Applicazione della tecnologia microfluidica Biochip per rilevare siero allergene-specifiche dell'immunoglobulina E (sIgE)

Riepilogo

Questa carta presenta un protocollo per la rilevazione di siero-specific IgE con un sistema di chemiluminescenza basati su cartuccia di microfluidica e la valutazione della sua utilità nella diagnosi di allergia.

Abstract

Malattia allergica è comune negli adulti e nei bambini. Identificazione degli allergeni causativi è significativo nella prevenzione e nella gestione della malattia. Tuttavia, un sistema di misurazione specifici dell'immunoglobulina E (IgE) con un alto rapporto qualità-prezzo è carente nella Cina continentale, soprattutto negli ospedali cure primarie. Questo articolo descrive le procedure di principio e funzionamento di usando un sistema di chemiluminescenza basati su cartuccia microfluidico per rilevare IgE allergene-specifiche nel siero. I risultati sono stati confrontati con quelli di ImmunoCAP (sistema 1), lo standard industriale, e viene valutata la riproducibilità del sistema per rilevare i pazienti sensibilizzati ad allergeni comuni. I risultati hanno mostrato che in confronto con ImmunoCAP (sistema 1), il sistema BioIC (sistema 2) ha buona precisione e sensibilità nella rilevazione di siero-specific IgE contro gli allergeni inalanti e alimenti vari, ma con un costo significativamente inferiore. Può servire come una buona alternativa al sistema 1 negli ospedali di cure primarie in Cina che hanno convenienza finanziaria inferiore.

Introduzione

La prevalenza delle allergie è aumentato costantemente negli ultimi decenni e colpisce il 20% - 30% della popolazione globale¹. Identificazione degli allergeni causativi ha un significato importante nella gestione delle malattie. In Cina, poiché le prove della puntura registrati in vivo della pelle non sono disponibili nel paese, determinazione in vitro di siero-specific IgE è il più importante e strumento comunemente utilizzato per il tipo I allergia diagnosi². Questo è simile a pratiche nel mondo occidentale, ma anche se ImmunoCAP sistema (sistema 1), un sistema di base di enzima-collegata dell'immunosorbente fluorescenza, è percepito come il gold standard per la diagnosi di allergia in vitro³, il suo uso in Cina è molto limitata per il prezzo elevato di attrezzature e reagenti. Quindi è assolutamente necessario un nuovo sistema di diagnosi di allergia alternativo con un alto rapporto qualità-prezzo.

Il sistema BioIC (sistema 2) è un sistema basato su cartuccia microfluidico sulla base del principio di chemiluminescenza per saggi multiplex di siero-specific IgE. Con una dimensione di 7 cm x 4 cm, la cartuccia di microfluidica è composto da tre strati di plastica stampati ad iniezione. La parte superiore è 3 in policarbonato trasparente spessore mm che trasporta buona stabilità durante i processi di gruppo termico. Insieme allo strato di 3 mm di spessore inferiore costruito da un copolimero di acrilonitrile, butadiene e stirene (ABS), esso panini 0,5 mm di spessore strato intermedio in gomma siliconica. Essendo di colore nero, lo strato intermedio offre priorità bassa più bassa durante il rilevamento di chemiluminescenza. Sulla superficie del gel di silice, un sottile strato di membrana di nitrocellulosa (NC membrana) viene spruzzato nella posizione corrispondente alla zona di reazione, che consente l'individuazione delle diverse proteine allergeniche. Lo scopo di questo studio è di valutare la performance clinica del sistema microfluidico per la determinazione di multiplex di allergene-specific IgE nel siero.

Protocollo

Questo studio e l'uso di campioni di siero umano sono stati approvati dal comitato etico della The primo affiliati ospedale di Guangzhou Medical University (GYYY-2016-73). Tutti i partecipanti hanno dato il loro consenso scritto autonomamente o tramite i loro genitori (nel caso di bambini).

1. informazioni di base del gruppo di studio

Nota: Il Repository di informazioni di allergia della stato chiave laboratorio di malattia respiratoria (aria-SKLRD) è una banca di grandi siero istituita all'interno dell'ospedale di Guangzhou Institute of Respiratory (GIRH). Ha avviato nell'ultimo decennio, l'aria-SKLRD ha già iniziato a raccogliere e conservare i campioni di siero dai pazienti con le malattie allergiche, insieme a loro informazioni cliniche (tabella 1)^4,5. Questo studio è stato effettuato con i sieri da aria-SKLRD.

1. Cerca nel database di aria-SKLRD per sieri raccolti da gennaio 2015 al giugno 2018 e selezionare i pazienti con malattia allergica, che sono stati trovati per essere sensibili agli allergeni comuni nella regione.
2. Garantire che tutti i pazienti selezionati sono malattie allergiche relative, quali rinite allergica e asma, dermatite allergica e/o orticaria, e che il siero di questi pazienti contiene più siero allergene-specific IgE (sIgE) sensibilizzazioni di allergeni comuni in questa regione, rilevati dal sistema 1.
3. Escludere i pazienti con i record medici incompleti, quelli persi al follow-up, coloro che rifiutano di dare il consenso informato per quanto riguarda l'uso dei loro campioni di siero per scopi scientifici, quelli con un'immunodeficenza identificata, quelli attualmente su immunoterapia o agenti immunomodulatori, o quelli che si trovano ad per avere infezioni parassitarie.
4. Garantire che nessun trattamento o farmaco di prescrizione è stato dato prima della raccolta del siero in modo da minimizzare le interferenze per i risultati del laboratorio. Tutti i campioni di siero che non soddisfano i criteri sono stati respinti.

2. studiare il flusso e misure di interesse

Nota: Il sistema di microfluidica ha bisogno di 100 µ l di siero per la determinazione 19 allergeni. Sangue venoso (5 mL) è stato raccolto da ogni paziente utilizzando un vaso sanguigno vuoto contenenti gel di separazione. Dopo centrifugazione per 10 min a 1.000 x g, lo strato superiore è stato raccolto per il test. Siero non utilizzato è stato conservato a-80 ° C. Prima del test, il siero è stato mantenuto a temperatura ambiente per 30 min e fu scosso con un Vortex. Cicli ripetuti di congelamento e scongelamento sono stati evitati.

1. Principalmente testare i campioni di siero per sIgEs agli allergeni interi di Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), peli di gatto (e1), peli di cane (e5), erba di Bermude (g2), timothy erba ( G6), scarafaggi (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), Ambrosia (w1), albume d'uovo (f1), latte (f2), grano (f4), arachidi (f13), soia (f14), mandorle (f20), granchio (f23) e gamberetti (f24). Seguire le istruzioni riportate nella sezione 3.
   Nota: sIgE determinazione è stato fatto con le IgE allergene-specifiche assay kit (vedere la Tabella materiali) e misurata da un analizzatore a chemiluminescenza.
2. Selezionare casualmente tre campioni tra i campioni con abbastanza siero (almeno 900 µ l) per uno studio di riproducibilità. Mantenendo tutte le condizioni immutate, misurare i tre sieri per allergene sIgEs al giorno per 9 giorni consecutivi (cioè, un totale di 100 x 9 = 900 µ l di siero).

3. procedura di prova semi-automazione del sistema microfluidico

Nota: Il sistema 2 è l'integrazione della tecnologia microfluidica automatico, microarray della proteina, luce fredda analisi, analisi parallela di IgE e tecnologia di elaborazione immagini. Il protocollo di prova è divisa in quattro parti: preparazione delle attrezzature, caricamento del campione, incubazione e misura.

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Accendere il PC e il potere di analizzatore.
      Nota: L'interruttore di alimentazione è a sinistra della base.
   2. Sul PC, avviare il programma di LabIT. Se si apre la finestra di avviso di Dark Frame , fare clic su OK per eseguire la prova di tenuta. In seguito, scegliere il centro del logo per accedere all'interfaccia di funzionamento.
      Nota: Il sistema ricorderà all'utente di eseguire la prova di tenuta se è inattivo per più di 24 h.
   3. Controllare la reazione Temp e CCD (charge coupled device) Temp nell'angolo inferiore destro dello schermo. La temperatura di reazione dovrebbe salire a 37 ° C ± 1 ° C in circa 10 min, e la Temp CCD dovrebbe cadere a-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Eseguire la prova di tenuta dopo il Temp CCD è sceso a-15 ° C ± 1 ° C. Prima di eseguire la prova di tenuta, assicurarsi che non ci sono nessun altri oggetti lasciati all'interno dello strumento e chiudere la porta. Fare clic su strumenti | Test di sistema | Prova di tenuta. Non aprire la porta durante i test. Quando il test è finito, si aprirà la finestra del report.
2. Caricamento del campione
   1. Aggiungere 620 µ l di tampone di lavaggio, 120 µ l di tampone bloccante, 60 µ l di coniugati A e B, 60 µ l di substrato A e B e 100 µ l di campioni di siero per il serbatoio di reagente corrispondente sulla cartuccia microfluidica.
3. Incubazione
   1. Fare clic su ID cartuccia, utilizzare lo scanner di codici a barre per analizzare il numero di serie della cartuccia, immettere l'ID di campione, inserire la cartuccia nell'analizzatore e chiudere la porta e fare clic su Analyzer ed eseguire per avviare l'analisi.
4. Misura
   1. Esportare i risultati per software di analisi statistica (ad esempio, Excel) dopo la misurazione.
      Nota: Dopo 30 minuti di incubazione, l'analizzatore esegue automaticamente la misura e riporta il risultato.
5. Spegnimento dell'analizzatore
   1. Per manutenzione ordinaria, dopo aver terminato il test, rimuovere la cartuccia e pulire l'analizzatore ferro di riscaldamento interno ed elettromagnete leggermente con 75% di alcol.
      Nota: Non premere con forza o scuotere l'elettromagnete.
   2. Chiudere la finestra di LabIT. Si aprirà la finestra di monitoraggio della temperatura. Si chiuderà automaticamente quando il CCD si riscalda per la modalità di protezione di 5 ° C. A quel punto, sarà possibile spegnere il potere del analizzatore al PC.
      Nota: Non chiudere manualmente la finestra di controllo prima che il Temp CCD è salito a 5 ° C della temperatura e non spegnere il potere dell'analizzatore né il PC durante il riscaldamento del CCD.

4. definizione di sIgE reattività

Nota: Per un esemplare di siero non diluito, il campo di rilevamento del sistema 2 è 0,21 – 100 IU/mL.

1. Base al valore di soglia di 0,35 IU/mL, considera un livello di sIgE superiore a 0,35 IU/mL per essere positivo^6,7. Valuta la reattività delle prove sIgE come⁸: classe 1 (≥0.35 e < 0,70 IU/mL), classe 2 (≥0.70 e < 3,50 IU/mL), classe 3 (≥3.50 e < 17,50 IU/mL), classe 4 (≥17.50 e < 50,00 IU/mL), classe 5 (≥50.00 e < 100,00 IU/mL) e classe 6 (≥100.00 IU/mL).

5. elaborazione statistica

1. Utilizzare un istogramma per visualizzare il tasso positivo degli 19 allergeni (Figura 1) e utilizzare la curva di Levey-Jennings per dimostrare la ripetibilità del rilevamento sistema (Figura 2)⁹.
2. Selezionare le tre più comuni allergeni inalanti e allergeni alimentari (in totale, sei allergeni) e confrontare i risultati dei sistema 1 per valutare la sua prestazione diagnostica clinica^10,11. Includere il tasso di concordanza, sensibilità, specificità, valori predittivi positivi e negativi e l'area sotto il curva (AUC) di caratteristica (ROC) di funzionamento come i criteri di valutazione del ricevitore.
3. Applicare correlazione analisi¹² per descrivere le correlazioni tra i due sistemi e utilizzare il valore kappa per coerenza di Spearman. Categorizzare il valore kappa come quasi perfetto (0.8-1.0), sostanziale (0,6-0,8), moderato (0,4 – 0,6), Fiera (0.2-0.4) o poveri (< 0.2)¹³. Utilizzare delle analisi statistiche SPSS 23.0 e MedCalc 11.0 e definire P < 0,05 come significatività statistica.

Risultati

Tassi positivi per 19 comuni allergeni
I risultati su 293 sieri sono mostrati nella Figura 3. Tra tutti gli allergeni inalanti, d. farinae aveva il più alto tasso positivo (80.89%, 273/293), seguita da D. pteronyssinus (78,84%, 231/293). Tra gli allergeni alimentari, crab ha il più alto tasso positivo (20,48%, 60/293), seguita da 13,65% (40/293) per gamberetti. Il tasso totale positivo per allergeni inalanti er...

Discussione

Simile ai risultati da molti altri studi^15,16,17, i risultati dal sistema microfluidico basato su sieri da 293 pazienti allergici ha mostrati quella casa acari della polvere (tra cui d. pteronyssinus, D. farinaee b. tropicalis) sono i principali allergeni inalanti provocando malattie allergiche nel sud della Cina, considerando che per il cibo, latte, arachidi, gamberetti e granchio sono gli allergeni ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5