Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene

Resumen

Las mitocondrias contienen varias enzimas flavin dependientes que pueden producir especies reactivas del oxígeno (ROS). Monitoreo ROS liberación de sitios individuales en la mitocondria es difícil debido a reacciones secundarias no deseadas. Presentamos un método fácil y económico para la evaluación directa de tasas nativas para la liberación ROS con flavoenzymes purificada y microplacas fluorometría.

Resumen

Se ha reportado que las mitocondrias pueden contener hasta 12 fuentes enzimáticas de especies reactivas del oxígeno (ROS). La mayoría de estos sitios incluyen complejos respiratorios dependiente de flavin y Deshidrogenasas que producen una mezcla de superóxido (O₂^{● -}) y peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Cuantificación precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales en mitocondrias aisladas puede ser difícil debido a la presencia de reacciones laterales que también forman O₂^●-/ h₂O₂y sistemas de defensa antioxidantes. Uso de inhibidores no específicos que pueden perturbar la bioenergética mitocondrial también puede comprometer medidas alterando la liberación ROS de otros sitios de producción. Aquí, presentamos un método sencillo para la medida simultánea de H₂O₂ liberación y producción de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) por Deshidrogenasas purificadas flavin-ligado. Para nuestros propósitos aquí, hemos utilizado el complejo de purificado de la piruvato deshidrogenasa (PDHC) y α-cetoglutarato deshidrogenasa complejo (KGDHC) de origen porcino corazón como ejemplos. Este método permite una medida exacta nativas H₂O₂ liberación de las tasas de sitios individuales de la producción mediante la eliminación de otras posibles fuentes de ROS y antioxidante. Además, este método permite una comparación directa de la relación entre la liberación de H₂O₂ y la actividad enzimática y la proyección de la eficacia y selectividad de los inhibidores para la producción de ROS. En general, este enfoque puede permitir la evaluación en profundidad de nativas tasas de liberación ROS para enzimas individuales antes de la realización de experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas o fibra muscular permeabilized.

Introducción

El objetivo final del metabolismo de nutrientes es hacer trifosfato de adenosina (ATP). En células de mamíferos, esto ocurre en las mitocondrias, orgánulos de doble membrana que convierten la energía almacenada en el carbón en ATP. La producción de ATP comienza cuando el carbón es quemado por las mitocondrias formando dos portadores de electrones, NADH y flavin-adenin-dinucleótido (FADH₂)¹. NADH y FADH₂ es entonces oxidado por complejos respiratorios de multi-subunidades I y II, respectivamente, y los electrones liberados se transportaron para el oxígeno molecular (O₂) de terminal del electrón aceptor en el complejo IV¹. La termodinámicamente favorable "cuesta abajo" transferencia de electrones al O₂ en el final de la cadena se acopla a la exportación de protones en la intermembrana del espacio por los complejos I, III y IV. Esto crea un gradiente electroquímico transmembrana de protones (fuerza protón-motriz), una forma temporal de la energía libre de Gibbs que es aprovechada por el complejo V para hacer ATP². Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias no están perfectamente acopladas a la producción de ATP. En varios puntos en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, los electrones prematuramente pueden interactuar con O₂ para formar ROS³. El ROS biológicamente más relevante generado por las mitocondrias son O₂^{● -} y H₂O₂. Aunque O₂^●- a menudo se considera el ROS proximal formado por mitocondrias, ahora es evidente que los sitios de producción forman una mezcla de O₂^{● -} y H₂O₂, que se asocia con el libre los grupos de química radical de flavin prótesis^4,5. En niveles elevados, ROS puede ser peligroso, dañar a los componentes biológicos necesarios para la función de la célula dando como resultado sufrimiento oxidativo⁶. Sin embargo, en bajas cantidades, ROS mitocondriales cumplir funciones vitales de señalización. Por ejemplo, liberación H₂O₂ las mitocondrias se ha implicado en el control de la activación del T-cell, señalización de estrés (p. ej., inducción de vías de señalización Nrf2), la inducción de proliferación celular y diferenciación, señalización de la insulina y liberación, alimentación y comportamiento⁷. Considerables progresos en la comprensión de la función de señalización de ROS. Sin embargo, importantes preguntas permanecen con respecto a que las enzimas de las mitocondrias sirven como las fuentes más importantes y cómo se controla la producción.

Liberación ROS por un sitio de producción depende de varios factores: 1) la concentración de la donación de electrones del sitio, 2) el estado redox del sitio donando electrones, 3) acceso a oxígeno y 4) la concentración y tipo de sustrato de oxidación^{3, 8 , 9}. en las mitocondrias, otros factores como la concentración de NADH y la membrana fuerza potencial también influyen ROS producción^8,10. Por ejemplo, la tasa de O₂●/h₂O₂ producción purificada PDHC o KGDHC aumenta con la creciente disponibilidad de NADH^5,11. En este escenario, los electrones están fluyendo hacia atrás de NADH para el centro de la moda en la subunidad de₃ E de la PDHC o KGDHC, el sitio de O₂^●-/ h₂O₂ producción¹². Asimismo, la disposición de NAD⁺ tiene el efecto contrario, disminuyendo la liberación ROS de KGDHC¹². Así, control entrada o salida de electrones de sitios de producción de ROS puede alterar la cantidad O₂^●-/ h₂O₂ está formado. Por ejemplo, el bloqueo de la subunidad de₂ E de la PDHC o KGDHC con CPI-613, un ácido lipoico analógico, resultados en un casi 90% disminución O₂^●-/ h₂O₂ producción¹³. Resultados similares pueden obtenerse con la química S glutathionylation catalizadores, diamida y disulfiram, que casi abolir O₂●/h₂O₂ producción PDHC o KGDHC a través de la conjugación del glutatión para el E ₂ subunidad¹⁴. La compensación por bloqueo del flujo de electrones a través de la subunidad de₂ E de la PDHC y KGDHC es una disminución en la producción de NADH que disminuye la formación de ROS por la cadena de transporte del electrón (e.g., complejo III). Esto también puede disminuir la producción de ATP por la cadena de transporte de electrones. En general, bloqueo de entrada de electrones a los sitios de producción de ROS puede ser un medio muy eficaz de controlar O₂●/h₂O₂ producción.

Las mitocondrias pueden contener hasta 12 posibles O₂^●-/ h₂O₂ fuentes⁶. La mayoría de estos sitios son el flavin-que contiene las enzimas que generan una mezcla de O₂^{● -} y H₂O₂. Uso de combinaciones de inhibidor y sustrato diferentes han permitido la identificación de que complejos respiratorios y deshidrogenasas mitocondriales sirven de^{alta capacidad O₂●-}/ h₂O₂ formando sitios en diferentes tejidos³. PDHC y KGDHC han demostrado servir de alta capacidad O₂^●-/ h₂O₂ sitios emisores en músculo y hígado mitocondria^13,15. Sin embargo, quedan algunas dificultades en relación con el examen de la O₂^●-/ h₂O₂ formando potenciales de sitios individuales en las mitocondrias y el impacto que tienen sustrato diferentes y combinaciones del inhibidor en las actividades de las enzimas. Esto es debido a la presencia de reacciones laterales no deseadas (por ejemplo, la formación de O₂^●-/ h₂O₂ por sitios con excepción de la enzima de interés), contaminante nutrientes endógenos (p. ej.,grasos ácidos) u organelos (e.g., peroxisomas que también forman O₂^●-/ h₂O₂) y uso de inhibidores que carecen de selectividad, o uso de compuestos que no inhibir totalmente la producción de ROS. Ciertos inhibidores también pueden alterar la bioenergética mitocondrial y la dirección del flujo de electrones, y esto altera la liberación ROS de otros sitios de la producción y confunde los resultados. Tasas absolutas para O₂●/h₂O₂ liberación de sitios individuales en las mitocondrias también son difíciles de cuantificar debido a la alta concentración de O₂^{● -} y H₂O₂ la eliminación de enzimas en el espacio intermembrana matriz. Por lo tanto, eliminación de reacciones concurrentes que pueden interferir con O₂●/h₂O₂ liberación mediciones puede ser útil identificar alta capacidad O₂^{● -}/H₂O₂ formación de sitios.

Aquí, presentamos un método simple que permite el examen simultáneo de O₂●/h₂O₂ producción y formación de NADH deshidrogenasas dependientes de flavina purificadas. Mediante el uso de enzimas purificadas, no deseados ROS formando reacciones secundarias y ROS degradando enzimas pueden eliminarse permitiendo una medida más precisa de nativos O₂^●-/ h₂O₂ tasas de producción para flavoenzymes individual. Este método puede utilizarse para comparar directamente el O₂^●-/ h₂O₂ formando la capacidad de diferentes Deshidrogenasas purificadas o inhibidores específicos del sitio potencial de pantalla O₂^●-/ h₂O liberación de ₂ . Por último, medición O₂^●-/ h₂O₂ y producción de NADH al mismo tiempo permite una evaluación en tiempo real de la relación entre la actividad enzimática y la capacidad de liberación ROS.

Protocolo

1. productos químicos y enzimas purificadas

1. Adquirir los siguientes materiales: PDHC y KGDHC de corazón porcino origen (o de otro flavoenzyme mitocondrial purificado); H₂O₂ (solución al 30%), piruvato, α-cetoglutarato,⁺de NAD, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarosa manitol, HEPES, EGTA, 3-metil-2-oxo-ácido valeriánico (KMV), superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa de rábano (HRP), 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine reactivo (AUR) y el CPI-613.

2. planificación de los análisis y preparación de los reactivos

1. Configurar el ensayo según la tabla 1 en una placa de 96 pocillos.
   Nota: El volumen total para cada reacción es 200 μl. concentraciones de población se ajustan tales que se añade 20 μl del reactivo a cada pocillo. Esto asegura la rápida adición de cofactores y substratos a cada reacción bien antes de comenzar el ensayo.
2. Preparar el tampón de reacción que contiene manitol de 220 mM de sacarosa de 70 mM, 1 mM EGTA y 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl).
   Nota: Esto puede cambiar dependiendo de las propiedades físicas de las diferentes enzimas purificadas.
3. Examinar la KGDHC o la PDHC purificada de contaminación utilizando enzima actividad ensayos^14,16,17 o por el immunoblot o tinción de Coomassie⁵.
4. Preparar todos los reactivos en el tampón de reacción según las concentraciones de la solución de trabajo en la tabla 1.
5. Conservar todos los reactivos como alícuotas de 1 mL a-20 ° C. Tienda piruvato y α-cetoglutarato a-80 ° C en alícuotas de 100 μL para evitar la degradación espontánea debido a la auto oxidación y congelación y descongelación repetida.
6. Prepare el reactivo AUR stock principal en 1 mL de DMSO y luego diluya a 100 μm en buffer de reacción. Almacenar protegido de la luz.
   Nota: Aquí, la solución de trabajo de 100 μm es hecho frescas cada 2 a 3 semanas y protegidos de la luz.

3. configuración de la plantilla de análisis

1. Establecer el procedimiento del ensayo con un lector de microplacas monocromática con capacidades de medición dual.
2. Definir el procedimiento de lectura seleccionando "Protocolo". Haga clic en "Procedimiento".
3. Establezca la "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).
4. Haga clic en "Iniciar cinético" para establecer las condiciones de lectura (figura 1A). Ajustar la hora y el número de experimentos de intervalos de lectura.
5. Haga clic en "leer" (figura 1B).
   Nota: Las muestras se leen desde la posición superior con una ganancia de 50. Tiempo: 5 minutos, leer en intervalos de 30 s. Canal 1: Fluorescencia Resorufin - excitación/emisión = 565 nm:600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Canal 2: NADH autofluorescence - excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm.
6. En "Leer", seleccione pozos para monitor (por ejemplo, A1-A4 y B1-B4).
7. Seleccione "Fin cinético".

4. estándar de curvas

1. Descongelar los reactivos y almacenar en hielo hasta que se necesite.
2. Curva estándar de NADH (figura 2A)
   1. Preparar las soluciones de trabajo de NADH en el intervalo de concentraciones de 0.5 a 10 mM de tampón de reacción.
   2. Añadir 20 alícuotas μl de cada NADH trabajando la concentración de la solución a los pozos que contienen 180 μl de tampón de reacción. La concentración final de NADH en cada bien es de 0.05-1 mM.
   3. Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 376 nm:450 nm, ancho de longitud de onda de 20 nm.
      Nota: Este es un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.
3. Curva estándar de AUR (figura 2B)
   1. Preparar las acciones de trabajo del peróxido de hidrógeno en solución tampón de reacción; valores de las concentraciones entre 200-4.000 nM.
   2. Añadir 120 μl de tampón de la reacción a cada pocillo.
   3. Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 U/mL, concentración final en el pozo = 3 U/mL), 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 U/mL, concentración final en el pozo = 25 U/mL) y 20 μl de AUR (concentración stock de trabajo = 100 μm concentración final en el pozo = 10 μm) para cada bien que contiene tampón de reacción.
   4. Añadir 20 μl de cada H₂O₂ solución stock a cada bien que contenga reactivos tampón y ensayo. El volumen de reacción final es 200 μl y la concentración final de H₂O₂ en cada pozo es de 20-400 nM.
   5. Incubar las placas durante 1 min en el lector de placas a 25 ° C.
   6. Haga clic en "Leer" y sistema de excitación/emisión = 565 nm/600 nm, ancho de longitud de onda de 13,5 nm. Tenga en cuenta que se trata de un extremo de sólo lectura, parámetros cinéticos no son obligatorios.

5. medición O₂ ●/h₂ O₂ liberación y producción de NADH por KGDHC y PDHC

1. Vea la tabla 1 para la orden de adición de los diferentes reactivos, la concentración de cada solución de trabajo y el volumen añadido a cada pozo.
2. Agregar 40 μl de tampón de reacción a cada pocillo. Para los ensayos de uso de KMV o CPI-613, añadir 20 μl de buffer a cada pocillo.
3. Añadir 20 μl de la PDHC o KGDHC (bolsa de trabajo de 1 U/mL, concentración final por pozo = 0,1 U/mL) a cada pocillo.
4. Incubar PDHC y KGDHC a 25 ° C por 2 min.
5. Añadir 20 μl de KMV (bolsa de trabajo = 100 mM, concentración final = 10 mM) o 20 μl de CPI-613 (concentración stock de trabajo = 1,5 mM, concentración final = 150 μm) (tabla 2).
   Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos.
6. Incubar durante 1 min a 25 ° C.
   Nota: Este paso puede ser excluido si no se utilizan inhibidores para los ensayos.
7. Añadir 20 μl de HRP (concentración stock de trabajo = 30 unidades/mL, concentración final en el pozo = 3 unidades/mL) y 20 μl de SOD (concentración stock de trabajo = 250 unidades/mL, concentración final en el pozo = 25 unidades/mL) a cada pocillo.
8. Añadir 20 μl de la coenzima A (concentración stock de trabajo = concentración final de 1 mM = 0,1 mM), 20 μl de TPP (concentración stock de trabajo = 3 mM, concentración final = 0,3 mM) y 20 μl de NAD⁺ (concentración stock de trabajo = 10 mM, concentración final = 1 mM) a cada w ELL.
9. Eliminar el reactivo AUR de la cubierta protectora de papel de estaño y añadir 20 μl a cada pocillo.
10. Añadir 20 μl de piruvato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) en los pocillos que contengan PDHC y α-cetoglutarato (trabajo concentración stock de 1 100 mM, concentración final de ensayos = 0.1-10 mM) a pozos que contienen KGDHC.
11. Haga clic en "Leer" para iniciar la medición cinética.

6. Análisis de datos

1. Mantenga pulsada la tecla 'CTRL' en el teclado y haga clic en la opción de pozos para generar un gráfico que contiene todas las medidas cinéticas correspondientes para canal 1 (Figura 3A).
2. Haga clic en "datos" en el icono Vista en la esquina superior derecha para valores crudos para las unidades de fluorescencia relativa (RFU) medidas en los puntos de tiempo diferentes (figura 3B).
3. Exportar los valores para el análisis (tabla 3).
4. Haga clic en el menú en la parte superior derecha (figura 3B) desplegable "Gráfico" para obtener acceso a valores RFU asociados al canal 2 de la fluorescencia.
5. Repita los pasos 6.1 a 6.3 para el canal 2.

Resultados

Figura 3A proporciona un rastro representativo para la RFU recopilado durante la medición simultánea de la producción de NADH y H₂O₂ por KGDHC purificada. Los datos brutos de la RFU para cada intervalo de tiempo se representan en la figura 3B. Entonces se exportan los datos brutos de la RFU para el análisis. Por extrapolación de curvas estándar presentadas en la figura 2, ...

Discusión

Este protocolo es ventajosa desde, 1) que elimina cualquier competencia reacciones que de lo contrario pueden interferir con la detección de H₂O₂ (p. ej., sistemas antioxidantes u otras fuentes de ROS), 2) ofrece una evaluación directa de la tasa natural de ROS liberar por una deshidrogenasa mitocondrial de flavin-que contiene, 3) permite la comparación del nativo ROS liberar las tasas de dos o más purificaron basada en flavin Deshidrogenasas, 4) puede permitir una comparación directa ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyruvate dehydrogenase complex	SIGMA	P7032-10UN	purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex	SIGMA	K1502-20UN	purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution	SIGMA	HX0640-5	reagent, standard curves
NAD+	SIGMA	N0632-1G	reagent, activity/ROS release assay
NADH	SIGMA	N4505-100MG	reagent, standard curves
pyruvate	SIGMA	P2256-5G	reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate	SIGMA	75892-25G	reagent, activity/ROS release assay
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate	SIGMA	C8754-1G	reagent, activity/ROS release assay
mannitol	SIGMA	M4125-100G	buffer component
Hepes	SIGMA	H3375-25G	buffer component
sucrose	SIGMA	S7903-250G	buffer component
EGTA	SIGMA	E3889-10G	buffer component
KMV	SIGMA	198978-5G	reagent, ROS release inhibitor
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	reagent, ROS release inhibitor
SOD	SIGMA	S9697-15KU	reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase	SIGMA	P8375-1KU	reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader	BioTek Instruments		microplate reader for assays
Gen5 software	BioTek Instruments		software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism	Graphpad software		software, data analysis
Microsoft EXCEL	Microsoft		software, data analysis