Оценка влияния нейропротекторной Glycyrrhizae Radix et корневище извлечь с помощью переходных средней мозговой артерии окклюзии мыши модели

Резюме

В этом исследовании мы изменить существующий экспериментальный метод для получения более воспроизводимые результаты, путем создания модели мыши средней мозговой артерии окклюзии (СМАо). Пероральное введение Glycyrrhizae Radix et корневища (GR) метанола экстракт (GRex), после инсульта индукции, значительно сократили объем всего миокарда по сравнению с необработанными контрольной группы.

Аннотация

Ишемии, следуют реперфузии мозгового кровообращения после инсульта приводит к смерти нервных клеток и потере ткани головного мозга. Наиболее часто используемых животных модель для изучения инсульта является средней мозговой артерии окклюзии (СМАо). Предыдущих исследований сообщили различные инфаркте размеры даже когда же экспериментальных животных был использован в аналогичных СМАо условиях. Поэтому мы разработали более экспериментальный метод для устранения этого несоответствия. Мышей были подвергнуты СМАо с помощью нити как непроходимость материал для имитации условий человека инсульта и накаливания толщину был оптимизирован для создать более громкости воспроизводимый миокарда. Мышей, получавших с метанолом экстракт Glycyrrhizae Radix et корневища (GRex) после инсульта индукции показан объем значительно снизилась общая миокарда и увеличение количества живых клеток по отношению к группе управления необработанными. Это изменение экспериментальный протокол успешно и можно воспроизвести продемонстрировано благотворное влияние GRex на ишемического инсульта.

Введение

Повреждения головного мозга, вызванные ишемии и реперфузии мозгового кровотока приводит к смерти клетки нерва и потере ткани головного мозга. Этот тип повреждения головного мозга продолжает увеличиваться с распространением цереброваскулярных заболеваний из-за распространения таких метаболических заболеваний, как ожирение, гипертензия и сахарный диабет^1,2. Абсолютное количество пожилых больных с инсультом резко возросло во всем мире, и стоимость медицинского обслуживания для этих пациентов, которые часто остаются с долгосрочной инвалидности, является тяжелым бременем общества. Таким образом вторичной инвалидности должны быть смягчены как можно больше уменьшить экономическое бремя^1,2.

Наиболее часто используемые грызунов модель ишемии миокарда является средней мозговой артерии (MCA) окклюзии (СМАо), в котором MCA закрыта с силиконовой оболочкой хирургические сшивающие накаливания блокировать поток крови, вызывая ишемического инсульта^{3, 4}. с помощью нити как непроходимость материал позволяет контролировать время окклюзии и постоянство, манипулируя продолжительность интра просветный накаливания вставки.

Предыдущие исследования показали, что даже когда же грызунов СМАо модель используется, общий объем ишемии миокарда колеблется от экспериментов, вызывая низкая воспроизводимость результатов исследований. Чтобы улучшить воспроизводимости, мы оптимизировали Толщина нити мяты, используемых в эксперименте. Результаты предварительного исследования церебрального ишемического периода и индуцированных миокарда, показал ишемического период дольше, чем 60 мин позволила регионе объемные повреждения ткани мозга наблюдается и количественно.

Glycyrrhizae Radix et корневище (GR), также известный как солодка, состоит из сушеных корней и корневищ солодки uralensis и glabra г. Он был использован в китайских и корейских традиционной медицины для различных целей, включая в качестве пищевой добавки и лечебных^5,6,7.

В предыдущем исследовании⁸, предварительной обработки с GR метанола экстракт (GRex) показан эффект анти apoptotic СМАо мышей в том числе значительные предотвращения снижения экспрессии белков B-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2) и Bcl очень большой (Bcl-xL). Это исследование было проведено для улучшения воспроизводимость традиционной модели мыши СМАо путем оценки ее эффективности в определении, если после инфаркта лечение с GRex эффективно сократить объем инфаркте СМАо индуцированной мозгового повреждения.

протокол

Все процедуры с участием животных были утверждены Комитетом по этике Пусанского национального университета (номер официального утверждения, ПНУ-2016-1087). На рисунке 1показан графический обзор этого исследования.

1. Подготовка и администрирование GRex

Примечание: Гр, использованных в данном исследовании был приобретен у коммерческих фармацевтической компании.

1. 200 g гр в 2000 мл метанола и проинкубируйте 5 дней при комнатной температуре (25 ° C).
2. Смесь с помощью фильтр-бумаги с толщина 0,26 мм и 5 мкм поры фильтра, а затем удалить супернатант. Добавлять 1000 мл метанола GR остатков и фильтровать снова.
3. Объединить два supernatants, процеживают через фильтровальную бумагу, сосредоточиться в вакууме и затем freeze-dry остатков для производства GRex.
4. Распустить GRex в диметилсульфоксида (ДМСО), разбавить 0,9% физиологического раствора и процеживают через фильтр шприц 0,45 мкм. Затем настройте конечная концентрация ДМСО < 5%.
5. Администрировать GRex (300 мг/кг массы тела) 1 час после реперфузии СМАо через пероральная затравка. Администрировать ДМСО, разбавленных в физиологического раствора (10 мл/кг массы тела) только к обычной группы и группы управления, соответственно.
   Примечание: Концентрация GRex, используемых в этом эксперименте был определен согласно концентрации, которая была активна через наши предыдущие исследования⁸.

2. мыши модель СМАо

1. Использование самцов мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель и весом 22-25 г. обеспечить всех животных с свободный доступ к стандартным Чоу и воды и дом их в среде с контролируемой температурой (22 ± 1 ° C) и 12 h свет/темно цикла.
   1. Разделите мышей на группы по шесть мышей каждый, которые должны состоять из Шам работает нормальный, контроля и лечения групп GRex.
   2. Выполнять СМАо хирургии (модификация метода Koizumi et al. ⁹) на элемент управления и GRex лечения групп с помощью стерео микроскопа.
2. Побудить ингаляционной анестезии в мышей, с помощью изофлюрановая 2% 70% N₂O и O 30%₂. Анестезия считается достаточным, когда мышь перестает механических раздражитель, применительно к его хвост. Поддерживать температуру тела мышей на 36,5 ± 0,5 ° C, с помощью тела, температура Холдинг одеяло подключен к термометр.
3. Удалить все волосы на груди и шеи мышей после бритья следуют использования удаления волос крем, дезинфекция хирургические сайт кожи с скраб Бетадин, чередующихся с алкоголем за два раза, а затем сделать надрез примерно 2 см длиной, с хирургической лезвие в центре шеи. Тщательно изолируйте левую общую сонную артерию (LCCA), Внешние сонной артерии и ветви внутренней сонной артерии от окружающих соединительной ткани.
4. Перевязать наружной сонной артерии и общей сонной артерии с шовного (4-0 Шелковый шов, половина Хитч узел), временно блокировать поток крови в внутренней сонной артерии во время операции.
5. Вставьте кремния покрытием нейлон шовные (Мононить 8-0, 11 мм) через внутренней сонной артерии на происхождение левой MCA. Отрегулировать толщину кремния покрытием частью накаливания к ряду 0,10-0,12 мм.
6. Измерьте сокращение относительной мозгового кровотока (rCBF) в MCA, с помощью лазерного доплеровского расходомера. СМАо будет подтверждено, когда rCBF поддерживается в < 20% значения состояния покоя во время всего периода ишемического.
7. Исправить вставленной нити в кровеносный сосуд для 2 h, пока закрыта мозговой артерии, а затем аккуратно снять накаливания для восстановления кровотока на 22 h реперфузии. Шовные коже по шитье на 5 мест (3-0 Шелковый шов, две половины hitches узел) и позволить каждой мыши, чтобы пробудить от анестезии.
8. В нормальной группе операция Шам следуя той же процедуре выше (до 2.4), за следующим исключением. Перевязать общей сонной артерии и шовные резаная мышц и кожи.

3. Измерение объема ткани поврежденных мозга

1. После эвтаназии мышей для измерения повреждения головного мозга с CO₂ ингаляции акцизных мыши мозги 24 ч после начала СМАо, используя Ножницы хирургические Ирис и угловой щипцами.
   1. После удаления головы с помощью ножниц, сделайте надрез в коже средней линии головы перевернуть кожу от черепа.
   2. Разорвать теменной кости с угловым щипцами, отшелушивающим Дура вопрос в то же время, а затем изолировать мозг тщательно от черепа.
2. Вырезать подакцизным ткань в разделы (толщиной 1 мм) с помощью матрицы мозга мыши и затем пятна в разделах 17 мин в раствор 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (TTC).
3. Исправьте в подразделах формалина 10% для по крайней мере 2 часа и затем сфотографировать их с помощью цифровой камеры. TTC будет соблюдаться пятно жизнеспособных ткани красный, в то время как некротические областях будет белым.
4. Анализа и количественной оценки Церебральный инфаркт площадь каждой секции с помощью ImageJ.

4. гематоксилином и эозином (H & E) и количество кресил фиолетовое окрашивание Гистологические срезы

1. Усыпить мышей для гистологического исследования, CO₂ ингаляции и perfuse их transcardially с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS), а затем 10 мл 4% параформальдегида (PFA). Изолировать мозг, используя ту же процедуру, как и выше (3.1) и погружать мозга в 10 мл 30% сахарозы на ночь.
2. Внедрить мозговой ткани оптимального раскроя температуры (OCT) соединения и coronally нарезать его секции толщиной 15 мкм с помощью криостата. Смонтируйте разделы на стеклянных вставках, следуют окрашивание с гематоксилином и эозином (H & E) или количество кресил фиолетовый.
3. Погружайте стекла слайды в 80% этанола за 1 мин, после окрашивания в растворе гематоксилином за 5 мин.
   1. Дважды Dip слайды кислоты 1% алкоголя, погрузиться в насыщенных лития карбонат решение для 30 сек, промыть проточной водой для 30 s, а затем изображение в раствор эозина для 30 s.
   2. Промойте слайды в водопроводной воде, Замочите в 95% и абсолютного этанола последовательно.
   3. Просушите слайды, очистить их в ксилоле по крайней мере 10 минут, а затем смонтировать coverslips, с помощью установки среднего.
4. Место стекла слайды на слайде теплее, по крайней мере 1 h, следуют погружения в 50% этанола, разбавляют метилхлороформа на ночь.
   1. Пятно слайды с 0.1% количество кресил фиолетовый для 10 минут в духовке 40 ° C сухой.
   2. Погружать в 95% этаноле для 30 минут, а затем обезвоживает в абсолютного этанола, в 2 раза.
   3. Снимите 2 раза в ксилоле на 5 минут, а затем смонтировать с монтажа средних после воздушной сушки.
5. С помощью микроскопа, наблюдать гистологические изменения, которые произошли после СМАо индуцированной черепно-мозговой травмы.

5. Статистический анализ

1. Экспресс результаты эксперимента как средства ± стандартное отклонение и определения статистической значимости между группами с помощью односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) следуют Тьюки должность Специального анализа с помощью программного обеспечения для анализа данных.
2. Установите статистическую значимость в p-значение < 0,05.

Результаты

В группе Шам работает нормально не Церебральный инфаркт наблюдается, тогда как в контрольной группе, наблюдается сравнительно широкий спектр поврежденных областей. В мышах управляемых 300 мг/кг GRex в группе СМАо модель, статистически значимое снижение в поврежденной об...

Обсуждение

С распространением метаболических заболеваний, таких как хронические гипертония, сахарный диабет, гиперлипидемия, которые являются основными факторами риска развития инсульта инсульта профилактики и лечения стали важной областью медицинских исследований^12,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep