Indurre l'epilessia post-traumatica in un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche diffuse ripetitive

Riepilogo

Questo protocollo sistematico descrive un nuovo modello animale di epilessia post-traumatica dopo una lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva. La prima parte descrive i passaggi per l'induzione traumatica delle lesioni cerebrali utilizzando un modello di goccia di peso modificato. La seconda parte fornisce istruzioni sull'approccio chirurgico per i sistemi di acquisizione di dati elettroencefalografici a singolo e multicanale.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di epilessia acquisita. TBI può provocare una lesione cerebrale focale o diffusa. Lesione focale è il risultato di forze meccaniche dirette, a volte penetrando attraverso il cranio, creando una lesione diretta nel tessuto cerebrale. Questi sono visibili durante l'imaging cerebrale come aree con con contusione, lacerazione ed emorragia. Le lesioni focali inducono la morte neuronale e la formazione di cicatrici gliali e sono presenti nel 20%-25% di tutte le persone che incorrono in un TBI. Tuttavia, nella maggior parte dei casi di TBI, la lesione è causata da forze di accelerazione-decelerazione e successiva tosatura dei tessuti, con conseguente danno non focale e diffuso. Una sottopopolazione di pazienti affetti da TBI continua a sviluppare l'epilessia post-traumatica (PTE) dopo un periodo di latenza di mesi o anni. Attualmente, è impossibile prevedere quali pazienti svilupperanno PTE e le crisi epilettiche nei pazienti affetti da PTE sono difficili da controllare, rendendo necessaria un'ulteriore ricerca. Fino a poco tempo fa, il campo era limitato a soli due modelli animali/roditori con convulsioni post-traumatiche spontanee convalidate, entrambe con gravi lesioni focali con massiccia perdita di tessuto nella corteccia e talvolta strutture subcorticali. A differenza di questi approcci, è stato determinato che la TBI diffusa indotta utilizzando un modello di caduta di peso modificato è sufficiente per avviare lo sviluppo di crisi convulsive e non convulsive spontanee, anche in assenza di lesioni focali o perdita di tessuto. Simile ai pazienti umani con epilessia post-traumatica acquisita, questo modello presenta un periodo di latenza dopo l'insorgenza del sequestro. In questo protocollo, la comunità sarà dotata di un nuovo modello di epilessia post-traumatica, descrivendo in dettaglio come indurre TBI non lesionale diffusa seguita da un monitoraggio continuo degli animali video-elettroencefalografici a lungo termine nel corso di diversi mesi. Questo protocollo descrive in dettaglio la gestione degli animali, la procedura di caduta del peso, il posizionamento degli elettrodi per due sistemi di acquisizione e le frequenti sfide incontrate durante ciascuna delle fasi dell'intervento chirurgico, del monitoraggio postoperatorio e dell'acquisizione dei dati.

Introduzione

Ogni anno TBI colpisce circa 60 milioni di persone in tutto il mondo. Gli individui interessati sono a più alto rischio di sviluppare l'epilessia, che può manifestarsi anni dopo la lesione iniziale. Anche se i TBI gravi sono associati a un rischio più elevato di epilessia, anche la TBI lieve aumenta la probabilità di un individuo di sviluppare l'epilessia^1,2,3^,4. Tutti i TBI possono essere classificati come focali, diffusi o una combinazione di entrambi. Lesione cerebrale diffusa, presente in molti se non in tutti i TBC, è il risultato di tessuti cerebrali di densità diverse tosatura contro l'altro a causa di accelerazione-decelerazione e forze rotazionali. Per definizione, la lesione diffusa si verifica solo in isolamento in lesioni cerebrali miti/concussive non penetranti, in cui nessuna lesione cerebrale è visibile sulle scansioni tomografiche computertiche⁵.

Ci sono attualmente due problemi critici nella gestione dei pazienti che hanno, o sono a rischio di, lo sviluppo di epilessia post-traumatica (PTE). Il primo è che una volta che la PTE si è manifestata, le crisi sono resistenti ai farmaci antiepilettici disponibili (AED)⁶. In secondo luogo, gli ED sono ugualmente inefficaci nella prevenzione dell'epilettia e non esistono approcci terapeutici alternativi efficaci. Per affrontare questo deficit e trovare migliori obiettivi terapeutici e candidati per il trattamento, sarà necessario esplorare nuovi meccanismi cellulari e molecolari alla radice di PTE⁶.

Una delle caratteristiche principali dell'epilessia post-traumatica è il periodo latente tra l'evento traumatico iniziale e l'insorgenza di crisi spontanee, non provocate e ricorrenti. Gli eventi che si verificano all'interno di questa finestra temporale sono un focus naturale per i ricercatori, perché questa finestra temporale potrebbe consentire il trattamento e la prevenzione del PTE del tutto. I modelli animali sono più comunemente utilizzati per questa ricerca perché offrono diversi vantaggi distinti, non ultimo dei quali è che il monitoraggio continuo dei pazienti umani sarebbe sia impraticabile e costoso su tali intervalli di tempo potenzialmente lunghi. Inoltre, i meccanismi cellulari e molecolari alla radice dell'epileptogenesi possono essere esplorati solo in modelli animali.

I modelli animali con convulsioni post-traumatiche spontanee ed epilessia sono preferiti rispetto ai modelli in cui le convulsioni sono indotte dopo la TBI con mezzi meno fisiologici, come ad esempio mediante chemioconvulsivi o stimolazione elettrica acutamente, cronicamente o per accensione. Modelli spontanei di crisi post-traumatica testano come il TBI modifidi la rete cerebrale sana che porta all'epilettia. Gli studi che utilizzano una stimolazione aggiuntiva dopo il TBI valutano come l'esposizione al TBI riduce la soglia di convulsione e influisce sulla suscettibilità alle crisi epilettiche. I vantaggi dei modelli animali con crisi epilettiche indotte chimicamente o con stimolazione elettrica sono nel testare i meccanismi specifici della rifrattanza agli DAE e l'efficacia dei DAE esistenti e nuovi. Tuttavia, il grado di pertinenza e la traduzione di questi dati nell'uomo può essere ambiguo⁷ a causa dei seguenti: 1) i meccanismi di convulsione possono essere diversi da quelli indotti dalla sola TBI; 2) non tutti questi modelli portano a crisi spontanee⁷; 3) le lesioni create dall'agente convulso stesso, con la cannula necessaria per la sua consegna, o stimolando il posizionamento degli elettrodi in strutture di profondità (ad esempio, l'ippocampo o l'amigdala) possono già causare una maggiore suscettibilità organizzativa e persino potenziali di campo epilettico ippocampali⁷. Inoltre, alcuni agenti convulsivi (cioè l'acido kainico) producono lesioni ippocampali dirette e sclerosi, che non è tipica dopo la TBI diffusa.

Fino a poco tempo fa, esistevano solo due modelli animali di epilessia post-traumatica: impatto corticale controllato (CCI, focale) o lesione di percussioni fluide (FPI, focale e diffusa)⁸. Entrambi i modelli provocano grandi lesioni focali a fianco di perdita di tessuto, emorragia, e gliosi in roditori⁸. Questi modelli imitano l'epilessia post-traumatica indotta da grandi lesioni focali. Uno studio recente ha dimostrato che la TBI diffusa ripetuta (3x) è sufficiente per lo sviluppo di convulsioni spontanee ed epilessia nei topi anche in assenza di lesioni focali⁹, aggiungendo un terzo modello PTE di roditori con convulsioni ricorrenti spontanee confermate. Questo nuovo modello imita i cambiamenti cellulari e molecolari indotti dalla TBI diffusa, rappresentando meglio la popolazione umana con TTB lievi e concussive. In questo modello, il periodo latente di tre settimane o più prima dell'insorgenza del sequestro e l'emergere di crisi epilettiche tardive, spontanee e ricorrenti, consentono di studiare le cause profonde dell'epilettia post-traumatica, testando l'efficacia di approcci preventivi e nuovi candidati terapeutici dopo l'insorgenza del sequestro e ha il potenziale per lo sviluppo di biomarcatori di epiptogenesi epilessia post-traumatica perché circa la metà degli animali sviluppa post-epilepposizione.

La scelta del modello animale per lo studio dell'epilessia post-traumatica dipende dalla questione scientifica, dal tipo di lesione cerebrale studiata e dagli strumenti che verranno utilizzati per determinare i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. In definitiva, qualsiasi modello di epilessia post-traumatica deve dimostrare sia l'emergere di crisi epilettiche spontanee dopo la TBI sia un periodo di latenza iniziale in un sottoinsieme di animali TBI, perché non tutti i pazienti che incorrono in un TBI continuano a sviluppare l'epilessia. Per fare questo, l'elettroencefalografia (EEG) con acquisizione video simultanea viene utilizzata in questo protocollo. Comprendere gli aspetti tecnici alla base dell'hardware e degli approcci di acquisizione dei dati è fondamentale per un'interpretazione accurata dei dati. Gli aspetti critici dell'hardware includono il tipo di sistema di registrazione, il tipo di elettrodi (cavio o filo) e il materiale di cui sono fatti, l'acquisizione video sincronizzata (come parte del sistema EEG o di terze parti) e le proprietà del sistema informatico. È imperativo impostare i parametri di acquisizione appropriati in qualsiasi tipo di sistema a seconda dell'obiettivo dello studio, degli eventi EEG di interesse, del metodo di ulteriore analisi e della sostenibilità dell'archiviazione dei dati. Infine, il metodo di configurazione degli elettrodi (montaggio) deve essere considerato, in quanto ognuno presenta vantaggi e svantaggi e influenzerà l'interpretazione dei dati.

Questo protocollo descrive in dettaglio come utilizzare il modello di caduta del peso Di Marmarou modificato^10,11 per indurre lesioni diffuse con conseguente crisi spontanee, non provocate, ricorrenti nei topi, descrive gli approcci chirurgici per acquisire un eEG video a singolo e multicanale e sincronizzato utilizzando montaggio monopolare, bipolare o misto.

Protocollo

Tutte le procedure relative a questo protocollo sono state eseguite in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Virginia Tech e nel rispetto della "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" dei National Institutes of Health .

1. Protocollo di movimentazione degli animali

NOTA: Questo protocollo ha lo scopo di abituare gli animali ordinati da un venditore alla struttura dopo l'arrivo e di condizione loro di essere trattati dallo sperimentatore. Ciò migliora il benessere degli animali riducendo lo stress e l'ansia e semplifica alcune procedure che richiedono la manipolazione degli animali, tra cui l'induzione del TBI, il monitoraggio post-operatorio e il collegamento dell'animale al sistema di acquisizione.

1. Quando molti animali vengono ricevuti dal venditore, auricolari e li assegnano in modo casuale a un gruppo sperimentale (TBI) o a un gruppo di controllo (chirurgia sham) combinandoli in gabbie di 2-5 animali. Casa animali TBI separatamente da animali finti perché topi finti occasionalmente agiscono in modo aggressivo verso i topi che hanno subito TBI.
2. Gestione del giorno 1 (24-48 h dopo l'etichettatura dell'orecchio): prepara un grafico per la registrazione delle etichette dell'orecchio animale, la data di nascita, le date di manipolazione, il peso animale nei giorni di manipolazione, la durata della manipolazione e una sezione per commenti e osservazioni.
3. Incoppa delicatamente l'animale con entrambe le mani. Non afferrare l'animale per la coda in quanto induce meccanismi di difesa e una risposta allo stress.
4. Controllare e registrare l'etichetta dell'orecchio dell'animale.
5. Posizionare l'animale nel contenitore sulla bilancia di peso e registrare il peso.
6. Tazza delicatamente l'animale con entrambe le mani di nuovo e maneggiarlo per 1 min, permettendogli di muoversi ed esplorare all'interno delle mani. Eseguire questo su una panca nella sala procedura e fare attenzione a non far cadere l'animale sul pavimento.
7. Dopo 1 min di manipolazione, riporre l'animale nella sua gabbia.
8. Ripetere i passaggi 1,3 e 1,7 per gli altri animali nella gabbia.
9. Gestione del giorno 2 (giorno successivo): ripetere i passaggi 1,2 e 1,5.
10. Tazza delicatamente l'animale con entrambe le mani di nuovo e maneggiarlo per 2 min, permettendogli di muoversi ed esplorare all'interno delle mani. Eseguire questo su una panca nella sala procedura e fare attenzione a non far cadere l'animale sul pavimento.
11. Dopo 2 min di manipolazione, riporre l'animale nella sua gabbia.
12. Ripetere i passaggi 1.10-1.11 per gli altri animali nella gabbia.
13. Gestione del giorno 3 (giorno seguente): ripetere i passaggi 1,2 e 1,5.
14. Tazza delicatamente l'animale con entrambe le mani di nuovo e maneggiarlo per 4 min, permettendogli di muoversi ed esplorare all'interno delle mani. Eseguire questo su una panca nella sala procedura e fare attenzione a non far cadere l'animale sul pavimento.
15. Dopo 4 min di manipolazione, riporre l'animale nella sua gabbia.
16. Ripetere i passi 1.14-1.15 per gli altri animali nella gabbia.
17. Gestione del giorno 4 (giorno di controllo, 1 settimana dalla gestione giorno 1): ripetere i passaggi 1.2-1.5.
18. Tazza delicatamente l'animale con entrambe le mani di nuovo e maneggiarlo per 4 min, permettendogli di muoversi ed esplorare all'interno delle mani. Eseguire questo su una panca nella sala procedura e fare attenzione a non far cadere l'animale sul pavimento.
19. Dopo 4 min manipolazione, riporre l'animale nella sua gabbia.
20. Ripetere i passaggi da 1,18 a 1,19 per gli altri animali nella gabbia.
    NOTA: la giornata di gestione del controllo verifica la conservazione del comportamento calmo dopo un protocollo di gestione di tre giorni.

2. Procedura di caduta del peso

1. Posizionare il mouse in una camera di induzione. Impostare il flusso di ossigeno e vuoto sia a 1 L/min e il livello di gas isoflurano al 3%-5%. Anestesizzare il mouse per 5 min.
2. Rimuovere il mouse dalla camera di induzione e posizionarlo su un cuscinetto di schiuma. Verificare l'assenza di una risposta a un dito o un pizzico di coda.
3. Somministrare sottocutaneamente un analgesico (0,1 mg/kg di buprenorphine). Se la chirurgia EEG viene eseguita lo stesso giorno, somministrare la buprenorfina sottocutanea in combinazione con il carprofen antinfiammatorio non steroideo (5 mg/kg).
4. Somministrare sottocutaneamente la soluzione di latto di sodio (3 l per grammo del peso dell'animale) prima o dopo l'ultimo impatto. La soluzione di lattato di sodio può essere miscelata con l'analgesica per una somministrazione rapida in una singola iniezione.
   NOTA: La soluzione di latto di sodio contiene una miscela di cloruro di sodio, cloruro di ctassio, cloruro di calcio e lattto di sodio in acqua. Questo passaggio aiuta a sostituire fluidi ed elettroliti, aiutando il recupero.
5. Posizionare la testa del mouse sotto il tubo di goccia di peso (Figura 1A) e posizionare un disco piatto in acciaio inox (1,3 cm di diametro, 1 mm di spessore, e 880 mg di peso) al centro della testa, tra la linea degli occhi e le orecchie.
   NOTA: Questo disco diffonde l'impatto sulla superficie del cranio(Figura 1B).
6. Rimuovere il perno nel tubo di goccia di peso per rilasciare l'asta di peso 100 g da un'altezza di 50 cm. Per indurre la lesione finta per i topi di controllo, rimuovere l'asta di peso dal tubo per evitare il rilascio accidentale del perno e la caduta di peso.
   NOTA: La testa dell'animale deve essere posizionata piatta, in modo che l'asta cada liberamente su tutta la superficie del disco.
7. Posizionare l'animale incosciente sulla schiena per il recupero su un pad di riscaldamento coperto con un asciugamano assorbente polifolizzato sterile. Il tempo di recupero del riflesso di raddquità (cioè il tempo necessario al mouse per farlo da dietro) può essere misurato come una lettura per il tempo trascorso incosciente.
8. Quando l'animale riprende conoscenza, metterlo in una gabbia pulita che è stata riscaldata su una piastra di riscaldamento, con gel di recupero e alcuni pezzi di chow inumiditi da recuperare per 45 minuti. Assicurarsi che ci sia sufficiente lettiera in modo che la gabbia non si surriscaldi. Il surriscaldamento dell'animale può rivelarsi un ostacolo altrettanto grande per il recupero, quanto permettere al mouse di diventare troppo freddo.
9. Dopo 45 min, ripetere due volte i passaggi 2.1.8, omettendo il passo 2.3 (cioè la somministrazione di analgesici e farmaci antinfiammatori).
10. Lasciare che gli animali si riprendano per 1/2 h se l'intervento di impianto degli elettrodi EEG viene eseguito nello stesso giorno.

3. Preparazione chirurgica sul campo per l'impianto di elettrodi EEG

NOTA: Autoclave gli utensili chirurgici e le viti prima dell'intervento chirurgico. Pulire i guanti chirurgici spruzzando e sfregando con il 70% di etanolo prima e dopo aver toccato l'animale, i materiali non sterili e tra la manipolazione degli animali. Sterilizzare gli strumenti chirurgici per 2/3 min nello sterilizzatore di perline (vedi Tabella dei Materiali)tra gli animali. Cambiare il drappo sterile prima di inserire un nuovo animale nell'apparato stereotassico. Assicurarsi che il campo chirurgico contenga tutti i componenti necessari per l'intervento chirurgico (Figura 2). L'assenza di una procedura chirurgica invasiva per indurre il TBI in questo modello ha diversi vantaggi: 1) l'impianto degli elettrodi è flessibile e può essere eseguito nello stesso giorno di TBI o dopo un determinato periodo di tempo; 2) il tempo di recupero dell'animale è più veloce; 3) il cranio rimane intatto, consentendo una maggiore superficie e flessibilità per l'impianto di elettrodi.

1. Anestesizza il topo nel 3%-5% di gas isoflurane in una camera di induzione per 5 min.
2. Trasferire il mouse dalla camera di induzione all'apparato stereotassico e posizionarlo su un drappo sterile su un pad di riscaldamento con gas isoflurane e tubi a vuoto collegati al cono naso.
3. Mantenere la temperatura corporea a 37 gradi centigradi nel corso dell'intervento. Posizionare il sensore di temperatura in modo che faccia contatto con il torace o la parete addominale del mouse.
4. Fissare la testa dell'animale in posizione utilizzando le barre dell'orecchio.
5. Mantenere l'anestesia all'1,5%, il 3,5% dell'isoflurano o a 60 dollari/min nel piano chirurgico (senza risposta al dito o al pizzico della coda).
6. Applicare un unguento oculare agli occhi dell'animale per tenerli lubrificati per tutta la chirurgia.
7. Somministrare una miscela di analgesici (0,1 mg/kg di buprenorphine) e il farmaco antinfiammatorio non steroideo (5 mg/kg di carprofene) in una singola iniezione sottocutaneamente a meno che il TBI non sia stato eseguito in precedenza durante il giorno, nel qual caso l'animale ha già ricevuto analgesici e anti-infiammatori.
   NOTA: La buprenorfina deve essere somministrata nuovamente se il tempo tra il primo intervento chirurgico di posizionamento TBI ed EEG supera le 8 h o se l'animale mostra segni di dolore 8 h dopo la prima somministrazione, ma deve essere somministrato senza l'aggiunta di carprofene.
8. Somministrare la soluzione di lattato di sodio (3 l per grammo del peso dell'animale) sottocutaneamente per sostituire fluidi ed elettroliti nell'animale.
   NOTA: Se l'intervento viene eseguito immediatamente dopo il TBI, questo passaggio deve essere cronometrato correttamente. Soluzione di lattato di sodio deve essere somministrato ogni 2 h mentre l'animale viene sottoposto alle procedure e una volta dopo l'intervento chirurgico, 2 h dalla iniezione precedente.
9. Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto utilizzando una crema per la rimozione dei peli.
10. Prima di effettuare l'incisione, disinfettare la pelle del cuoio capelluto con soluzione antisettica povidone-iodio e 70% etanolo in tamponi alternati con tamponi di garza sterile in un movimento circolare 3x (20 s per soluzione ogni volta).
11. Utilizzando un bisturi, fare un'incisione rostral-caudale sulla linea mediana del cuoio capelluto da appena sopra gli occhi alla parte posteriore della testa. Questo metodo di apertura del cuoio capelluto è preferito rispetto al taglio del cuoio capelluto, come lembi della pelle possono essere sigillati sopra o intorno al eEG-cap fornendo più stabilità.
    NOTA: Quando si prepara il cranio per l'impianto della teera 3-EEG, è necessario tagliare il cuoio capelluto, poiché la dimensione del supporto della testa non consentirà la chiusura dei lembi della pelle sopra la testa.
12. Espandere l'area di incisione applicando piccoli emostati sui bordi della pelle aperti. Se si verifica un'emorragia dopo l'incisione, pulire con una garza sterile di cotone o tampone.
13. Rimuovere delicatamente il periosteo (cioè la sottile membrana sopra l'osso cranico) con una lama del bisturi. Se si verifica un'emorragia durante questo passaggio, premere sul sito di sanguinamento con un tampone di cotone sterile fino a quando non si ferma.
14. Utilizzare tamponi di cotone sterili per pulire il cranio con perossido di idrogeno, ma evitare di toccare i tessuti molli che circondano l'area cranica esposta. Ripetere questo passaggio fino a quando il cranio non viene pulito da qualsiasi tessuto molle e ha un aspetto biancastro.
15. Asciugare il cranio con una garza sterile o un tampone di cotone.
    NOTA: I passi 3.12-3.15 sono importanti per la corretta fissazione degli elettrodi e del cemento dentale. Qualsiasi tessuto molle, sanguinamento non cauterizzato e detriti possono causare infezioni, fissazione instabile della testa, segnale distorto o assente e perdita dell'impianto entro diversi giorni o settimane dall'intervento chirurgico.

4. Posizionamento elettrodo

1. Impiantare il singolo headmount del canale EEG (1EEG).
   NOTA: le abbreviazioni nelle coordinate stereotiche rappresentano le relazioni spaziali e specificano la distanza in millimetri del bersaglio dal bregma in un determinato orientamento sulla testa dell'animale: anteriore-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML). Dorsale-ventrale non è applicabile in questo protocollo perché tutti gli elettrodi sono collocati nello spazio epidurale piuttosto che in una certa struttura all'interno del cervello (Figura 3). Vin è un elettrodo attivo e Vin- è il suo elettrodo di riferimento.
   1. Utilizzare un trapano ad alta velocità con un bit di acciaio (0,5 mm, rotondo, 1/4 in.) a 5.000-6.000 colpi al min (rpm) per creare sei fori di bava (tre per viti di stabilità e tre per gli elettrodi) utilizzando le coordinate stereotattiche¹². Per le due viti anteriori: AP - 1,5 mm, ML - 1,5 mm; per una vite posteriore: AP -5,2 mm, ML -1,5 mm; per l'elettrodo di terra: AP -5,2 mm, ML - 1,5 mm; per gli elettrodi di registrazione: AP -2,3 mm, ML - 2,7 mm, con Vin a destra e Vin- a sinistra.
   2. Aggiungere tre viti per una maggiore stabilità della fase della testa. Utilizzando un cacciavite, girare le viti 1 x 1,5 x ciascuna per essere fissato stabilmente nel cranio.
      NOTA: Posizionare le viti più in profondità danneggerà il cervello.
   3. Inserire il montante 1EEG in un braccio di supporto stereotassico e posizionare il montante in modo che i tre elettrodi si trovino lungo la linea mediana cranica. In questa configurazione l'elettrodo di terra e la sua rispettiva apertura sulla parte superiore del montante della testa si trova nella parte posteriore, l'elettrodo Vin nel mezzo e l'elettrodo Vin- nella parte anteriore. Un segno può essere fatto sul montante con un pennarello permanente.
   4. Piegare ogni elettrodo di 90 gradi in modo che l'estremità di ogni filo sia piegata verso il basso e posizionata sopra il foro di bava corrispondente. Quindi, misurare la lunghezza di 1 mm della porzione del filo che è ora perpendicolare al foro di bava e tagliare l'eccesso di stacco (Figura 3). Ciò garantirà il posizionamento epidurale degli elettrodi. Gli elettrodi dovrebbero essere a malapena toccando la superficie dura mater.
   5. Abbassare il montante e regolare tutti e tre gli elettrodi in modo che corrispondano al rispettivo foro di bava. Per la registrazione epidurale, gli elettrodi devono essere posizionati sopra o toccare a malapena la dura mater.
   6. Preparare il cemento dentale per l'applicazione mescolando un misurino di polvere con diverse gocce di solvente. Utilizzare una spatola di miscelazione e mescolare fino a quando la miscela finale è stucco, di cattivo gusto ma malleabile, e abbastanza rigido per essere correttamente condensato quando posto sul cranio dell'animale.
   7. Applicare la miscela di cemento dentale che copre tutte le viti e gli elettrodi e attendere 3 x 5 min perché si solidifichi. Assicurarsi di non coprire il piedistallo di plastica con cemento dentale, perché renderà impossibile collegare l'animale al commutatore con un collegatore.
   8. Rilasciare gli emostati che tengono i lembi della pelle e chiudere l'incisione collegando i lembi della pelle intorno al piedistallo di plastica. Applicare diverse gocce di adesivo per i tessuti (vedi Tabella dei materiali)per sigillare i lembi della pelle.
   9. Applicare l'antisettica cloreradinae all'area intorno all'impianto per evitare infezioni. Se l'animale è in anestesia per più di 2 h dopo la precedente iniezione di latto soluzione, somministrata durante l'induzione di TBI, somministrare un'altra iniezione sottocutanea. Per mantenere una corretta idratazione dell'animale, ripetere l'iniezione ogni 2 h che l'animale spende in anestesia.
   10. Dopo l'intervento chirurgico, dare un'iniezione finale di soluzione di lattato di sodio 2 h dopo l'iniezione precedente. Se l'intervento chirurgico è lungo meno di 2 h, somministrare la dose finale di recupero della soluzione di lattato di sodio 2 h dalla prima iniezione.
   11. Rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico e misurare il peso dell'animale dopo l'intervento chirurgico EEG come riferimento per il monitoraggio futuro. A causa dell'impianto, il peso dell'animale sarà maggiore rispetto a prima dell'intervento chirurgico.
   12. Posizionare l'animale in una gabbia pulita su una piastra di riscaldamento calda per il recupero.
2. Impiantare i due canali EEG e one EMG (2EEG/1EMG).
   1. Utilizzare il bregma come punto di riferimento per il posizionamento del montante. Applicare una piccola quantità di adesivo di tessuto (vedi Tabella dei materiali) sul lato inferiore della testata 2EEG/1EMG, evitando i quattro fori a vite e posizionando il montante 2EEG/1EMG sulla superficie del cranio.
      NOTA: non ci sono coordinate specifiche per il posizionamento di questo headmount. Il copricapo è lungo 8 mm e largo 5 mm, che copre la maggior parte della superficie cranica. Posizionare il montante anteriore con il bordo anteriore di 3,0 mm anteriore al bregma è ottimale e fornisce una buona qualità del segnale. È necessario un rapido posizionamento manuale prima della caduta delle cure adesive dei tessuti. Lasciare che circa 5 min per la colla tissutale per curare completamente.
   2. Utilizzare un ago sterile da 23 G per creare fori pilota per le viti attraverso le quattro aperture nel montante. Per raggiungere questo obiettivo, spingere delicatamente l'ago e ruotare lentamente fino a quando la punta dell'ago penetra nel cranio senza danneggiare il cervello. Rimuovere qualsiasi sanguinamento dai fori pilota utilizzando un tampone di cotone sterile.
   3. Inserire lo 0,10 in viti nei fori pilota e ruotarli fino a quando ciascuno è fissato nel cranio. Questo può essere fino a metà della lunghezza della vite, ma non l'intera lunghezza, in quanto ciò danneggerebbe il dura mater e la corteccia. Se il supporto della testa è posizionato in modo che vi sia uno spazio tra la superficie del cranio e l'estremità posteriore del supporto della testa utilizzare due 0,12 in viti nella parte posteriore.
   4. Fare piccola apertura sui lati della sacca bimbio a due componenti epossidica (argento-epossidica). Prendere una spatola a doppio lato e utilizzare ogni lato per raccogliere una piccola e uguale quantità di ogni componente dal sacchetto e mescolare insieme. Utilizzare solo una piccola quantità sufficiente per un singolo intervento chirurgico, perché la miscela solidifica entro 20 min. Sigillare i lati della sacca per evitare l'essiccazione.
      NOTA: La resina argento-epossidica consente un corretto contatto elettrico tra la vite e il montatore e migliora la stabilità delle viti.
   5. Applicare una piccola quantità di questa miscela tra testa di vite e foro a vite, quindi stringere ogni vite fino a quando la sua testa poggia sulla base dell'impianto. Assicurarsi che nessun argento-epossidica stia facendo contatto tra le due viti perché ogni vite funge da elettrodo individuale e, per garantire un segnale preciso, non dovrebbe prendere contatto con l'altra vite.
   6. Se la miscela argento-epossidica è stata smarrita, c'è una seconda finestra di tempo per raccogliere con attenzione l'eccesso per separare la connessione. Piegare attentamente entrambi i cavi EMG dal bordo posteriore della testata per seguire il contorno della testa e del collo dell'animale, e poi inserirli nei muscoli nuchi.
   7. Preparare il cemento dentale per l'applicazione mescolando un misurino di polvere con diverse gocce di solvente. Utilizzare una spatola di miscelazione e mescolare fino a quando la miscela finale è stucco, di cattivo gusto ma malleabile, e abbastanza rigido per essere correttamente condensato quando posto sul cranio dell'animale.
   8. Applicare la miscela di cemento dentale che copre l'intero supporto della testa evitando di coprire i sei fori del perno, in quanto ciò renderà impossibile collegare il preamplificatore. Aspettate 3 x 5 min perché il cemento si solidifici. Assicurarsi che la pelle non sia sigillata sul montante con cemento dentale.
   9. Rilasciare gli emostati che tengono i lembi della pelle e chiudere l'incisione collegando i lembi della pelle intorno al piedistallo di plastica. Applicare diverse gocce di adesivo per sigillare i lembi della pelle.
      NOTA: Se l'incisione cutanea è stata allungata per consentire il raddrizzamento dei cavi del filo EMG, la pelle può essere sigillata con adesivo tissutale o suturata. Sigillare la pelle con adesivo tissutale è di solito sufficiente. Tuttavia, se durante il monitoraggio post-operatorio si osserva l'apertura dell'incisione, si raccomandainvece le suture.
   10. Applicare l'antisettica cloreradinae all'area intorno all'impianto per evitare infezioni. Somministrare la soluzione di lattica di sodio (3 - L per grammo del peso dell'animale) sottocutaneamente per sostituire fluidi ed elettroliti se l'animale è in anestesia per più di 2 h dopo l'iniezione precedente.
   11. Rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico e misurare il peso dell'animale dopo l'intervento chirurgico EEG come riferimento per il monitoraggio futuro. A causa dell'impianto, il peso dell'animale sarà maggiore rispetto a prima dell'intervento chirurgico.
   12. Mettere l'animale in una gabbia pulita su una piastra di riscaldamento calda, con gel di recupero e alcuni pezzi di chow inumiditi per il recupero.
3. Impiantare un headmount a tre canali EEG (3EEG).
   1. Utilizzare il trapano ad alta velocità con un bit di acciaio (0,5 mm, rotondo, 1/4) a 5.000 -6.000 rpm per creare sei fori (tre per viti di stabilità e tre per gli elettrodi) utilizzando le coordinate stereotiche fornite¹². Per il terreno e il riferimento comune per EEG1 e EEG2: AP 5,2 mm, ML - 1,5 mm; per EEG1 e EEG2: AP -3,0 mm, ML e 3,0 mm; per EEG3 indipendente: AP -1,4 mm, ML - 1,5 mm.
   2. Inserire gli elettrodi a sei viti nei fori della bava.
      NOTA: Posizionare le viti più in profondità creerà danni significativi al cervello. Gli elettrodi a vite forniscono una migliore stabilità del montante.
   3. Preparare il cemento dentale per l'applicazione mescolando un misurino di polvere con diverse gocce di solvente. Utilizzare una spatola di miscelazione e mescolare fino a quando la miscela finale è stucco, di cattivo gusto ma malleabile, e abbastanza rigido per essere correttamente condensato quando posto sul cranio dell'animale.
   4. Applicare la miscela di cemento dentale che copre l'intera superficie esposta del cranio e ogni elettrodo a vite. Assicurarsi che la pelle non sia sigillata sul montante con cemento dentale. Attendere il cemento per solidificarsi leggermente. Non è necessario attendere la piena solidificazione prima di procedere alla fase successiva.
   5. Accendere il ferro da saldatura per riscaldarlo. Posizionare il montante 3EEG in un braccio di supporto stereotassico.
      NOTA: Posizionare il montante della testa in modo che le sei posizioni di piombo del filo corrispondano alla posizione dei cavi di ogni elettrodo a vite.
   6. Abbassare il montante in modo che la sua parte ventrale poggia sulla parte superiore del cemento dentale.
   7. Ruotare il filo di ogni piombo da ciascuno degli elettrodi a vite con il corrispondente piombo metallico del supporto della testa.
      NOTA: Torcere i cavi di filo sbagliati renderà l'interpretazione dei dati complicata o impossibile.
   8. Tagliare con cura il filo in eccesso utilizzando le forbici. Solder ogni coppia di filo contorto per una corretta conduzione del segnale.
      NOTA: ogni coppia di fili deve prendere contatto con un'altra coppia, altrimenti la qualità del segnale e l'interpretazione dei dati saranno compromesse.
   9. Piegare ogni coppia di cavi di filo saldato intorno alla testata, evitando il contatto tra ogni coppia.
      NOTA: Se i cavi del filo non sono tagliati abbastanza breve può essere difficile piegarli intorno al supporto della testa senza toccare un altro filo. In questo caso, piega prima un paio, coprilo con la miscela di cemento dentale, aspetta 1/2 min per solidificare, quindi procedi con la coppia successiva nello stesso modo.
   10. Finire di coprire tutto il filo con cemento dentale lasciando solo la parte nera del montante esposto.
       NOTA: Fare attenzione a non applicare alcuna polvere di cemento dentale o miscela sulla parte superiore della parte esposta del supporto della testa come eventuali detriti o cemento nei fori bloccherà il contatto e porterà a segnale assenza o rumore.
   11. Rilasciare gli emostati che tengono i lembi della pelle. Applicare l'antisettica cloreradinae all'area intorno all'impianto per evitare infezioni.
   12. Somministrare la soluzione di lattica di sodio (3 - L per grammo del peso dell'animale) sottocutaneamente per sostituire fluidi ed elettroliti se l'animale è stato in anestesia per più di 2 h dopo l'iniezione precedente.
   13. Rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico e misurare il peso dell'animale dopo l'intervento chirurgico EEG come riferimento per il monitoraggio futuro. A causa dell'impianto, il peso dell'animale sarà maggiore rispetto a prima dell'intervento chirurgico.
   14. Mettere l'animale in una gabbia pulita su una piastra di riscaldamento calda, con gel di recupero e alcuni pezzi di chow inumiditi per il recupero.
       NOTA: Ausili per ossido di idrogeno nella rimozione dei tessuti molli rimanenti dal cranio.

5. Collegare gli animali al sistema di acquisizione

1. Coppa l'animale con entrambe le mani per rimuoverlo dalla gabbia di acquisizione e trasferirlo in una zona pulita con una superficie piana, come una stazione di trasferimento degli animali (ATS).
2. Afferrare delicatamente il mouse per la pelle della schiena. Non afferrare l'animale per la coda, in quanto ciò causa angoscia.
3. Identificare l'apertura nel montante EEG corrispondente all'elettrodo di terra e abbinare il rispettivo perno del legame per una corretta connessione.
   NOTA: la connessione inversa del legame dal commutatore al montante dell'animale comporterà una lettura diversa dagli elettrodi e dalle forme d'onda potenzialmente distorte.
4. Riportare l'animale alla gabbia di acquisizione e collegare l'altra estremità del tether (EEG System 1) o pre-amplificatore (EEG System 2) al commutatore.
   NOTA: Quando si collega il preamplificatore (EEG System 2) al collegatore dal commutatore, abbinare i segni bianchi alle estremità di entrambi i tether. La connessione inversa comporterà danni permanenti dell'amplificatore e richiede riparazioni da parte del produttore, che sono costosi.
5. Ruotare delicatamente il cavo che collega l'animale al commutatore per garantire che il meccanismo funzioni correttamente e che l'animale possa muoversi liberamente.

6. Impostazioni di acquisizione dati EEG

1. Impostare i parametri di acquisizione di EEG System 1.
   1. Impostare la frequenza di campionamento su 500 Hz; guadagnare 5.000; modalità Norm 35 Hz; LPN off. Impostare il filtro passa alto su 0,5 Hz.
      NOTA: 100 Hz (passa basso) è incorporato e non richiede l'input manuale.
2. Impostare i parametri di acquisizione di EEG System 2.
   1. Impostare la frequenza di campionamento su 600 Hz; preamplificatore guadagno 100; guadagno 1 (EEG1,2). Impostare il filtro passa-basso su 100 Hz.
      NOTA: 1 Hz (passaggio alto) è incorporato e non richiede l'input manuale.

7. Impostazioni di acquisizione dati video

1. Impostare i parametri di acquisizione per EEG System 1.
   NOTA: per ottenere dati video simultanei è necessario un sistema di acquisizione video di terze parti.
   1. Impostare la frequenza fotogrammi tra 15 (minimo consigliato) e 30 (massimo disponibile) per la qualità video appropriata. Impostare la risoluzione su 640 x 640 pixel. Impostare il tipo di compressione su H.264H.
2. Impostare i parametri di acquisizione per EEG System 2.
   NOTA: Questo sistema EEG offre un sistema video e software che sincronizzano i dati video ed EEG insieme in un unico file per un massimo di quattro animali (vedi Tabella dei materiali).
   1. Impostare la frequenza fotogrammi tra 15 (minimo consigliato) e 30 (massimo disponibile) per la qualità video appropriata. Impostare la risoluzione su 640 x 480 pixel. Impostare il tipo di compressione sul formato di file WebM.

Risultati

Il protocollo qui descritto descrive il metodo per l'induzione di una lesione diffusa in isolamento (ad esempio, in assenza di una lesione focale) utilizzando un modello murino di TBI diffuso ripetitivo (Figura 1). Figura 1 illustra il dispositivo di riduzione di peso e i relativi componenti(Figura 1A, a1- a5) utilizzato per l'induzione di TBI in questo modello e passaggi cruciali durante la procedu...

Discussione

A differenza dei modelli CCI e FPI che inducono sia la lesione focale che quella di una lesione diffusa, il modello di TBI diffuso ripetitivo descritto in questo protocollo consente l'induzione di lesioni diffuse in assenza di lesioni cerebrali focali e non richiede cuoio capelluto o aperture craniche e l'infiammazione associata. Un ulteriore vantaggio dell'assenza di crania in questo modello è che permette non solo di impiantare gli elettrodi per la registrazione eTG continua cronica, ma anche la creazione di una fines...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch long stainless steel
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount	Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide			Pharmacy
3EEG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8235-SM-C	custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 mice	Harlan/Envigo Laboratories Inc		male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		male, 12-16 weeks old
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic			Pharmacy
Dental cement and solvent kit	Stoelting Co., USA	51459
Drill	Foredom	HP4-917
Drill bit	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Hair removal product	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair cream
Isoflurane	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidone-iodine surgical solution	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Solder			Harware store
Soldering iron	Weller, USA	WP35	ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc			Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads	Fisher Scientific, USA	22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads	Cardinal Health, USA	3520
Tissue adhesive	3M Animal Care Products, USA	1469SB