הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

Summary

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

Abstract

הדג הוא אורגניזם בשימוש נרחב בעלי חוליות מודל עבור המחלה והפניטיפ מבוססי גילוי סמים. הדגים מייצרים צאצאים רבים, יש עוברים שקופים ופיתוח חיצוני מהיר. עוברי הדגים מסוגלים, לפיכך, לשמש גם להערכה מהירה של רעילות של תרופות יקרות וזמינות בכמויות קטנות. במאמר הנוכחי, שיטה להקרנה יעילה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות העוברים הפריה יום 1-5 לאחר הימים מתואר. העוברים מנוטרים על ידי הstereomicroscope כדי לחקור את הפגמים פנוטיפקס הנגרמים על ידי החשיפה לריכוזים שונים של תרכובות. ריכוזים קטלניים חצי מקסימלית (LC₅₀) של תרכובות נקבעות גם. המחקר הנוכחי נדרש 3-6 מ"ג של תרכובת מעכב, ואת הניסוי כולו לוקח כ 8-10 h להסתיים על ידי אדם במעבדה שיש מתקנים בסיסיים. הפרוטוקול הנוכחי מתאים לבדיקת כל תרכובת לזיהוי השפעות רעילות בלתי נסבלת או מחוץ למטרה של התרכובת בשלב המוקדם של גילוי הסמים ולגילוי אפקטים רעילים עדינים שעלולים להחמיץ בתרבות התאית או בדגמי בעלי חיים אחרים. השיטה מפחיתה עיכובים פרוצדורליים ועלויות של פיתוח סמים.

Introduction

פיתוח הסמים הוא תהליך יקר. לפני מתחם כימי יחיד אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) והסוכנות האירופית תרופות (EMA) כמה אלפי תרכובות מוקרנים בעלות של מעל 1,000,000,000 דולר¹. במהלך הפיתוח הקדם-קליני, החלק הגדול ביותר של עלות זו נדרש עבור בדיקת החיות². כדי להגביל את העלויות, חוקרים בתחום פיתוח התרופה זקוקים למודלים חלופיים להקרנה בטיחות של תרכובות כימיות³. לכן, בשלב המוקדם של התפתחות התרופה, זה יהיה מאוד מועיל להשתמש בשיטה שיכולה להעריך במהירות את הבטיחות והרעילות של תרכובות במודל מתאים. ישנם מספר פרוטוקולים ששימשו להקרנה רעילות של תרכובות כימיות מעורבים בעלי חיים ומודלים של תרבות התא, אבל אין פרוטוקול אחד כי הוא מאומת והוא בשימוש משותף^4,5. פרוטוקולים קיימים באמצעות דג זברה להשתנות באורך ושימשו על ידי חוקרים בודדים אשר העריכו את רעילות לפי דרישת הנוחות שלהם^6,7,8,9, מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 ,} . ^{שתיים עשרה}

בעבר האחרון, דג דג זברה התפתחה כמודל נוח להערכת רעילות של תרכובות כימיות במהלך התפתחות עובריים^6,7. לדג יש יתרונות רבים ומובנים להערכת תרכובות כימיות¹³. אפילו ניסויים בקנה מידה גדול הם קלה, כמו נקבה דג זברה יכול להטיל אצוות של 200-300 ביצים, אשר לפתח במהירות ex vivo, לא צריך האכלה חיצונית עד שבוע והם שקופים. את התרכובות ניתן להוסיף ישירות לתוך המים, שם הם יכולים (בהתאם לאופי המתחם) לפזר דרך chorion, ואחרי הבקיעה, דרך העור, זימים והפה של הזחלים. הניסויים אינם דורשים כמויות שפע של תרכובות כימיות¹⁴ בשל הגודל הקטן של העובר. פיתוח העוברים ומבטאים את רוב החלבונים הדרושים כדי להשיג את התוצאה ההתפתחותית נורמלית. לכן, עובר דג הוא מודל רגיש כדי להעריך אם תרופה פוטנציאלית יכול להפריע לתפקוד של חלבון או מולקולה איתות כי הוא משמעותי בפיתוח. האיברים של דג דג זברה להיות פונקציונלי בין 2-5 dpf¹⁵, ותרכובות רעילים במהלך תקופה זו רגיש של ההתפתחות העובריים לגרום למומים פנוטילים בזחלים דג זברה. שינויים אלה גמישות פנוטיפית ניתן לזהות בקלות באמצעות מיקרוסקופ פשוט ללא טכניקות פולשני¹¹. עוברי הדגים משמשים רבות במחקר רעילות בגלל המורכבות הביולוגית הרבה יותר שלהם בהשוואה לסינון סמים מחוץ לתחום באמצעות מודלים של תרבות התאים^16,17.  כמו בעלי חוליות, האיפור הגנטי הפיזיולוגי של דג דג זברה הוא דומה לבני אדם ולכן רעלים של תרכובות כימיות דומים בין דג זברה ובני אדם^8,18,19, מיכל בן ^{20 ,} מיכל ^{בן 21 , 22}. zebrafish הוא, לפיכך, כלי חשוב בשלב מוקדם של גילוי סמים להערכת רעילות ובטיחות של תרכובות כימיות.

במאמר הנוכחי, אנו מספקים תיאור מפורט של השיטה המשמשת להערכת הבטיחות והרעילות של תרכובות המעכב (CA) מעכב פחמניים באמצעות 1-5 היום הפריה הפוסט (dpf) דג זברה העוברים על ידי חוקר יחיד. הפרוטוקול כולל חשיפת עוברי דגים בריכוזים שונים של תרכובות מעכבי כימיים ללמוד את התמותה ואת השינויים פנוטיפקס במהלך ההתפתחות העוברית. בסוף החשיפה לתרכובות כימיות, מינון LC₅₀ של הכימיקל נקבע. השיטה מאפשרת לאדם לבצע הקרנה יעילה של 1-5 תרכובות בדיקה ולוקח כ 8-10 h בהתאם לניסיון של האדם עם השיטה (איור 1). כל אחד מהצעדים הנדרשים להערכת רעילות התרכובות מתואר באיור 2. הערכת רעילות של מעכבי CA דורש 8 ימים, כולל הגדרת זוגות ההזדווגות (יום 1); איסוף העוברים ממיכלי הרבייה, ניקוי והעברתו לאינקובטור 28.5 ° c (יום 2); התפלגות העוברים לבארות של הצלחת 24-באר ותוספת של תרכובות המעכב מדולל CA (יום 3); הניתוח פנוטימית והדמיה של הזחלים (יום 4-8), וקביעת מינון LC₅₀ (day8).  שיטה זו מהירה ויעילה, מחייבת כמות קטנה של תרכובת כימית ורק מתקנים בסיסיים של המעבדה.

Protocol

מתקן הליבה דג זברה באוניברסיטת טמפרה יש אישור מוסד שניתנו על ידי הלוח הלאומי ניסוי בעלי חיים (esavi/7975/04.10.05/2016). כל הניסויים באמצעות העוברים דג זברה בוצעו על פי ממשלת מחוזי של פינלנד המזרחית, המחלקה החברתית והבריאות של שירות אזורית טמפרה פרוטוקול השירות האזורי lslh-2007-7254/Ym-23.

1. הקמת מיכלי הזדווגות לילה

1. מקום 2-5 בוגר זכר דג זברה ו 3-5 נקבה מבוגרת הדגים לתוך מיכלי הזדווגות לילה. (הרבייה מושרה בבוקר על ידי מחזור כהה אוטומטי ואור בלילה).
2. להגדיר כמה צלבים כדי להשיג מספיק עוברים להערכת רעילות של יותר משני תרכובות כימיות. להערכת רעילות, כל ריכוז זקוק למינימום של 20 עוברים²³.
3. כדי להימנע מטיפול בלחצים לבעלי חיים, הניחו לחיות לנוח למשך שבועיים לפני השימוש באותם אנשים לצורך הרבייה.

2. אוסף העוברים והכנת צלחות לחשיפה לתרכובות כימיות

1. לאסוף את העוברים, יום למחרת לפני הצהריים, באמצעות מסננת בסדר שינוי ולהעביר אותם על צלחת פטרי המכיל E3 העובר בינוני [5.0 mM הנאקל, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 Mm MgSO₄, ו 0.1% w/v מתילן Blue].
2. הסרת פסולת באמצעות פיפטה מפלסטיק של פסטר (למשל, מזון ופסולת מוצקה). בחנו כל קבוצה של עוברים תחת הstereomicroscope כדי להסיר את העוברים הבלתי מופרות/מתים (המזוהים באמצעות המראה האטום שלהם).
3. לשמור על העוברים ב 28.5 ° c בחממה. לבחון את העוברים, בבוקר שלמחרת, תחת stereomicroscope ולהסיר עוברים בריאים או מתים. כמו כן, החלף את המדיום E3 הישן עם מדיום E3 טרי.
   הערה: עוברי הדגים מתוחזקים תמיד ב-28.5 ° c בתנאי מעבדה.
4. העבר בזהירות 1 העובר לתוך כל טוב של הצלחת 24-באר המכיל מספיק E3 בינוני כדי לכסות את העוברים.

3. ההכנות של פתרון המניה של תרכובות כימיות והפצה של תרכובת מדוללת בבארות

1. קחו את הבקבוקונים המכילים תרכובות מעכבי המאוחסנות ב -4 ° c.
   הערה: בהתאם למאפיינים של התרכובת, אלה מאוחסנים בטמפרטורות שונות.
2. שוקלים את התרכובת באמצעות איזון אנליטי שיכול לשקול כמה מיליגרם (mg) של המתחם במדויק.
3. הכינו לפחות 250 μL (100 מ"מ) של פתרון מניות עבור כל תרכובת בממס מתאים (למשל, E3 מים או Diמתיל סולפוקסיד (DMSO), מבוסס על מאפייני מסיסות של תרכובות.
   הערה: ניתן לבצע את השלבים לעיל יום לפני תחילת הניסוי בזמן נוח ומאוחסן ב -4 ° c.
4. הפוך את הדילול הסידורי של פתרונות המניה (e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM ו-500 μM) באמצעות E3 מים ב 15 שפופרות צנטריפוגה mL.
   הערה: ריכוזי ומספר הדילול הסדרתי משתנים מתרכובת אחת לתרכובת אחרת, בהתאם לרמת הרעילות שלהם.
5. מצלחת 24 היטב המכיל עוברים, להסיר E3 מים מן הבארות באמצעות הפיפטה פסטר ופיפטה 1 mL (המכיל אחד עוברי dpf) שורה אחת בכל פעם.
6. פזר 1 מ ל של כל מדלל בכל באר (החל מלמטה ומתקדם לריכוז גבוה יותר) לתוך הבארות של הצלחת 24-באר.
7. הגדר קבוצת בקרה מאותה קבוצה של עוברים והוסף את הכמות המתאימה של דילול.
8. לייבל 24-לוחות עם שם וריכוז של המתחם ולשמור את הצלחות ב 28.5 ° c בחממה.

4. אנליזה פנוטימית והדמיה של העוברים באמצעות Stereomicroscope

1. בחנו את העוברים תחת stereomicroscope לפרמטרים 24 שעות לאחר החשיפה לתרכובות הכימיות.
   1. שימו לב לפרמטרים כגון תמותה, בקיעה, פעימות לב, ניצול שק החלמון, פיתוח שלפוחית השתן, תנועת הדג, בצקת בקרום הלב וצורת הגוף²³.
   2. קח את הזחלים חשופים לכל ריכוז של המתחם ולהניח אותם הצידה בצלחת פטרי קטנה המכילה 3% מטאלי מולקולרי גבוהה מתיל תאית באמצעות לווין מתכת.
      הערה: 3% מתיל תאית (מולקולרי גבוה עם) הוא נוזל צמיגי הדרוש להטבעת הדג בכיוון הנדרש לבדיקה מיקרוסקופית. להגיית הדגים בנוזל זה יש צורך בגשוש מתכת.
   3. קח את התמונות באמצעות stereomicroscope מחובר למצלמה. שמור את התמונות בתיקייה נפרדת כל יום עד סוף הניסוי.
   4. הזן את כל התצפיות בטבלה בכל יום או בטבלה מקוונת או בגיליון מודפס.
   5. אם תרכובות נוירוטוקסינות, 4 עד 5 הזחלים dpf עשוי להראות דפוס שונה לשחות, לעשות שיא של שינויים כאלה או על ידי לכידת קצר (30 s עד 1 דקות) וידאו של הזחלים המציגות דפוס תנועה נורמלית.
   6. לאחר 5 ימים של חשיפה לתרכובות הכימיות, שים לב לריכוז שבו מחצית העוברים מתים לחישוב הריכוז המקסימלי הקטלני 50 (LC₅₀) של כל כימיקל.
      הערה: LC₅₀ הוא הריכוז שבו 50% מהעוברים מתים בסוף 5 ימים של חשיפה לתרכובת כימית. השתמש לפחות 20 עוברים לבדיקת רעילות של כל ריכוז של מתחם²³.
   7. בניית עיקול לתמותה של עוברים עבור כל הריכוזים באמצעות תוכנית מתאימה.

תוצאות

החלק הקריטי של הערכת רעילות הוא בדיקת ריכוזים שונים של תרכובות כימיות אחד או מספר בניסוי אחד. בתחילת, בחר את תרכובות להערכת רעילות, מספר ריכוזי לבדוק כל תרכובת, ובהתאם, לעשות תרשים (איור 3). השתמשנו בצבע ייחודי לכל תרכובת כדי לארגן את הדגימות (איו...

Discussion

במבחן רעילות מחוץ לבית באמצעות תאים מתורבתים יכול לזהות הישרדות מחקרים מורפולוגיים של התאים מתן מידע מוגבל על רעילות הנגרמת על ידי מתחם הבדיקה. היתרון של הקרנת רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי דג זברה הוא גילוי מהיר של שינויים המושרה בכימיקלים פנוטיפקס בעלי חיים שלמים במהלך ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Nunc	Thermo Scientific
Balance (Weighing scale)	KERN	PLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)	Mettler Toledo	AB104-S/PH
CaCl2	JT.Baker	RS421910024
Disecting Probe	Thermo Scientific	17-467-604
DMSO	Sigma Aldrich, Germany	D4540
Falcon tubes 15 mL	Greiner bio-one	188271
High molecular weight methylcellulose	Sigma Aldrich, Germany	M0262
Incubator for zebrafish larvae	Termaks	B8000
KCL	Merck	1.04936.0500
Methyl Blue	Sigma Aldrich, Germany	28983-56-4
MgSO4	Sigma Aldrich, Germany	M7506
Microcentrifuge tubes	Starlab	S1615-5500
NaCl	VWR Chemicals	27810.295
Paraffin Histoplast IM	Thermo Scientific	8331
Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171
Petri dish	Thermo Scientific	101R20
Petri plates	Sarstedt	82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)	Thermo Scientific	4641230N, 4641210N
Plates 24-Well	Thermo Scientific	142485
Steriomicroscope/Camera	Zeiss	Stemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)	Fisherbrand	11569914
Zebrafish AB strains	ZIRC	ZL1