Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること

要約

Lck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュの T リンパ球、高い GFP を表現・ T 細胞の開発と急性リンパ性白血病の研究に使用されています。この行より低いレベルでlckを表現研究 B 細胞に使用できます。このプロトコルでは、 lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞の浄化について説明します。

要約

ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、リンパ球の開発を研究する強力なモデルです。哺乳類のようなD. 形態学は、B および T リンパ球を含む適応免疫システムを所有しています。ゼブラフィッシュ リンパ球産生の研究は困難D. 学セル表面のマーカーを認識する抗体一般に利用できないため、複雑に B 系列を含む異なるリンパ球集団の分離と性状セルです。系統特異蛍光式と形質転換線は、このような課題を回避するために使用します。遺伝子組換えlck:eGFPラインD. 学T 細胞の開発、研究に使用されている、モデル T 細胞の開発と急性リンパ性白血病 (T オール) にも利用されています。Lck:eGFP魚は、T 系列の分析に広く使用されている、B 細胞を研究するために使用されてしていません。最近、低レベルとはいえ多くのゼブラフィッシュ B 細胞がまたlckを表現我々 発見。その結果、 lck:eGFP B 細胞同様に GFP の低レベルを表現します。この発見に基づき、今回lck:eGFPゼブラフィッシュから B 系細胞を浄化するためのプロトコルを開発しました。本手法は、 lck:eGFP魚や二重遺伝子組換えrag2:hMYC; などの関連行から B 細胞を浄化する蛍光活性化細胞選別機 (FACS) を利用する方法をについて説明しますlck:eGFP魚。これらの行は、B 細胞、特に未熟な B 細胞、低ですが検出可能なレベルで特急 GFP は高い GFP を発現する T 細胞と区別されるべきそれらを許可します。B 細胞は骨髄、胸腺、脾臓、血液や他の組織から分離することができます。このプロトコルは、浄化D. 学B 細胞、B 細胞、B リンパ球の悪性腫瘍のようなトピックに焦点を当てた研究を可能にする新しい方法を提供します。

概要

ゼブラフィッシュでは、遺伝的手法を用いた研究の脊椎動物の開発を促進する遺伝的操作性, 高産卵、光透光性および急速な発展などの強力な属性を提供しています。魚類と哺乳類の造血の共有の機能と共に、これらの利点によりD. 学成人期にわたって幼生の初期の外観から、リンパ球産生やリンパ球機能の in vivo 解析に最適。哺乳類と共有されている保存されている遺伝的プロセスに依存して血ゼブラフィッシュの開発と適応免疫システムにこれらを拡張します。さらに、リンパ球の開発を支配する分子メカニズムは、ゼブラフィッシュと哺乳類¹間著しく保存されます。

過去 2 年間、トランスジェニックD. 学そのラベルの特定血液系統とこれらの系統の欠損突然変異系統は、^2,3,4,5を作成されています。Lck:eGFP形質転換線、これらの 1 つはドライブ GFP 式⁶にゼブラフィッシュ リンパ球の蛋白質チロシンのキナーゼ (lck) プロモーターを使用します。T 系列の前駆体と成熟した T リンパ球が強く表現される遺伝子は胸腺 T 細胞性と T - 細胞の生体内浄化 ex 追跡 FACS⁷を生体内でことができます。以前は、我々 は前方遺伝 ENU 変異画面でこのラインを使用 T すべてになりやすい生殖細胞系列変異を識別するために、T 細胞の発癌^8,9にリンク アデノーマを取得した遺伝的イベントを研究します。

最近、当研究室は、 lck:eGFPゼブラフィッシュの有用性をさらに拡張。二重遺伝子rag2:hMYC (人間 MYC)、 lck:eGFP + 学T オール¹⁰を開発する知られているで、私たちはことを発見した B 系統すべてはまた¹¹を発生します。GFP 発現による鮮やかな蛍光を発する、このモデルで T オールとは異なり B すべてがぼんやりと発光 GFP レベルが低いため魚 B オール蛍光顕微鏡による T すべてとのそれらから肉眼的に区別するを許可します。また、この GFP 発現は GFP^lo B 全細胞の分離から GFP^{こんにちは}FACS¹¹を使用してすべての T 細胞に許可します。また、低lck式にはLCK^11,12の人間 B オールもエクスプレス低レベルとして、ゼブラフィッシュ、B オールに一意ではありません。同様に、 d. 学マウス、および人間の細胞の B 系統もlckの低レベルを表現/LckLCK、未熟な B 細胞の持つ最高の式^11,13/。セルごとにlckeGFPゼブラフィッシュまたは誘導体の線に B 系細胞は、T リンパ球、くらい GFP 1-10% を表現します。これら GFP^lo表現特性pax5、 cd79b、 blnk、 btk, ighm、 ighz、その他、B 細胞の Mrna を細胞、骨髄、胸腺、脾臓、または周辺から精製することができます。血¹¹。したがって、両方 B- と T-系列細胞にすることができますおよび分離されたlckeGFPゼブラフィッシュからrag2hMYC、 lckeGFP動物、B と T、すべて細胞同様の場合¹¹。

ここでは、我々 はlck:eGFPゼブラフィッシュとrag2hMYC; の非悪性または悪性 B 細胞から非悪性 B 細胞を FACS 浄化効率を私達のプロトコルを提示します。lck:eGFP魚、ソースのさまざまな組織を使用して。必要な場合、そのような細胞を FACS 分離せずフローサイトメトリーによる定量化同様にことができます。低lck式の発見-その結果、GFP の発現が低い -b 細胞のlckeGFPゼブラフィッシュの実験的な可能性の新たな扉を開きますin vivo B 細胞発達研究のよう。したがって、2004 年に最初に報告されたこの形質転換線は、活用するゼブラフィッシュ適応免疫に関する新鮮な洞察を収集することを目指す新しい生活です。

プロトコル

ゼブラフィッシュを含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) オクラホマ大学健康科学センターによって承認されました。

1. 遺伝子組換えlck:eGFP 魚から非悪性 B および T リンパ球を分離します。

1. 魚システム水で 0.02 %tricaine (MS-222) を使用して魚を麻酔します。
2. ゼブラフィッシュと他の魚類¹⁴の鰓腔の背内側面に位置する蛍光 thymi の 2-6 ヶ月魚を確認します。(470/40 励起波長と 525/50 排出フィルター) GFP を検出する落射蛍光顕微鏡を使用します。
3. ロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) 含む 1% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン ・ ストレプトマイシン (並べ替えメディア) x フィルター滅菌 1 の 50 mL を事前に準備します。未使用並べ替えメディアは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
4. 0.2% を含むビーカーに置くことで、魚を安楽死させる氷浸漬法による Tricaine、約 5 分間続きます。弁蓋部 (ギル) の動きの停止によって死を確認します。
5. ペトリ皿に euthanized の魚そして GFP⁺ thymi¹⁴と¹⁵の腎臓骨髄および脾臓を解剖する明視野顕微鏡設定を解剖する蛍光顕微鏡を使用して興味のリンパ器官を解剖します。3 歳 6 ヶ月の魚を使用してここに示す結果が得られました。リンパ球の比率と絶対数は、年齢、遺伝子型 (さらに詳細の説明を参照) によって異なります。
6. メディアの並べ替え冷 500 μ L を含む 1.5 mL チューブに切り裂かれた器官を配置します。
7. 杵マイクロ チューブ ホモジナイザーを使って氷の上組織をホモジナイズしてください。
8. 単一細胞懸濁液を生成する 35 μ m のメッシュ フィルターを均質化組織を通過します。解析まで氷の上細胞を保ちます。

2. 二重遺伝子組換えrag2:hMYC; lck:eGFP ゼブラフィッシュから悪性リンパ球を分離すること

1. Rag2:hMYC; 2-4 ヶ月で始まり、画面の顕微鏡異常な GFP パターンのlck:eGFP魚。
   注: B 細胞が GFP^lo lck:eGFPバック グラウンドで B オール; を認識する練習が必要ですのでT 細胞が GFP^{こんにちは}T すべては明らかです。その結果、 rag2:hMYC、 lck:eGFPデュアル形質転換線は 2 つの表現型: 鮮やかな蛍光 T-すべて、通常、胸腺から起こり、体とぼんやり蛍光 B-すべてに拡張します。
   1. 画面 (200 ms、2.4 x 利得) 明るい T オール (図 1 a) と「高い危険度」を識別するために「低露出」設定を使用して魚の蛍光顕微鏡を用いた 1.5 s (3.4 x 利得) dim B オール (図 1 a) を識別します。WT コントロールと前白血病魚 GFP 胸腺 (図 1 b) にのみ局在があります。
2. 麻酔し、手順 1.1-1.2 で魚を確認します。
3. シンプルな 3 つのカテゴリを用いた GFP 蛍光の範囲に基づいて魚を分類します。
   注:レベル 1: 蛍光のみ限られたローカル広がりと胸腺腫瘍として表示されます。
   レベル 2: 胸腺、含むを超えて表示される蛍光 < 体の 50%。
   レベル 3: 蛍光体の 50% を超えて拡張します。
4. 癌なしでそれらからすべての魚を分けます。一度毎月新しいすべての開発の前白血病魚 (すなわち、GFP⁺腫瘍なし魚) を監視します。~ 9 ヶ月、すべてのrag2:hMYC、 lck:eGFP魚開発 T オール B は、すべて、またはその両方。
5. T または B すべてのセル分離、レベル 3 の魚を選択 (すべて含む > 体の 50%)、以上 2 × 10⁶の降伏をすべてのセルおよび通常多く。
6. 1.4 の手順のように魚を安楽死させます。
   注:すべてのセルを取得する方法が 2 つあります: 全身均一化と腹膜洗浄技術¹⁶。メソッドが異なる細胞の選別、収集の絶対数としたがって、FACS の量時間必要とコスト (さらに詳細の説明を参照)。
7. いずれかのメソッドの最初ペトリ皿で euthanized の魚を配置し、胸腺の領域を含む頭かみそりの刃を使用して、削除します。これは、必要な場合は組織染色用別々 に処理できます。
8. 腹腔洗浄法
   1. P1000 ピペットを使用して、冷間細胞と 5 mL チューブ内のメディアを収集した、メディアのソート 500 μ L で魚の腹腔内を洗います。
   2. 新鮮なピペット チップを使用して、冷たい並べ替えメディアの追加 200-300 μ L を体内に注入します。そして、ピペットの先端を使用して、体内の細胞を押し出すに魚体に穏やかな圧力を適用します。このメディアを収集し、5 mL チューブを追加します。
   3. 2.8.2 手順 2-3 回繰り返します。氷の上のメディアの並べ替えに集められたセルをしてください。
   4. 35 μ m メッシュが流れ cytometry/FACS の前にフィルター処理、解析まで氷の上細胞を保つ細胞懸濁液をフィルター処理します。
9. 体全体の均質化
   1. 魚の頭を削除すると、メディアの並べ替えの 200 μ L を含む 1.5 mL チューブに体を配置します。
   2. 杵マイクロ チューブ ホモジナイザーを使用して体をホモジナイズしてください。
   3. 冷たいメディアの並べ替えの追加 300 μ L を追加します。35 μ m のメッシュ フィルターは、細胞懸濁液をフィルターします。組織破片のみがフィルターに残っているまで、フィルターを介してすべてのセルを洗浄を必要に応じて並べ替えメディアを追加します。解析まで氷の上細胞を保ちます。

3. 正常または悪性 B リンパ球の解析

1. フローサイトメトリーによる解析および/または製造元のガイドによると FACS パラメーターを設定します。
2. 最初サンプルを特徴付けるイベントの数を取得します。1 x 10⁴並べ替え並べ替え手順についてはその後特定のゲートを判断する前に 5 × 10⁴イベントを分析します。
   1. ゲートを決定: 前方散乱 (FSC) および細胞残骸 (図 2 a-c)¹⁷を除く側散布 (SSC) パラメーターを使用してリンパ球と前駆細胞のゲートを定義します。FSC と SSC それぞれセル径と粒度に対応します。
      注:GFP^-、GFP^loと GFP^{こんにちは}セルの異なる 10--100-折るべきそれらの GFP の蛍光強度の面でこれらの集団は簡単です (図 2-5) の分離を行います。生きている死者の差別は、この時点で propidium ヨウ素 (PI) または 7 aminoactinomycin D (7 AAAD) 性染色を使用して評価できます。PI で以前実験を行い, 通常 > FACS GFP⁺細胞の 95% の生存率。
   2. FACS 機のパラメーターに従って細胞ダブレットを除外します。
   3. リンパや前駆体ゲート内で数と GFP⁺細胞の割合を決定します。
3. フィコエ リスリン (PE) と GFP の強度を使用して、GFP^lo GFP^{こんにちは}セル対対 GFP^-のゲートを定義します。
   注:B 細胞は薄暗い GFP 蛍光を展示し、T 細胞は、 lck:eGFPラインの明るい GFP を表示します。多くのリンパ性器官または腫瘍のサンプル両方 GFP⁺の人口が含まれます。B 系列細胞/B-すべては GFP^loと T 系列細胞/T-すべては、GFP^{こんにちは}。区別する GFP^-、GFP^lo、GFP^{こんにちは}細胞、ゲートを定義して、これらの集団を分けて集め (図 2 a-C図 3A-C図 4 a 図5 a)。
4. メディアの並べ替えの 2 mL を含む異なる 15 mL ポリプロピレン チューブにまたはそれ以上の分析 (例えば、RNA、DNA または蛋白質の抽出、同種移植、等) の適切なバッファーを含む異なる 1.5 mL チューブに直接各細胞集団を並べ替えます。
5. さらに分析前に氷の上精製した細胞を保ちます。

結果

フローサイトメトリー分析して GFP^loおよび GFP^{こんにちは}細胞胸腺、骨髄、腎臓、 lck:eGFPトランスジェニックゼブラフィッシュの脾臓から分離する FACS を使いました。1 歳 3 か月の魚の分析では、胸腺に大抵 GFP⁺のリンパ球が含まれているを明らかにしました。GFP⁺細胞主、2 部フェリー編ら¹⁷に記載されたリンパ?...

ディスカッション

開発、B 系列ラベル^3,4 D. 学モデルにこれを追加するlck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュから B 細胞を分離するためのプロトコルを提供しています。幾分意外にも、GFP^lo B 細胞のこの行の識別は、2004 年にその説明から見過ごされている行った。一般的に、lckは T 細胞に固有の⁶と見なされますが、最近の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030