Fare akciğer Içinde seçici Ajan biriktirme geliştirmek için doğrudan Intrabronchial yönetim

Özet

Farelerde deneysel ajanlar intratracheal (It) yönetimi genellikle distal akciğerlere asimetrik teslim sonuçlanır.  Bu raporda, her akciğeri operatif olmayan canlı fareler içinde cannulate için doğrudan intrabronchial (ıB) yaklaşımı açıklanmaktadır.  Bu yaklaşım, bir akciğer için seçici olarak ajanlar yönetmek için kullanılabilir ya da her iki akciğerde simetrik Ajan teslim geliştirmek için adapte olabilir.

Özet

Deneysel ajanların intratracheal (It) yönetimi, bleomisin kaynaklı pulmoner fibrozis gibi differe akciğer hastalıklarının duvar modellerinde temel bir tekniktir.  Ancak, intratracheally uygulanan ajanlar distal fare akciğerine dağılımı genellikle asimetrik, akciğer parankimal konsantrasyonları daha küçük artar (ama eşit erişilebilir) fare sol akciğer.  Bu raporda açıklanan bir roman intrabronchial (ıB) yaşam fareleri sol ve/veya sağ akciğerleri olmayan operatively kanüle yaklaşımı.  Aynı zamanda bu yaklaşım seçici bir akciğer veya adapte ajanlar yönetmek için nasıl kullanılacağı gösterilmiştir (yoluyla doz-ayarlanmış IB teslimat) deneysel ajanlar akciğer teslim sol-sağ simetri geliştirmek için, böylece differ modelleri iyileştirilmesi pulmoner fibrozis gibi akciğer hastalığı.

Giriş

Farelerde deneysel ajanlar doğrudan pulmoner uygulanması akciğer immün tepkiler çalışması için izin verir, akut akciğer hasarı, ve akciğer fibrozis. Doğrudan pulmoner yönetim, daha önce^1,2,3olarak açıklandığı gibi intratrakeal (It) instıtasyon yoluyla genellikle gerçekleştirilir. Ancak, bu yaklaşım seçici olmayan, hem akciğerleri hedefsiz ve genellikle asimetrik bir biçimde etkileyen.  Akciğer yaralanması deneysel modelleme bir kontrol olarak kontralateral akciğer kullanımı için izin, seçici bir belirli akciğer hedef yeteneği yararlanabilir. Tersine, insan diffik akciğer hastalıkları doğru modelleme bilateral akciğer parankime deneysel ajanlar simetrik dağılımı yararlanır.

Bu raporun genel amacı, deneysel ajanlar bir fare sol veya sağ akciğer seçici teslimat için bir yöntem açıklamak için (Şekil 1). Bu intrabronchial (ıB) yönetim yaklaşımı bir fare akciğer tek taraflı tedavi sağlar ve kolayca bilateral mainstem bronşi bir ajan eşit teslim sağlamak için adapte edilebilir. Daha küçük sol akciğere (yani doz ayarlı ıB yönetimi) daha büyük sağ akciğer ve daha küçük hacimler için deneysel ajanlar daha büyük dozlarda sunmak için ıB yönetimini kullanarak, bu raporda gösterilen pulmoner homojenlik bir gelişme Deneysel ajanlar teslim, fareler diffuzu akciğer hasarı modelini optimize. Bu nedenle, bu rapor ya tek taraflı olarak farelere deneysel ajanlar yönetmek veya her iki akciğerde ilaç birikimi simetri geliştirmek isteyen müfettişlerin değeri tutabilir.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Colorado Denver kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler (Bölüm 4 – 7) hem erkek hem de kadın C57BL/6 fareler kullanılarak optimize edilmiştir. Bu yaklaşım, vücut ağırlığı 19 – 40 g arasında değişen fareler kullanılarak doğrulandı.

1. ıB yönetimi için platformun oluşturulması

1. Defter ucunu, bazal kanat ile ayakta kanat arasındaki orijinal 90 ° açıyla 70 ° (Şekil 2a) eğilin.
2. Metal bağlayıcının 'in ayakta kanadının orta kısmında bir delik açın (Şekil 2a).
3. Plastik tahta ilgili konumda aynı boyutta bir delik matkap. İki küçük deliği inferiora ve yanal olarak matkap (Şekil 2a).
4. Plastik tahta içinde bu küçük delikler arasında bir 4:0 ipek dikiş Drape (Şekil 2a).
5. Kanca ve döngü bandı plastik tahta kenarına yerleştirin (Şekil 2a).
6. Plastik tahtayı vida ile metal kitap ucuna birleştirin (Şekil 2B). Gerekirse, açı ayarlaması için izin verirken vida-somun pozisyon kurulu tutmak için yeterince sıkı olduğundan emin olun.
7. Plastik kurulunun dönme saati saat yönünün tersine, serbestçe hareket etmesini sağlayın.
   Not: Saat yönünde hareket bu raporda (+) derece döndürme olarak temsil edilir ve saat yönünün tersine bir (-) derece döndürme olarak temsil edilir.
8. Plastik tahtasını + 30 °, + 86 °,-30 ° ve-74 ° ' ye konumlandırmak için bir açı protraktörü kullanın ve bunları sırasıyla kitap ucuna işaretleyin.

2. ıB Agent yönetimi için genişletilmiş kateterler oluşturulması

1. Orijinal 22 G kateter (25 mm, bkz. malzeme tablosu) ucunda keskin bir bıçak ile doğru açı kesilebilir (Şekil 3, adım 1a).
2. Eğimli (~ 50 ° – 60 °) diğer orijinal kateter (25 mm) ucu bıçağla, sonra hub 'dan sağ açıyla kesilir (Şekil 3, adım 1B).
3. Tutkal iki kateter kendi künt uçları biraz daha az 180 ° açı ile (Şekil 3, adım 2).
4. Düşük sıcaklık koter ile erime tarafından eğimli ucu Blunt ( malzeme tablosunabakın).
5. Genişletilmiş kateter, yapıştırılmış alanda "0" boyutunda zımpara ve genişletilmiş kateter eğimli ucu ile parlatın (Şekil 3, adım 3).
6. 25 mm, 30 mm ve 35 mm (Şekil 3, adım 3) farklı renklerle genişletilmiş kateter üzerinde işaretle.
7. Hub 'ı Marker ile etiketleyerek uzatılmış kateterin eğim tarafını belirtin.
8. Uzatılmış kateteri,% 70 etanol ile kateter içinde yıkayarak, dı suyuyla durulayın. Kateteri hava kurutun.
9. Kullanmadan önce 10 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edin.

3. ön prosedür hazırlığı

1. Tüm yönetilen ajanlar steril tekniği altında biyolojik bir güvenlik kaputu olun.
2. 70% etanol ile çalışma alanını temizleyin.
3. % 70 etanol ile tüm cerrahi aletleri sterilize edin.
4. İş platformunun tabanına hemen araştırmacının önündeki bankta, C-kelepçeleri kitap tabanının bazal kanadına sabitleyerek düzelt.
5. Fareler içinde gelgit hava akımı tespiti için izin verecek cihazlar olan birkaç derme çatma spirometre, oluşturun. Kısaca, mevduat 60 μL sterilize tuz 1 ml şırınga içine (piston kaldırıldı) bir jel yükleme ucu ile.
   Not: salın yatırılan damlası varil okcludes ve yukarı ve aşağı hareket ederken gelgit havalandırma³maruz.
6. 22 G uzatılmış kateterin hub 'ını, derme çatma spirometreye gevşek bir şekilde takın.
7. Erişim kolaylığı için her bir cam damlası platformun her tarafına yerleştirin.
8. İzofluran indüksiyon odasını, izofluran uyumlu biyolojik Güvenlik kabininde kemirgen anestezi makinesine (bkz. malzeme tablosuna) bağlayın.

4. non-operatif It entübasyon yaklaşımı

1. Anestezize bir C57BL/6 fare (erkek veya kadın, 8 – 10 hafta, ~ 25 g) ile oksijen (2 L/dak) ve 5% izofluran (bkz. malzeme tablosu) bir indüksiyon odasında 4 dakika.
2. (Örneğin, Evans mavi boya veya FITC-dextran, Şekil 4' te gösterildiği gibi) İki pipet içine teslim edilecek deneysel Ajan aspirate, sonra sedasyon sırasında platformun her tarafına yerleştirin.
3. Fare anestezi indüksiyon odasından çıkarmadan önce yaklaşık 24 – 30 nefes/dakika bir solunum hızı sağlamak.
   Not: Isoflurane anestezi genellikle tüm ıB prosedürleri için yeterli 4 dakika sürmektedir. Operatör tekniği ile yetkin değilse, ketamin/xylazine (80 mg/kg ve 10 mg/kg intraperitoneally, bkz: malzeme tablosu) daha uzun süreli anestezi için kullanılabilir.
4. Fareyi, süpürme pozisyonunda bulunan drapeli dikiş çizgisinin üzerindeki Kesici taşları ile askıya alın. İki ile üç parça kanca ve döngü bant gevşek, havalandırma kısıtlama kaçınarak fare güvenli.
5. LED fiber optik aydınlatıcıyı açın (bkz. malzeme tablosu, Şekil 2C).
6. Operatör platformu (dorsal fare) arkasına konumlandırın.
7. Aydınlatıcıyla ilgili Gooseneck 'i, böylece ciltte larinks alanını aydınlatır. Fare ve ışık kaynağı arasındaki mesafe 2 – 3 cm 'dir (Şekil 2C).
8. Aşağıdaki tüm prosedürleri yapmadan önce bir ayak/pençe tutam ile anestezi derinliği onaylayın.
9. Steril forseps baskın el ile tutun, sonra forseps ile ağız boşluğunun dilini dışarı çizin.
10. Nondominant el ile steril depressor tutun, daha sonra yaygın orofarenks ortaya çıkarmak için depressor ile dilin kökünü düzleştirmek. Forseps sonra serbest bırakılabilir, baskın el serbest.
11. Genişletilmiş kateteri ağız boşluğu yoluyla trakeaya intübate etmek için baskın eli kullanın (Şekil 2C).
12. Şırıngadaki balonu her nefes ile yukarı ve aşağı hareket ederse gözlemleyerek yerleşimi onaylayın.
13. BT entübasyon ek detayları daha önce yayınlandı³. Anestezi hariç toplam prosedür süresi, iyi eğitimli bir operatör için 10 – 15 s sürer.

5. non-operatif ıB entübasyonu ve teslim yaklaşımlar

1. Distal sağ akciğerin seçici lober kanülasyon için IB yaklaşımı
   1. BT kanülasyon yaptıktan sonra (adım 4,11), plastik Pano Döndür + 30 ° (Şekil 4A).
   2. Kateterin hub 'ını tutun ve fare orta çizgisinin paralel olarak doğal olarak kılavuzluk et, Tablo 1' de açıklandığı gibi ağırlık bazlı derinliklere genişletin.
      Not: bu derinliklerdeki direnç unutulmamalıdır. Bu noktada, fare biraz tachypneic olacak, temsili sonuçlarında açıklandığı gibi. Deneyimli bir operatör için, yaklaşık 90% girişimleri başarılı bir şekilde sağ akciğer cannulate (Takipne ile belirtilmiştir).
   3. Jel yükleme ucu ile% 20 μL 0,3% Evans mavi boya (EBD, bkz. malzeme tablosu) sunun.
   4. Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0,1 ml her) dispense.
      Not: Bu, kalan EBD çözeltisi (veya deneysel ajanlar) kateterin içinden temizlenmesini sağlar.
   5. Kateter çekin, sonra 30 s için fare konumunu korumak.
   6. Bu bilinç geri gelene kadar hayvan bir ısınma Battaniye yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
2. Distal Sol akciğer seçici segmental kanülasyon ıB yaklaşımı
   1. BT kanülasyon yaptıktan sonra (adım 4,11), plastik tahta Döndür-74 ° (Şekil 4b).
   2. Kateterin hub 'ını tutun ve kateteri sola doğru bronş içine ilerlemek için nazik basınç uygulayın, hem aşağı doğru (90 °) hem de kitap ucunda mütevazı bir basınç yerleştiriniz. Tablo 1' de belirtilen derinliklerde, operatör sol akciğerin alt segmentleri meşgul olduğu için direnci dikkat etmelidir. Takipne oluşursa, kateteri 20 – 25 mm konumuna çekin ve yeniden deneyin.
   3. Sol alt akciğer segmentleri yazık sonra, pozisyon değişikliği Ajan yönetimi için yerçekimi yardımı sağlamak için gereklidir. Plastik panosu Döndür-30 ° (Şekil 4b).
   4. Jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD 40 μL sunun.
      Not: Sol akciğer sadece bir lob olduğundan daha büyük bir birim aracı sunmak için mümkündür.
   5. Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) dispense.
      Not: Bu, kateterin içinden herhangi bir kalıntı EBD (veya deneysel ajanların) temizlenmesini sağlar.
   6. Kateter çekin, sonra 30 s için fare konumunu korumak.
   7. Bu bilinç geri gelene kadar hayvan bir ısınma Battaniye yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
3. IB yönetiminin sol veya sağ akciğerin tamamının teslimatını sağlamak için adaptasyon
   Not: operatör, belirli bir sağ akciğer lob veya Sol akciğer segmentine değil, tüm akciğer (sağ veya Sol akciğer) için ajanlar teslim etmek istiyor, kateter aşağıdaki gibi, ilgili mainstem bronş biraz çekilmelidir.
   1. Sağ tüm akciğer yönetimi
      1. Adım 4,11 sonra, plastik tahta döndürmek + 30 ° (Şekil 5A).
      2. Kateterin merkezini tutun ve fare orta çizgisine paralel olarak doğal olarak yönlendirin ve sağ taraflı distal lober kanülasyon için gerekli derinliklere ulaşır (Tablo 1).
      3. Takipne tabelası görünümünü onaylayın.
      4. Ajan teslimi için yerçekimi yardımını etkinleştirmek için fare-74 ° çevirin (Şekil 5B).
      5. Kateteri sağ mainstem bronşın kalkışa karşılık gelen bir pozisyona çekin (Tablo 1). Kateterin eğimi aşağı doğru yüzmesini sağlayın (Şekil 5B).
      6. Sağ akciğere jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD% 30 μL sunun.
      7. Dispense 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) bir cam damlalar kullanarak hava.
      8. Kateteri çekin, ardından 30 s için fare pozisyonunu koruyun. hayvanı bir ısınma battaniyesi üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
   2. Sol tüm akciğer yönetimi
      1. Adım 4,11 sonra, plastik tahta döndürmek-74 ° (Şekil 6a). Alternatif olarak, adım 5.3.1.8 sonra, kateter trakea 'ya geri çekilerek, bilateral ıB ajanı yönetimini sağlayarak rotasyon ortaya çıkabilir.
      2. Kateterin hub 'ını tutun ve kateteri sola doğru kateter içine ilerlemek için nazik basınç uygulayın, hem aşağı doğru (90 °) hem de kitap ucunda mütevazı bir basınç yerleştiriniz. Entübasyon derinliği Tablo 1tarafından yönlendirilir.
      3. Hiçbir Takipne işaretini onaylayın.
      4. Aracı yönetimi ile yerçekimi yardımı için izin fare + 86 ° döndürün.
      5. Kateteri sola doğru soluna geri çekin (sağ akciğerle aynı mesafeler yeterli, Tablo 1) ve kateterin eğimi aşağı dönük olarak döndürün (Şekil 6B).
      6. Sol akciğere jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD 30 μL sunun.
      7. Dispense 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) bir cam damlalar kullanarak hava.
      8. Kateteri çekin, ardından 30 s için fare pozisyonunu koruyun. hayvanı bir ısınma battaniyesi üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.

6. her akciğere doz ayarlı hacimleri sunmak için sıralı ıB kanülasyon yaklaşımlarının kullanımı

1. BT yönetim grubu
   1. 4.1 – 4.11 adımda açıklandığı gibi BT kanülasyonu gerçekleştirin.
   2. Jel yükleme ucu ile 60 μL% 0,05% FITC-dextran (bkz. malzeme tablosu) sunun (Şekil 1B).
   3. Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) dispense.
   4. 60 s için pozisyon tutun ve yukarıda açıklandığı gibi fare kurtarma için izin verin.
2. Simetrik bilateral ıB yönetimi
   1. 5.3.1.1 adımları gerçekleştirin – 5.3.1.8 (sağ akciğer) ve adımlar 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (Sol akciğer).
   2. Akciğer her tarafı için 0,05% FITC-dextran (veya deneysel bir ajan) eşit birimler (30 μL) yönetin.
3. Doz ayarlı bilateral ıB yönetimi
   1. Adım 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (sağ akciğer) ve adımlar 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (Sol akciğer) gerçekleştirin.
   2. Daha büyük hacim (40 μL) yönetmek 0,05% FITC-dextran daha büyük sağ akciğer, ve daha küçük bir hacim (20 μL)% 0,05 FITC-dextran için küçük sol akciğer. FITC-dextran yerine deneysel bir ajan uygulanabilir.

7. tek doz bleomisin (BLM) indüklenen akciğer yaralanması simetri geliştirmek için doz ayarlı ıB yönetiminin kullanımı

1. BLM yönetim grupları
   1. Doz ayarlı ıB-BLM (1,2 mg/kg, bkz. malzeme tablosu) yönetim grubu: 60 μL (Sol akciğer Için 20 μl ve sırasıyla sağ akciğer Için 40 ΜL) BLM çözeltisi farelere teslim edildi (n = 5). Kontroller (n = 5) benzer miktarlarda tuz alındı.
      Not: 5.3.1 ve 5.3.2 adımlarına bakın.
   2. BT yönetim grubu: 60 BT yönetim teknikleriyle fareler için μL BLM çözeltisi teslim edildi.
      Not: adım 6.1.1 – 6.1.4 bakın.
2. Akciğer fonksiyon ölçümü
   1. Günde 21 BLM veya tuzlu sonra, bir intraperitoneal (IP) ketamin enjeksiyonu (160 mg/kg) ve xylazine (32 mg/kg) ile anestezize fareler.
   2. Pençe/ayak tutam ile anestezinin derinliğini onayladıktan sonra, 18 G kanül ile bir trakheostomi gerçekleştirin (bkz. malzeme tablosu).
   3. Daha önce açıklanan⁴, ventilatöre fareler bağlayın ve solunum mekaniği ölçmek.
3. Akciğer dokusu toplama ve işleme
   1. Pulmoner mekaniği ölçümü takiben, kardiyak delinme tarafından anestezize fareler ötenize.
   2. Göğüs duvarını açın ve bilateral pnömotorasları teşvik et.
   3. Akciğerleri% 1 düşük Melt agaroz (40 °c)⁵ ' te PBS 'de tutarlı bir basınçla (42 cm H₂O) şişirin.
   4. Uzun eksen boyunca akciğer dört ila beş adet kesim transversely,% 10 formalin düzeltmek ve parafin katıştırmak.
   5. 5 μm bölüm kesip kolajen biriktirme görselleştirmek için Masson 's trikrom ile leke.

8 Post-usul bakım

1. Hayatta kalma prosedürleri sonunda, bilinçlendirme kadar hayvan bir ısınma Battaniye üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.

Sonuçlar

Seçmeli ıB entübasyon belirli lobları (sağ akciğer) veya baziler segmentlerini (Sol akciğer) hedefler.

EBD 'nin sağ akciğere IB yönetimi, 5,1 bölümünde açıklandığı şekilde gerçekleştirildi. Denemenin tamamlandıktan sonra fareler ölümcül dozda intraperitoneal ketamin/xylazine uygulanmıştır ve akciğer EBD dağılımı gösterimi için hasat edildi (Şekil 4A

Tartışmalar

Akciğer hasarı klasik olarak BLM⁶gibi ZARARLı ajanlar BT yönetimini kullanarak kemirgenler modellenmiştir. Böyle bir BT yönetimi, ancak, sadece bu yaklaşım ile akciğer teslimat hedefsiz doğası yansıtan, yamalı yaralanma yol açar⁷. Akciğer yaralanması modelleme bu sınırlamalar ilaçlar, siRNA veya hücresel tedaviler gibi non-zararlı deneysel ajanlar, It teslim çalışırken karşılaştığı öğretici zorluklar vardır.

Bu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine