈아 ~ 1 cm2 미리 표 본관 조직 prechilled 박격포 및 pestles를 사용 하 여. 액체 질소와 30-50 밀리 그램 소독 모래를 추가 합니다. 조직 미세 분말으로 변할 때까지 갈아.
    참고: 10 밀리 그램 또는 더 많은 조직이 바람직합니다, 하지만 덜 또한 경우에 따라 왔다. 액체 질소의 증발, 일단 조직을 완전히 접지 될 때까지 필요에 따라 더 추가 합니다. 세포 및 조직에 대 한 또 다른 일반적인 방법은 비드 때리는의 사용 이다. 그러나,이 방법은이 실험에 사용 된 견본을 위해 잘 작동 하지 발견 됐다.
  2. (더 이상 튜브의 볼륨의 절반을 추가) 하는 두 2 mL 튜브 냉동된 분말을 전송 합니다. 각 관에 따뜻한 CTAB 솔루션의 600 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 역전과 vortexing에 의해 튜브를 혼합.
    참고: 이후 식물 표본 상자 물자의 품질과 수량 종종 낮은, 높은 수익률을 얻을 수 있습니다 두 번 반복에 DNA 격리를 수행.
  3. 1-1.5 h, vortexing 매 15 분을 위한 65 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.
  4. 5 분에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 샘플 분류 관 (~ 500 µ L)의 신선한 세트는 상쾌한 전송. 펠 릿 표준 비 염화 처리 절차를 사용 하 여 삭제 합니다.
  5. 각 관에 RNase A (10 mg/mL)의 4 µ L을 추가 하 고 반전 또는 pipetting으로 혼합. 15 분 동안 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 샘플을 품 어.
  6. 튜브에는 실내 온도 도달 했습니다 일단 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 혼합물의 동일한 볼륨 (~ 500 µ L)를 추가 합니다. 믹스 철저 하 게 아래로 pipetting으로 그리고/또한 반전. 12000 x g 15 분에서 튜브의 신선한 세트를 수성 층 (상위 계층)을 전송 하는 원심 분리기 튜브 (~ 400 µ L) 표시. 염화 폐기물 컨테이너에 유기 레이어를 삭제 합니다.
    참고: 단계 2.6 반복 될 수 있습니다 보조 화합물의 대량으로 예상 되는 경우에 나무 재질.
  7. 24:1 클로 프롬: isoamyl 알콜 혼합물의 동일한 볼륨 (~ 400 µ L)를 추가 합니다. 믹스 철저 하 게 아래로 pipetting으로 그리고/또한 반전. 원심에서 12000 x g 15 분 전송에 대 한 튜브 prechilled, 레이블 튜브 (~ 300 µ L)의 신선한 세트를 수성 층 (상위 계층). 염화 폐기물 컨테이너에 유기 레이어를 삭제 합니다.
  8. 각 튜브를 prechilled 소 프로 파 놀과 아세트산 나트륨 2.5 M의 12 µ L의 동일한 볼륨 (~ 300 µ L)를 추가 합니다. 30-60 분 동안-20 ° C에서 샘플을 품 어.
    참고: 보육 시간 (야간 보육)까지 확장 될 수 있습니다 하지만 DNA 품질 샘플 품 어 더 이상 줄일 것 이다.
  9. 냉장고와 12000 x g 15 분에서 튜브를 제거 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않고 부드럽게는 상쾌한 삭제 원심 분리기 샘플을 가져가 라. 신선한 70% 에탄올 (약 300-500 µ L)으로 서 스 펜 션으로 펠 릿을 세척. 각 배 샘플에 대 한 에탄올을 동반 하나에 두 개의 개별 펠 릿을 통합 합니다.
    참고: 샘플 먼저 에탄올을 사용 하 여 하나의 관으로 통합 해야 하 고 진행. 에탄올과 각 샘플을 따로 세척 필요는 없습니다.
  10. 12000 x g 10 분 제거에서 튜브 원심 고는 펠 렛을 방해 하지 않고 부드럽게는 상쾌한 삭제. 공기 건조는 펠 릿.
    참고: 샘플 수 건조 빨리 건조 열 블록을 사용 하 여 (65 ° C를 초과 하지 않는). 샘플-건조 하지 않는 다는 것을 확인,이 DNA의 최종 수익률을 줄일 수 있다.
  11. 1 x 테의 50 µ L에서 고립 된 DNA를 일시 중단 합니다. 장기 저장을 위한-20 ° C 냉동 고 또는 다음 주에 사용 하기 위해 4 ° C에 저장 합니다.

3입니다. 품질 관리 (QC)

  1. 품질 검사는 agarose 젤을 실행 합니다.
    1. 시 약 급료 물을 사용 하 여 5 l 총 볼륨을 데리고 disodium 소금 54 g 트리 스 베이스, 27.5 g 붕 소 산, 그리고 3.75 g EDTA를 추가 하 여 1 x 트리/Borate/EDTA (TBE) 버퍼를 준비 합니다.
    2. 1의 100 mL를 1 g agarose를 추가 하 여 1 %agarose 젤 준비 x TBE. 아무 agarose 표시 될 때까지 솔루션을 전자 레인지. 0.01% 핵 산 젤 추가 얼룩 ( 재료의 표참조). 그것은 터치에 따뜻한 때까지 플라스 크 쿨을 하자. 교 반에 의해 잘 혼합. Agarose 젤 트레이에 부 어 하 고 그것은 굳은 때까지 앉아 보자.
    3. 샘플의 3 µ L, 시 약 급료 물, 2 µ L 및 염료 로드 x 6의 1 µ L를 혼합. 그들의 순서를 지적 하는 젤 매트릭스에 샘플을 로드 합니다.
    4. 60-70 분에 대 한 샘플에서 실행 60-70 대 이미지 아래 자외선 젤 정확한 노출과 초점.
      얼룩은 일반적으로 DNA 저하를 표시 하는 동안 참고: 분명 높은 분자량 밴드의 존재, 고품질 DNA의 표시 이다. 대부분 표 본관 표본 저하 됩니다.
  2. 실행 dsDNA의 부 량 분석 (재료의 표 참조) 더블의 수량을 결정 하는 DNA를 좌초.
    1. 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 분석을 위해.
      참고: 희석 필요 하지 않습니다 식물 표본 상자 물자의 정량화 분석을 위해 그들은 최소한의 금액에 있을 하는 경향이. 이 단계에서 작은 1.26 ng 총 dsDNA에서 성공적인 라이브러리 만들어졌다.

4입니다. DNA 전단

참고: 이것은 상업적인 더블-좌초 fragmentase의 최적화 된 버전 프로토콜 ( 재료의 표참조).

  1. 얼음 3는 vortexing 후에 장소 dsDNA 조각화 효소 s.
  2. 살 균 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브, 믹스 1-16 µ L 조각화 반응 버퍼의 2 µ L로 DNA를 고립. Nuclease 무료 수를 추가 하 여 총 볼륨 18 µ L을가지고. 추가 dsDNA 조각화 효소와 소용돌이 3 혼합물의 2 µ L s.
    참고: 필요한 DNA의 양은 DNA 농도 (200 ng 총 튜브에 대 한 목표)에 따라 다릅니다.
  3. 8.5 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어. 튜브에 0.5 M EDTA의 5 µ L를 추가 합니다.
    참고:이 단계 마자 잠복기 동안 반응 종료-전단에서 DNA 샘플을 방지를 수행 해야 합니다.

5. 비드 정리

  1. SPRI 구슬 vortexing에 의해 균질.
  2. Nuclease 무료 물 25 µ L을 추가 하 여 50 µ L을 깎인된 DNA의 총 볼륨을 가져와. 깎인 DNA와 섞어 50 µ L를 45 µ L 실내 온도 SPRI 구슬 (90% 볼륨)의 추가 철저 하 게 아래로 pipetting으로 합니다.
    참고: 전체 샘플 볼륨의 90%에서 구슬을 추가 200 기본 쌍 아래 종종 DNA 파편의 작은 제거 수행 됩니다.
  3. 샘플 5 분 자기 접시에 튜브를 넣어 하 고 신중 하 게 5 분 동안 앉아 그들을 품 어 보자 제거와 삭제는 상쾌한.
    참고: 수 그들은 원하는 DNA 표적을 포함 구슬, 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
  4. 마그네틱 스탠드에 튜브를 신선한 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 실 온에서 품 어 s 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다. 공기 튜브의 뚜껑을 열어 마그네틱 스탠드에는 5 분 동안 구슬 건조.
    참고:-비즈를 건조 하지 마십시오. 이 DNA의 낮은 복구 될 수 있습니다.
  5. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 구슬에서 DNA의 0.1 x TE 55 µ L에 elute 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 마그네틱 스탠드에 5 분 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어와 솔루션을 위한 대기 (~ 2 분) 합니다.
  6. 상쾌한의 52 µ L 해 내. 복구 및 라이브러리 준비에 들어가는 초기 농도 확인 하는 샘플에서 DNA 정량화 분석을 실행 합니다.
    참고: 라이브러리 만들어진 총 dsDNA 1.25 미만 추정으로 ng, 그러나 각 케이스 reamplification에 필요 했다.

6. 라이브러리 준비

참고: 이것은 상업적으로 사용 가능한 라이브러리 키트의 수정된 된 버전 ( 재료의 테이블 프로토콜 참조).

  1. 최종 준비
    1. Endonuclease 및 인산 효소, 미행 3 µ L 및 청소, 전단 DNA의 50 µ L를 반응 버퍼의 7 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 거품을 제거 하는 튜브를 회전 합니다.
      참고: 총 볼륨 60 µ L 이어야 한다.
    2. 다음 프로그램 thermocycler 샘플 배치: 20 ° C, 65 ° C에서 30 분에서 30 분 후 4 ° c.에서 개최
      참고: 온수 뚜껑 ≥75 ° C로 설정 했다
  2. 어댑터 결 찰
    1. 어댑터 25-50 배 희석 (작업 어댑터 농도 0.6-0.3 µ M). 튜브를 결 찰 마스터 믹스의 30 µ L, 1 µ L의 결 찰 증강, 및 높은 처리량 짧은 읽기 시퀀싱에 대 한 어댑터의 2.5 µ L를 추가 합니다.
      참고: 총 볼륨 93.5 µ L 이어야 한다.
    2. 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 거품을 제거 하는 튜브를 회전 합니다. 15 분 동안 20 ° C에서 튜브를 품 어.
    3. 3 µ L uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylase lyase Endonuclease VIII의 상업 혼합물의 추가 ( 재료의 표참조) 관에. 총 볼륨 96.5 인지 확인 µ L. 철저 하 게 혼합 그리고 thermocycler는을 사용 하 여 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: 뚜껑은 ≥47 ° c.로 설정 되어야 합니다. 원래 버전의 상용 프로토콜 어댑터 결 찰 단계, 마지막 단계로 구슬 정리 뒤 후 크기 선택이 있다. 높은 수익률을 달성,이 프로토콜의 이러한 단계는 순서를 전환 하 고 마지막 단계로 크기 선택을 구현 합니다.
  3. 효소와 작은 조각을 제거 하는 정리
    1. Vortexing에 의해 자석 구슬 균질.
    2. SPRI 자석 구슬 (80% 볼륨)의 78 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
      참고: 전체 샘플 볼륨의 80%에 구슬을 추가 250 기본 쌍 보다는 작은 DNA 조각을 제거 수행 됩니다. 작은 DNA 파편의 더 엄격한 제거 (i) 잉여 어댑터를 제거 하 고 (ii) 다음 단계에서 더 큰 파편의 확대를 강조 하는 것입니다.
    3. 샘플 5 분 넣어 5 분에 대 한 자기 접시에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 원하는 크기 범위 밖에 DNA를 포함 하는 상쾌한 삭제에 대 한 품 어 보자.
      참고: 수 원하는 DNA 목표를 포함 하는 비즈를 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
    4. 마그네틱 스탠드에 튜브를 신선한 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 실 온에서 품 어 s 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다. 공기 튜브 뚜껑 오픈 마그네틱 스탠드에는 5 분 동안 구슬 건조.
      참고: 구슬 건조 이상 하지 마십시오. 이 DNA의 낮은 복구 될 수 있습니다.
    5. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 0.1 x TE의 17 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 대상 elute 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
    6. 마그네틱 스탠드에 5 분 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어와 솔루션을 위한 대기 (~ 2 분) 합니다.
    7. 15 µ L는 상쾌한의 해 내.
  4. PCR 증폭
    1. 청소 어댑터 출혈 DNA의 15 µ L를 높은 충실도 PCR 마스터 믹스의 25 µ L, 5 µ L의 높은 처리량 짧은 읽기 라이브러리 준비 5' 뇌관, 시퀀싱 및 높은 처리량 짧은 읽기 시퀀싱 라이브러리 준비 3' 뇌관의 5 µ L를 추가 합니다.
      참고: 총 볼륨 50 µ L 이어야 한다입니다.
    2. Vortexing에 의해 잘 혼합. 표 1에 있는 설정을 사용 하 여 thermocycler 샘플 장소: Thermocycler 증폭 설정.
      참고: 많은 사이클 입력된 DNA의 낮은 수량에 따라 필요 합니다.
사이클 단계임시입니다.시간사이클
초기 변성98 ° C30 s1
변성98 ° C10 s12
어 닐 링/확장65 ° C75 s12
마지막 확장65 ° C5 분1
보류4 ° C

표 1: PCR 프로토콜 변성, 어 닐 링, 및 확장 시간 및 온도. 온도 및 시간 시 약이이 프로토콜에 대 한 최적화 했다. 경우에 변경 되는 시 약, 온도 시간 최적화 되어야 합니다 다시.

  1. 원하는 라이브러리 크기에 대 한 크기 선택
    참고:이 구슬 단계 파편 위에 대상 범위를 제거 합니다.
    1. SPRI 구슬 vortexing에 의해 균질.
    2. 실내 온도 자석 구슬의 25 µ L (50% 볼륨)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 샘플 5 분 자기 접시에 튜브를 넣어 하 고 신중 하 게 5 분 동안 앉아 그들을 품 어 보자 제거 하 고 레이블이 튜브의 새로운 세트에는 상쾌한 전송.
      참고:이 볼륨 조정할 수 있습니다 원하는 라이브러리 크기에 따라. 상쾌한 원하는 크기의 DNA 파편을 포함 되어 있습니다. 첫 번째 구슬 외피에 구슬 큰 도서관 파편 바인딩 됩니다. 이 400-600 기본 쌍 범위에서에 초점을 제거 됩니다. 상쾌한 작은 조각을 포함합니다.
    3. 추가할 실내 온도 SPRI 구슬의 6 µ L 상쾌한 및 혼합 철저 하 게 아래로 pipetting으로. 샘플 5 분 자기 접시에 튜브를 넣어 하 고 5 분 동안 앉아 그들을 품 어 보자.
      참고:이 볼륨 조정할 수 있습니다 단계 6.5.2 따라 원하는 라이브러리 크기에 따라.
    4. 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
      참고: 수 원하는 DNA를 포함 하는 비즈를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 두 번째 구슬 외피에 구슬은 왼쪽 후 큰 DNA의 초기 제거 파편 조각에 바인딩 됩니다. 파편의이 세트는 일반적으로 원하는 크기 범위에서.
    5. 마그네틱 스탠드에 튜브를 신선한 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 실 온에서 품 어 s, 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 반복 합니다. 공기 튜브 뚜껑 오픈 마그네틱 스탠드에는 5 분 동안 구슬 건조.
      참고:-비즈를 건조 하지 마십시오. 이 DNA의 낮은 복구 될 수 있습니다.
    6. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 0.1 x TE의 33 µ L에 구슬에서 DNA 대상 elute 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
    7. 마그네틱 스탠드에 5 분 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어와 솔루션을 위한 대기 (~ 2 분) 합니다. 저장용 2 mL 튜브 ( 재료의 표참조)을 전송 하 고 상쾌한의 30 µ L 해 내.
      참고: 라이브러리 장기 저장을 위한-20 ˚C에 보관 될 수 있습니다.
  2. 품질 관리
    1. DNA 라이브러리에 품질 관리 테스트를 실행 합니다. 3.1 및 3.2 단계를 참조 하십시오.
      참고: DNA 라이브러리 96 V에서 젤 ~ 45 분를 실행합니다.
  3. Reamplification 라이브러리: 라이브러리 수량 충분 한 경우.
    참고: 샘플 10 아래 라이브러리 농도와 nM는 다음 단계를 사용 하 여 reamplified 수 있습니다. 낮은 농도 라이브러리의 reamplification 시퀀싱, 실행 가능한 결과 얻을 수 있습니다. 하지만 수집 데이터 (표 3)는 것이 좋습니다이 특정 통계에 대 한 무시할 수 있지만 reamplification 기본 구성 다양성에 겸손 한 변화를 발생할 수 있습니다. .
    1. 10 배 0.1 x TE를 사용 하 여 범용 reamplification 뇌관을 희석.
    2. 낮은 농도 라이브러리의 15 µ L를 높은 충실도 PCR 마스터 믹스의 25 µ L, 희석된 보편적인 reamplification 뇌관 1 (AATGATACGGCGACCACCGA)의 5 µ L와 희석된 보편적인 reamplification 뇌관 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA)의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 총 볼륨은 50 µ L에 있어야 합니다.
    3. Vortexing에 의해 잘 혼합. 표 1에 있는 설정을 사용 하 여 thermocycler 샘플 장소: Thermocycler 증폭 설정
      참고: 사이클의 다 수 입력된 DNA의 낮은 양 때문에 필요 합니다.
    4. 비드 정리
    5. SPRI 구슬 vortexing에 의해 균질. 실내 온도 SPRI 구슬 (90% 볼륨)의 45 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
    6. 5 분 자기 접시에 튜브를 넣어 5 분에 대 한 품 어 샘플을 보자.
    7. 조심 스럽게 제거 하 고 원치 않는 DNA를 포함 하는 상쾌한 삭제.
      참고: 수 원하는 DNA 목표를 포함 하는 비즈를 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
    8. 마그네틱 스탠드에 튜브를 신선한 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 30 실 온에서 품 어 s, 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다.
    9. 공기 튜브의 뚜껑을 열어 마그네틱 스탠드에는 5 분 동안 구슬 건조.
      참고:-비즈를 건조 하지 마십시오. 이 DNA 대상의 낮은 복구 될 수 있습니다.
    10. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 0.1 x TE의 33 µ L에 구슬에서 DNA 대상 elute 고 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
    11. 마그네틱 스탠드에 5 분 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어와 솔루션을 위한 대기 (~ 2 분) 합니다.
    12. 상쾌한의 30 µ L 해 내. 장기 저장을 위한-20 ° C에서 라이브러리를 저장할 수 있습니다.
  4. 품질 관리
    1. DNA 라이브러리에 품질 관리 테스트를 실행 합니다. 3.1 및 3.2 단계를 참조 하십시오. DNA 라이브러리에 대 한 96 V에서 젤 ~ 45 분를 실행 합니다.
      참고: 이중 밴드 젤에 볼 경우 이것은 가능성이 reamplification 단계에서 뇌관 고갈의 결과. 밴드는 6.9, 반복 하지만 표 1에서 묘사 된 PCR 프로그램에서 단 하나의 사이클을 사용 하 여 제거할 수 있습니다.

결과

DNA 분리 및 최종 라이브러리 수율
본이 연구에서는 표 본관 DNA의 고립과 고품질 시퀀싱 라이브러리의 복구에 대 한 프로토콜의 효능은 50 다른 샘플을 사용 하 여 1920 년에서 가장 오래 된와 2012 (표 2)에서 최 연소 시연 했다. 각 샘플에 대 한 약 10 mg의 잎 조직 DNA 격리 사용 되었다. 가능한 경우, 녹색 잎 조직이 선호 했다 그리고 확실 한 곰 팡이 ?...

토론

여기에 제시 된 프로토콜 DNA 고립과 말린된 식물 견본에서 라이브러리 준비 시퀀싱에 대 한 포괄적이 고 강력한 방법입니다. 방법과 그것을 변경 하는 최소한의 필요가 일관성 기반 견본 품질에 큰 표 본관 기반 시퀀싱 프로젝트에 대 한 확장 가능한 그것. 낮은 수익률 라이브러리에 대 한 선택적 reamplification 단계 포함을 낮은 품질, 낮은 수량, 드문, 또는 시퀀싱에 적합 되지 않을 역사적으로 중요...

공개

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

감사의 말

우리는 테일러 AuBuchon-엘 더, 요르단 Teisher, 및 샘플링 표 본관 표본에 크리스티나 Zudock와 미주리 식물원 표 본관 표본에 파괴적인 샘플링에 대 한 액세스에 대 한 감사합니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457748)에서 교부 금에 의해 지원 이었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porcelain
Pestlefisher ScientificS02595porcelain
Centrifuge tubesfisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologiessee text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

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