生体内でマウスにおける活性酸素種のイメージング創モデル

要約

L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.

要約

活性酸素種 (ROS) の生成は炎症性プロセスの特徴が、過剰な酸化ストレスは広くがん、動脈硬化、糖尿病など様々 な疾患に関与。我々 は以前に核因子 (赤血球由来 2) の機能障害-2 (Nrf2) のような糖尿病患者の創傷処置生理: Kelch 様赤芽球細胞由来蛋白質 1 (Keap1) を信号経路は、皮膚の中にロスが極端に不均衡につながる/。ROS レベルは創傷治癒の進行の重要な指標であるので、具体的かつ正確な定量化技術、貴重です。細胞や組織の活性酸素を測定するいくつか生体外の試金が記載されています。しかし、彼らはのみサンプルあたり 1 つの累積的な測定を提供します。最近では、タンパク質ベースのインジケーターおよびイメージ投射様相の開発独自の時空間解析許可されています。L-012 (C₁₃H₈ClN₄直₂)、ルミノール誘導体の生体内と体外の化学発光の両方に使用できるNAPDH 酸化酵素によって生成される活性酸素の検出。L-012 他蛍光プローブより強い信号を出力し、機密とロスを検出するため信頼性の高いことが示されています。L 012 促進イメージングの時間経過の適用性は、犠牲の必要性を削減し、全体的な研究の動物の数を減らす炎症性プロセスに関する貴重な情報を提供します。ここでは、L 012 促進体内糖尿病マウスを用いたローカル機能不全 Nrf2/Keap1 の切除創傷治癒モデルにおける酸化ストレスを定量化するイメージングを利用したプロトコルについて述べる。

概要

炎症性プロセスによって生成された酸素代謝は細胞成分¹の破壊的な変更と同様、様々 なシグナル伝達カスケードに貢献します。ROS を測定する高感度および特定の技術は、炎症性プロセスを調査し、酸化ストレスの影響を特徴付けるのため重要です。In vivoイメージングは、生体組織の動的空間的および時間的なデータを提供する能力のため貴重です。L-012 はスーパーオキシド陰イオンの高感度は、細胞、組織、および全血^1,2,3,その他蛍光プローブより高い光強度を生成する合成化学発光プローブ⁴. 関節炎、大腸炎の^5,6を含むいくつかの炎症性疾患を研究する生体内イメージング マウスモデルでの正常に採用されています。まだ確立された皮膚創傷治癒モデルで採用される必要があります。生成される活性酸素の測定はさまざまな条件下での創傷治癒の進行を評価するために均等に関連です。感度とこのメソッドの非侵襲的自然治癒マウス モデル間でを研究のための有望な技術になります。

Nrf2 は抗酸化反応といくつか抗酸化酵素⁸のプロモーター領域に一般的な抗酸化剤応答要素 (は) に特異的な転写因子の主要なドライバーです。酸化ストレスのない場合は、Nrf2 は Keap1 は、その後そのユビキチン化と分解を原因によって細胞質内に隔離されます。Nrf2/Keap1 経路の不均衡は、不適切なレドックスの恒常性と酸化ストレスの増加⁹の設定の遅延の創傷治癒過程に関与しています。我々 は以前、Keap1 の抑制が Nrf2 活性の上昇を刺激し、促進することを示されている糖尿病の病理学的皮膚創傷治癒過程の救助傷⁹。

ここで ROS や創傷治癒の間の関連付けを強調するため非常に重要です切除皮膚創傷治癒モデルにおける ROS レベルを測定するイメージング L 012 補助発光を利用するプロトコルについて述べる。この手法は、傷および即時の周囲の内で酸化的負担にリアルタイムの変更を示します。さらに、このメソッドは、介入およびメカニズムの迅速な評価のため、影響を与える酸化還元処理をするをできます。ここで酸化還元の恒常性の回復のための戦略の有効性を評価するのにKeap1 ノックダウンのモデルを使用します。本手法は非侵襲的傷が妨げられるため、同じ動物は組織またはセル lysates に基づいてさらに確証的解析に使用できます。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会のニューヨーク大学医学部によって承認されています。すべてのマウス、障壁の後ろに収容され、すべての要員は適切な個人用保護具を着用します。

1 日 0: 切除創傷治癒のマウスモデルの作製

1. 2% イソフルレンの吸入で、8-12 週間を高齢者、糖尿病 (Lepr^db/db) マウスを麻酔します。確認、適切に麻酔されてそれぞれのマウスを利用してテスト ピンチ足のパッドを使用します。乾燥からの刺激を防ぐためにそれぞれの目に滅菌眼潤滑剤を適用します。イソフルランを使用して動物を麻酔するとき、研究者は制度的獣医職員のガイドラインに従ってください。
2. マウスの重量を量るし、それぞれのマウスの体重を記録します。使用して各動物の血糖値を記録することによって動物の糖尿病の状態を確認します。
3. 手続き型のワークスペースと麻酔機器を消毒します。髪トリマーを使用してマウスの背毛を削除し、過剰な髪を拭くためローションのアプリケーションで続いて。2 回、露出した肌をきれいにするアルコール綿を使用し、乾燥することができます。
4. 老舗切除治癒法^7、8によると滅菌 10 mm 生検パンチを使用して組織層 carnosus を拡張する 2 つの 10 mm 全層傷を作成します。すべて生存外科用滅菌手袋を使用します。オートクレーブ手術および手術のフィールドでのみ開く前にバッグのすべての手術器械。
5. スプリント傷 10 mm 円形開口を持つ 0.5 mm 厚のシリコン シートを使用してを開き、安全な場所を使用してのステントは 4-0 シルクの縫合。
6. 術後、麻酔から動物を取り外し、適切なリカバリを容易にするパッドを加熱。注記のうち、動物の体温低下している最中、動物移動することによって加熱パッドを以前麻酔下の体熱の損失を最小限に抑える。彼らが目を覚まし、モバイルまで動物を監視します。
7. 完全に回復した動物 (術後濃縮のケージの床には、いくつかの食品を確認) 食料と水を含む個々 のケージに戻ります。細断紙タオル 2 週間追加ネスト材料を提供します。有害な相互作用と創傷治癒の状態への変更を防ぐために、他の動物の手術を受けている動物をしない家します。
8. 術後の痛みを軽減するため注入マウス皮下ブプレノルフィン 0.1 mg/kg 体重の 1 日 2 回、すぐに次のプロシージャは、3 日間の開始。

2. 1 日目: Keap1 siRNA の準備

注: は、バイオ セーフティ キャビネット内のすべての治療を準備します。

1. 氷の上の 1.5 mL 遠心チューブに 20 μ M Keap1 siRNA (siKeap1) の 12.5 μ L (250 pmol) で減少血清中の 37.5 μ L を組み合わせることにより siRNA 希釈を準備します。
2. 1.5 mL 遠心チューブにリポソーム ミックスの 25 μ L で減少血清中の 25 μ L を組み合わせることにより、リポソーム希釈を準備します。
3. 50 μ L リポソーム希釈滴 (1:1 巻) に siRNA 希釈の 50 μ L を加え、軽く混ぜます。
4. 室温で 20 分間インキュベートします。
5. 水で 2% セルロース ゲルの 50 μ L を追加し、上下にピペットで穏やかに混合します。
6. ナンセンス siNS (コントロール) とそれぞれの動物の治療や siKeap1 (実験)。ゲルを傷の上に適用されます。手足の可動性を維持するために自由を維持する場所にゲルを維持する透明フィルム ドレッシングで動物の胴体をラップします。

3. 3 日目: L-012 ソリューションの準備

注: は、バイオ セーフティ キャビネットのすべての試薬を準備します。

1. 1.5 mL 遠心チューブに濃度 0.5 mg/100 mL の 1x PBS で L-012 を準備します。
2. 手動で渦遠心チューブ。液体で均等に中断する必要がありますしかし、L-012 は、PBS に完全に溶解しません。注記のうち、不穏な生理学的な電解質バランス注入を避けるために水で L-012 を解散することをしないでください。
3. 27 G の針を用いて 1 mL シリンジにソリューションを転送します。
   注: は光から L-012 ソリューションを保護してください。

4 糖尿病性創傷の 3 日目: In Vivoイメージング

1. 2% イソフルレンの吸入マウスを麻酔します。イソフルランを使用して動物を麻酔するとき、研究者は制度的獣医職員のガイドラインに従ってください。確認、適切に麻酔されてそれぞれのマウスを利用してテスト ピンチ足のパッドを使用します。乾燥からの刺激を防ぐためにそれぞれの目に滅菌眼潤滑剤を適用します。
2. そっと傷を乱すことがなくマウスから透明フィルム ドレッシングを削除します。
3. それぞれの注文にイメージングのチャンバーにマウスを配置します。商工会議所の O₂を適切なレベルを維持するためにイメージング システムの流入および誘導室 O₂レベルを 1.0 L/分に設定します。
4. 生物発光と L-012 化合物の投与前に、のベースライン時の写真のマウスをイメージします。
5. 腹部をアルコール綿で拭いて、乾燥することができます。L-012 ソリューションは 27 ゲージ針を使用して 200 g 体重当たり 5 mg の腹腔内投与を行います。たとえば、体重 20 g のマウス L-012 0.5 mg が表示されます。
6. L-012 注射の直後イメージングの商工会議所のそれぞれの場所にマウスを配置します。4 分間隔で 1 分、60 分のコースにマウスをイメージします。ROS レベルを決定するための関心領域として 10 mm の傷を定義します。
7. 術後、麻酔から動物を取り外し、適切なリカバリを容易にするパッドを加熱。彼らが目を覚まし、モバイルまで動物を監視します。
8. 完全に回復した後、1.6 で説明した同じ術後の濃縮環境を維持する個々 のケージに動物を返します。有害な相互作用と創傷治癒の状態への変更を防ぐために、他の動物の手術を受けている動物をしない家します。

結果

確立された切除傷モデル (図 1 a) によると二国間の傷を作成した後 3 日間糖尿病マウスは、イメージングの商工会議所に配置されます。初期の写真と発光のメジャーがバック グラウンド信号 (図 1 b) を考慮して L-012 の注入前にされます。L-012 ソリューションと腹腔内投与は、マウスが商工会議所の再配置し、ROS が検出され...

ディスカッション

ROS を測定するための一般的な手法は、組織抽出または同様に侵襲的な技術を必要とする複雑なプロトコルによって制限されています。近年、酸化ストレスの測定は、革新的な画像診断装置をそれによって時空間評価^9,10,11に基づいて報告されています。L-012 は、ルミノール、ルシゲニン、MCLA^1,

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer