Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Riepilogo

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Abstract

L'uso delle colture cellulari primarie è diventato uno dei principali strumenti per studiare il sistema nervoso in vitro. L'obiettivo finale dell'utilizzo di questo sistema di modelli semplificato è quello di fornire un microambiente controllato e mantenere l'alto tasso di sopravvivenza e le caratteristiche naturali delle cellule neuronali e non neuronali dissociate il più possibile in condizioni in vitro. In questo articolo, dimostriamo un metodo per isolare i neuroni primari dal cervelletto del topo in via di sviluppo, collocandoli in un ambiente in vitro, stabilendo la loro crescita e monitorandone la fattibilità e la differenziazione per diverse settimane. Questo metodo è applicabile ai neuroni embrionali dissociati dal cervelletto tra i giorni embrionali 12-18.

Introduzione

Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell'uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell'utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro¹. L'errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni^2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un'altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l'apoptosi⁶.

Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l'ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l'invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l'angiogenesi possono essere studiate⁷. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell'utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell'imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l'uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell'asotomia, che porta all'inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale⁸.

Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici⁹. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule⁶.

Conoscere la "data di nascita" di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E12¹⁰.

Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P7¹¹. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell'E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell'anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7^{rispettivamente 11,12,13,14 ,15}. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l'invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E9¹⁶.

Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.^17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo¹⁹. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya¹⁷. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali e la Guida alla cura e all'uso degli animali sperimentali del Canadian Council for Animal Care ed è stata approvata dalle autorità locali ("il Bannatyne Campus Animal Care Commissione"). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati. Un'adeguata profondità di anestesia è stata confermata osservando che non vi è stato alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata alla manipolazione e al pizzico o al riflesso corneale.

1. Preparazione

NOTA: programmare la fornitura di topi incinta a tempo, in base al piano di ricerca, per la E12–E18 post-concetto. La scelta della temporizzazione dipende dalle caratteristiche delle celle desiderate (vedere di seguito). Preparare i coperchi di copertura e le piastre almeno 2 giorni prima dell'esperimento. Poly-L-ornitine viene utilizzato come materiale di rivestimento per migliorare l'attaccamento cellulare agli scivoli di copertura.

1. Cappotto il coperchio scivola 2 giorni prima dell'isolamento cellulare.
   1. Collocare i coperchi rotondi in una piastra da 24 pozzetti, in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza. Lasciare un divario tra ogni slittamento di copertura per evitare qualsiasi contaminazione.
   2. Aggiungete 90 l di poli-L-ornitina (PLO, 500 g/mL) al centro di ogni cover slip. Chiudere il tappo e posizionare delicatamente la piastra in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
      NOTA: un volume maggiore può fuoriuscire dagli scivoli di copertura durante l'incubazione. La cover slip non deve essere completamente coperta con LLo dopo aver inserito una goccia. Durante l'incubazione notturna, l'OLP distribuisce equamente sul bordo delle schedini di copertura.
2. Un giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare il mezzo di coltura I (DMEM/F-12 contenente putrescina 100 m, sodio selenite 30 nM, L-glutammina 3,9 mM, gentamicin 3,5 g/mL, tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/mL e supplementi N3 [progesterone 4M, insulina 20g/mL, transferrin 20 mg/mL)) e mezzo di seeding (medio di coltura I [senza N3 e T3] contenente 10% siero bovino fetale [FBS]) e conservarli in 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro trypsin (0,25%) In DMEM/F12 e mantenerlo a 4 gradi centigradi.
   NOTA: le composizioni medie sono riportate nella Tabella 1.
3. Il giorno dell'isolamento cellulare, posizionare il mezzo di coltura I e il mezzo di semina nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.
   NOTA: prima di iniziare l'isolamento del cervelletto, assicurarsi che tutti gli utensili e le superfici di lavoro siano sterili.
4. Lavare i coperchi.
   1. Togliere la piastra 24 dell'incubatrice.
   2. Lavare i coperchi del coperchio nella piastra 3x del pozzo 24 con acqua a doppia distillazione (DDW) in un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili. Ogni volta lasciare che il coperchio scivola in ammollo in DDW per 5 min prima di iniziare l'aspirazione.
   3. Lasciare il coperchio del coperchio in un armadio di biosicurezza per almeno 2 h per asciugare completamente.

2. Collezione Cervelletto

1. Preparare tre piatti Petri in plastica sterile da 10 cm pieni di salina ghiacciata 1x tamponata da fosfati (PBS), 3 piatti Petri pieni di soluzione di sale bilanciato 1x Hank (HBSS) e circa 5 piatti Petri pieni di mezzi di dissezione ghiacciati (1x HBSS) contenente gentamicin 10 g/mL). Tienili sul ghiaccio.
2. Anestesizzare il topo incinta E18 CD1 con 40% isoflurane. Eseguire lussazione cervicale sul mouse. Sterilizzare l'addome con una soluzione di etanolo del 70%.
3. Utilizzare un paio di forbici per fare un'incisione cutanea dalla simfia pubica al processo xifoide. Quindi tenere la pelle con pinze e aprire la cavità addominale.
4. Accisa le corna uterine con pinze e lavelatridimensionale 3x nel 1x PBS ghiacciato sul ghiaccio.
   NOTA: I seguenti passaggi devono essere condotti tutti sul ghiaccio per ridurre al minimo il tasso metabolico e prevenire danni ai tessuti e alle cellule.

3. Dissecting il cervelletto

1. Dopo l'ultima fase di lavaggio, l'uso di un paio di pinze sottili separano gli embrioni dall'utero in 1x HBSS e li trasferiscono sul mezzo di dissezione ghiacciato. Nel mezzo di dissezione, decapitare gli embrioni con le forbici. Collocare il tessuto in un mezzo di dissezione pulito.
   NOTA: l'utilizzo di uno stereoscopio per la microdissezione è facoltativo.
2. Tenere il cranio con pinze sottili e tagliare il calvario con un paio di piccole forbici dall'aspetto laterale del cranio in una linea dal forame magnum al meatus acustico esterno e bordo inferiore della cavità orbitale.
   NOTA: Prendendo questo passo espone la cavità cranica a livello della base del cranio e rende più facile rimuovere il cervello.
3. Usando un paio di pinze sottili, rimuovi la base del cranio e staccate il cranio dal cervello.
4. Rimuovere con attenzione le meningi sul cervelletto, a partire dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e pons.
5. Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello (Figura 1).
6. Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in uno sterile tubo conico da 15 mL riempito con 14 mL di DMEM/F12 sul ghiaccio.
7. Centrifugare il tubo a 1.000 x g, 4 gradi C per 1 min, 3x. Rimuovere delicatamente il supernatante con una pipetta e risospendere il pellet in fresco, ghiacciato DMEM/F12.
   NOTA: Per evitare di perdere i campioni, utilizzare l'aspirazione dell'armadio il meno possibile.

4. Dissociazione del cervelletto

1. Aggiungere 2 mL di prova preriscaldato (37 gradi centigradi) al pellet dal punto 3.7 e convogliare delicatamente per un'adeguata miscelazione.
2. Collocare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 12 min.
3. Dopo l'incubazione, portare il tubo in un armadietto di biosicurezza e aggiungere 10 mL di DMEM/F12 per inattivare la trypsin.
4. Centrifugare la miscela a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in DMEM/F12 fresco. Ripetere 3x.
5. Prewet un tubo di trasferimento di plastica sterile con DMEM/F12.
6. Dopo il lavaggio e la centrifugazione finale, aggiungere 3,5 mL di soluzione di lavoro DNase (1 mL di soluzione stock DNase I [0.05% DNase - 12 mM MgSO₄ x 1x HBSS] in 500 l di FBS inattivato dal calore e 2 mL di DMEM/F12) al pellet nello stesso tubo.
7. Triturare il tessuto con un pipet almeno 30x fino a quando la miscela raggiunge un colore lattiginoso omogeneo.

5. Raccolta di celle

1. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 ghiacciato alla miscela.
2. Centrifugare il campione a 1.200 x g, 4 gradi centigradi per 5 min.
3. Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet.
4. Rimuovere il supporto di seeding dall'incubatrice.
5. Aggiungere al pellet 500 l l di mezzo di semina preriscaldato e mescolare molto bene utilizzando un pipet per risospendere le cellule.
6. Contare le cellule usando un emocitometro.
7. Diluire la sospensione cellulare con il mezzo di semina a una densità di 5 x 10⁵ celle / mL.
8. Sotto un armadietto di biosicurezza, aggiungere 90 l della miscela diluita ad ogni pozzo al centro dello slitta di copertura.
   NOTA: non caricare le particelle che non sono stati sospesi nel DNase.
9. Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 3/4 h.
10. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 l of prewarmed culture medium I ad ogni pozzo e riporre la piastra nell'incubatrice (37 gradi centigradi).

6. Trattamento delle cellule recuperate

1. Dopo 7 giorni, sostituire il vecchio mezzo con il medio di coltura fresco II (medio di coltura Ho integrato con citosina arabinoside [Ara-C, 4 M] e 100 album del siero bovino g/mL [BSA]; vedi tabella 1).
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per evitare la crescita delle cellule non neuronali.
2. Monitorare il mezzo di coltura una volta al giorno. Se il pH cambia (indicato da un marcato cambiamento di colore, di solito più giallo), rimuovete la metà (quasi 250 gradi) del vecchio mezzo da tutti i pozzi e aggiungete 300 l di mezzo di coltura preriscaldato I a ciascuno di essi per evitare la perdita di nutrienti.
   NOTA: Il fenolo rosso nel mezzo di coltura è un buon indicatore del pH del mezzo e dell'attività delle cellule. Cercare di ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule al di fuori delle condizioni di incubatrice. Questo previene qualsiasi stress che potrebbe influenzare la loro vitalità.

7. Raccolta e fissazione delle cellule

NOTA: A seconda del progetto sperimentale, le cellule possono essere raccolte in qualsiasi giorno, in qualsiasi momento.

1. Preparare una piastra di 24 pozze separate con l'organizzazione numerica corrispondente e aggiungere 100 -L di 4% paraformaldeide (PFA) ad ogni pozzo.
2. Per raccogliere le cellule nei giorni desiderati (a seconda del protocollo sperimentale), rimuovere delicatamente gli slittamenti di copertura dai pozzetti della piastra di coltura originale e metterli nei corrispondenti pozzi della piastra riempita da PFA.
3. Aggiungere PFA ai pozzi per immergere completamente i copricopro.
   NOTA: Per evitare il distacco delle celle dalla distinta di copertura, non aggiungere l'APFa direttamente sulla distinta di copertura.
4. Mantenere la piastra PFA a 4 gradi centigradi per 30-120 min.
5. Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente.
6. Lavare delicatamente il coperchio 3x per 5 min con 1x PBS.
7. Procedere al processo di immunostaining.
   NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza dotato di fotocamera per catturare le immagini e assemblato in montaggi utilizzando un'applicazione software di editing delle immagini.

Risultati

Sulla base delle diverse date di nascita dei sottotipi neuronali nel cervelletto, le colture degli embrioni di topo E12-E18 hanno prodotto diversi tipi di cellule. I neuroni di grande proiezione, come i neuroni CN (E9-E12) e i PC (E10-E13), sono emersi all'inizio durante lo sviluppo del cerebellar. Nei topi, le cellule di granulosi e Golgi sorsero tra gli e13 e l'E18 e subirono divisioni terminali fino alla settimana postnatale 4.

Sostituire il vecchio mezzo I con il medio fresco II nei giorni...

Discussione

L'uso delle culture primarie è un metodo ben noto applicabile a tutti i tipi di neuroni^17,18,19. Nel protocollo presentato, spieghiamo come isolare i neuroni cerebellari e mantenere la loro vitalità con la sopravvivenza ottimale in vitro per un massimo di 3 settimane. La coltura primaria delle cellule cerebellari, che sono state isolate all'E15-E18, conferma la raccolta di tre classi di grandi neuroni: PC, cellule Golgi e CN. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Photoshop CS5 Version 12	Adobe Inc
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)	Sigma	S0438	3 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A3608
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)	CB38	1/5000 dilution
CALB1	Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)	300	1/1000 dilution
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)	Millipore Sigma	C1768
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Dressing Forceps	Delasco	DF-45
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12)	Lonza	12-719F
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	fisher scientific	12-545-81
Gentamicin	Gibco	15710-064
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Insulin from bovine pancreas	Millipore sigma	I5500, I6634, I1882, and I4011
Large Scissor	Stoelting	52134-38
L-glutamine	Gibco	25030-081
Metallized Hemacytometer	Hausser Bright-Line	3100
Microdissection Forceps	Merlan	624734
Pattern 5 Tweezer	Dixon	291-9454
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher BioReagents	BP399-26
Poly-L-Ornithine	Millipore Sigma	P4638
Progesteron (P4)	Millipore sigma	P8783
PVALB	Swant Swiss Antibodies	235	1/1500 dilution
Samll Scissor	WPI Swiss Scissors, 9cm	504519
Sodium Selenite	Millipore Sigma	S9133
Transferrin	Millipore Sigma	T8158
Tri-iodothyronine (T3)	Millipore Sigma	T2877
Trypsin	Gibco	15090-046
Zeiss Fluorescence microscope	Zeiss	Z2 Imager