미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

요약

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

초록

미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.

서문

미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다^2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법³ 및 전자 현미경 검사법 (EM)⁴ 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한 얇은 섹션은 깨지기 쉬운 formvar 필름 코팅 한 홀 TEM 그리드에 수집됩니다. 필름이 하나의 거드에서 파손되면 직렬 이미징 및 볼륨 재구성이 불가능합니다. 직렬 블록-얼굴 주사 전자 현미경 검사법 (SBEM)은 다이아몬드 나이프 (Dik-SBEM) 또는 초점 이온 빔 (FIB-SEM) ^{중 하나와 주사 전자 현미경 (SEM) 진공 챔버 내부 파괴적인 enbloc 절편을 사용하는 3DEM에 대한 인기있는 기술입니다 6}. 그러나 이러한 기술은 모든 시설에서 사용할 수 없기 때문에 직렬 단면 및 SEM을 사용하여 배열 단층 촬영 7을 권장합니다. 어레이 단층 촬영에서, 울트라 마이크로 톰을 사용하여 절단 된 직렬 섹션은 TEM 그리드 대신 유리커버 슬립으로 전송되고 빛 현미경 검사법 및 SEM 8을 통해 시각화됩니다. 백스캐터 전자(BSE) 이미징신호를 향상시키기 위해 오스뮴 테트옥사이드(OsO 4)-오스미오필릭티오카르보하이드라지드(TCH) 9를 사용하는 고정형 세포를활용한 엔블록 EM 염색 프로토콜을 활용하여, 없이 이미지를 얻을 수 있게 되었습니다. 포스트 임베딩 이중 염색.

부가적으로, 미토콘드리아 마커 SCO1(시토크롬 c 산화다아제 어셈블리 단백질 1)-아스코르브베이트 과산화아제 2(APEX2)¹⁰ 분자 태그를 EM 수준에서 미토콘드리아를 가시화하는 데 사용되었다. APEX2는 약 28 kDa이며 대두 아스코르브베이트 과산화수지11에서 유래된다. 녹색 형광 단백질 태그 단백질이 가벼운 현미경 검사법에서 사용되는 것과 같은 방식으로 EM 수준에서 특정 단백질의 상세한 위치를 보여주기 위해 개발되었습니다. APEX2는 3,3' -다미노벤지딘(DAB)을 공동인자 과산화수소(H2O2)의 존재 시 태그 부위에 불용성OSMiophilic 폴리머로 변환합니다. APEX2는 EM에서 전통적인 항체 라벨링의 대안으로 사용될 수 있으며, 전체 세포의 깊이에 걸쳐 단백질 국소화를 할 수 있다. 즉, APEX2 태그가 부착된 단백질은 초저온 절제 후 면역골 표지 및 투과없이 특이적 삼투압(11)에 의해 가시화될 수 있다. 고추냉이 과산화 효소(HRP)는 또한 H2O2-의존적DAB를 국부화된 침전물 내로 촉매시키는 민감한 태그이며, OsO_4로처리한 후 EM 대비를 제공한다. ER 표적 펩티드 서열 HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)(12)을 전체 세포 내에서 ER을 시각화하기 위해 적용하였다. 감소된 오스뮴 및 TCH(rOTO 방법)로 유전적 태그 및 enbloc 염색을 활용하는 우리의 프로토콜을 평가하기 위해, 동시에 삼투유 효과를 사용하여, 우리는 rOTO en bloc 염색에서 각 유전자 태그의 사용 없이 막 대비를 비교하였다. APEX 및 HRP를 가진 배열 단층 촬영 및 DAB 염색을 가진 3DEM이 각각, 그밖 목적을 위해 이용되었더라도, 우리가 미토콘드리아와 ER 라벨링을 위한 3DEM및 DAB 염색을 위한 배열 단층 촬영을 결합했기 때문에 우리의 프로토콜은 유일합니다. 특히, 우리는 세포에 대한 유전자 변형의 효과를 조사하는 데 도움이 같은 섹션에서 APEX 태그 유전자없이 다섯 세포를 보여 주었다.

프로토콜

1. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드 벡터를 가진 패턴격자 배양 접시 및 세포 형질혈을 가진 세포 배양

1. 종자 1 x 10⁵ HEK293T 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에서 37 °C에서 5 % CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 35mm 유리 그리드 바닥 배양 접시에 배치하여 10 % 태아 소 혈청, 100 U / mL로 보충했습니다. 페니실린, 및 100 U / mL 연쇄상 구균.
2. 세포를 파종 한 다음 날, 50 %-60 % 컨플루앙으로 성장했을 때 제조업체의 지침에 따라 형질 감염 시약을 사용하여 세포에 SCO1-APEX2¹⁰ 및 HRP-KDEL¹² 플라스미드를 도입하십시오 (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg + HRP-KDEL 플라스미드 DNA 0.5 μg 당 3 μL 트랜스펙션 시약).

2. 패턴 배양 접시에 성장하는 세포의 가벼운 현미경 검사법 및 APEX2 및 HRP를 위한 DAB 염색

1. 형질전환 후 16-24시간에서, 모든 배양 배지를 제거하고 즉시 250 μL의 따뜻한(30-37°C) 고정 액액을 첨가한다(표 1)에 부드러운 파이펫팅을 한다. 즉시 고정 용액을 제거하고 1.5 mL의 새로운 고정 솔루션으로 교체하십시오. 60분 동안 얼음 위에 배양한 다음, 얼음-차가운 0.1 M 나트륨 카코디산완충제1mL에각각 10분동안 3회 세척한다(표 1).
   주의: 알데히드 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.
2. 차가운 (0-4 °C) 20 mM 글리신 용액 1 mL을 추가하고 얼음에 10 분 동안 배양한 다음 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액의 1 mL에서 각각 5 분의 3 번의 세차서를 넣습니다.
3. 신선한 1x DAB 용액(0.3M 카코디레이트 용액 3.33 mL + 30% H₂O2 + 5.67 mL의 냉수 + 1 mL 10x DAB 용액)을 준비합니다.
4. 신선하게 제조된 1x DAB 용액(단계 2.3)의 500 μL을 추가하고 뒤집힌 빛 현미경 아래에서 밝은 갈색 얼룩이 보일 때까지약 5-45분 동안 얼음위에 배양합니다(그림 1A).
5. DAB 용액을 부드럽게 제거하고 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액 1mL로 각각 10 분 동안 3 회 헹구십시오.
6. 위상 대비 반전 현미경(또는 밝은 필드 광 현미경)을 사용하여 100배 이상의 배율로 DAB 염색을 시각화합니다. 관심 영역(ROI)이 있는 유리의 맨 아래에 마커 펜을 표시합니다(그림1B,C).

3. EM 블록에 대한 샘플 준비

1. 단계 2.1-2.6에 기재된 바와 같이 세포 배양 및 DAB 염색을 수행한다.
2. 1 mL의 2%로 시료를 4°C에서 1시간 동안 OsO_4를 감소시다.
   주의: OsO₄ 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.
3. 3.2단계에서 새로운TCH 용액(표 1)을 준비하고 0.22-μm 필터를 통과한다.
   주의: TCH 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오.
4. 1 mL의 증류수로 고정물을 제거하고 실온(RT)에서 각각 5분 동안 헹구어 보시고 헹구어 보시기합니다.
5. RT에서 이전에 제조되고 여과된 TCH 용액의 1 mL에 세포를 20분 동안 놓습니다.
6. RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.
7. RT에서 30분 동안 증류수에 2% 오스뮴 테트옥사이드의 1 mL에 세포를 두 번째로 노출시켰다.
8. RT에서 증류수 1mL로 3회 고정식을 제거하고 3회 헹구십시오.
9. RT에서 증류수 1 mL에서 세포를 3 회 5 분 동안 씻으소서.
10. 30 분 동안 60 °C에서오븐에 미리 따뜻한 월튼의 납 아스파타트 용액 (표 1).
11. 미리 데운 납 아스파르타액 1mL를 첨가하여 월튼의 납 아스파르타액으로 세포를 염색한 다음 60°C에서 30분 동안 오븐에 넣습니다.
12. RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.
13. 2mL 에탄올 aliquots의 등급시리즈로 배양(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) RT에서 각각 20 분 동안.
14. 에탄올을 3:1 에탄올의 1 mL에서 30분 동안 배양하였다:RT에서 저점도 임베딩 혼합물 배지.
15. 배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:1 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 넣습니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
16. 배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:3 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 삽입합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
17. 배지를 제거하고 100% 저점도 임베딩 배지의 1 mL를 추가하고 밤새 배양합니다.
18. 샘플을 100% 저점도 임베딩 혼합물에 넣고 60°C에서 24시간 동안 배양합니다.
19. 울트라 마이크로토메를 사용하여 90-nm 두께의 섹션을 준비합니다.
20. 200 kV에서 TEM 아래의 그리드를 관찰하십시오.

4. SEM 이미징을 위한 인듐 주석 산화물 코팅 커버슬립에 직렬 단면 및 장착

1. 기판 준비
   1. 30-60s의 이소프로판올에서 부드럽게 교반하여 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 커버슬립 (22mm x 22mm)을 청소하십시오.
   2. 커버립을 제거하고, 여분의 이소프로판올을 빼내고, 건조해질 때까지 먼지가 없는 환경에 두십시오.
   3. 1분 동안 플라즈마 코팅기를 사용하여 광섬유 배출에 의해 ITO 코팅 유리 커버슬립을 처리합니다.
      참고 : 플라즈마 활성화는 기판 표면에 친수성 특성을 부여합니다. 단면이 기판에 부착될 때 섹션내의 주름 형성을 방지하기 위해 기판 상에 매우 얇은 물 막을 생성한다.
   4. ITO 코팅 유리 커버를 기판 홀더에 삽입하고 칼 보트에 넣습니다.
2. 샘플 블록 및 직렬 단면 트리밍
   1. 샘플 블록을 울트라마이크로토메의 샘플 홀더에 넣고 트리밍 블록에 넣습니다.
   2. 면도날을 사용하여 대상 위치 주위의 모든 여분의 수지(단계 2.6, 그림 1D-G에서식별)를 다듬습니다. 블록 면의 모양은 사다리꼴 또는 직사각형이어야 합니다. 선행 가장자리와 후행 가장자리는 절대적으로 평행해야 합니다(그림1H,I).
   3. 샘플 홀더를 울트라마이크로톤의 팔에 삽입하고 다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 넣습니다. ITO 유리 커버슬립을 리본 캐리어에 삽입하고 핸들로캐리어를 고정합니다(그림 1J). 리본 캐리어를 칼 보트에 넣고 여과 된 증류수로칼 보트를 채웁니다 (그림 1K).
   4. 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 ITO 유리의 가장자리를 칼에 가깝게 설정하여 칼의 슬라이드로 캐리어위치를 조정합니다(그림 1L).
   5. 절편을 절단 한 후, 절편 과정을 중지하고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트 (초당 물 한 방울의 유량)를 배수.
   6. 리본 수집 과정을 완료한 후, 클램핑 장치의 손잡이로 기판을 제거하고리본을 건조시다(도 1M).

5. SEM의 이미징 및 SEM 이미지 스택정렬

1. 끈적끈적한 카본 테이프로 알루미늄 스텁에 ITO 코팅 커버슬립을 장착합니다. 끈적끈적한 탄소 테이프로 스텁의 유리 표면과 표면을 밀봉한 다음 10-nm두께의 탄소 층으로 코팅합니다(그림 1N).
2. 5kV의 낮은 가속도 전압과 효율적인 BSE 수집을 위한 적절한 작업 거리에서 현장 방출 SEM에서 ITO 코팅 커버슬립을 관찰합니다.
3. 가상 스택 옵션을 사용하여 직렬 이미지를 이미지 J 소프트웨어(Fiji)^13으로 가져옵니다. 새 TrakEM^14를열고 이미지 스택을 TrakEM으로 가져옵니다. 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하고 정렬 메뉴를 선택합니다.
4. 그런 다음 첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지 이미지 범위를 선택합니다. 자동 정렬을 완료하고 정렬된 데이터 집합을 저장한 다음 내보내기를 선택하여 선택한 이미지 범위(첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지)에서 플랫 이미지를 컴파일합니다. 마지막으로, 이미지 J 메인 메뉴에 AVI 형식으로 평면 이미지 데이터를 저장합니다.
   참고: 보조 동영상 1과 추가 동영상 2는 각각 SEM 이미지 스택과 잘림된 이미지 스택을 표시합니다.

6. 직렬 이미지에서 미토콘드리아 및 ER의 세분화

1. IMOD¹⁵ 소프트웨어에서 3dmod를 시작하고 이미지 파일을 엽니 다.
2. ZaP 창에서 중간 마우스 단추를 사용하여 미토콘드리아와 ER의 윤곽을 그립니다.
3. 분할된 볼륨을 시각화하려면 모델 뷰 창(추가동영상3)을 엽니다.

결과

그림 1은 이 프로토콜의 일정및 워크플로를 설명합니다. 프로토콜은 7 일이 필요합니다. 그러나 SEM 이미징에 소요된 시간에 따라 증가할 수 있습니다. 세포 형질감염의 경우, 세포의 결합은 전체 그리드 플레이트의 바닥을 덮지 않도록 제어되어야 한다(도1A). 높은 세포 밀도는 빛 현미경 및 EM 관찰 도중 관심 있는 세포의 확인을 방지할 수 있었습니다. 우리는 배양 접시에 ...

토론

EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호^16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga