Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Резюме

Этот протокол был создан в качестве средства для производства органов мозга в упрощенной, низкой стоимости образом без экзогенных факторов роста или подвальной мембранной матрицы, сохраняя при этом разнообразие типов клеток мозга и многие особенности клеточной организации.

Аннотация

Органоиды мозга человека, отличающиеся от эмбриональных стволовых клеток, дают уникальную возможность изучать сложные взаимодействия нескольких типов клеток в трехмерной системе. Здесь мы представляем относительно простой и недорогой метод, который дает органоиды мозга. В этом протоколе человека плюрипотентных стволовых клеток разбиваются на небольшие кластеры вместо одиночных клеток и выращиваются в основных средствах массовой информации без гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста, что позволяет внутреннее развитие сигналов для формирования рост органоида. Эта простая система производит разнообразие типов клеток мозга, включая глиальные и микроглиальные клетки, стволовые клетки и нейроны передового мозга, среднего мозга и заднего мозга. Органоиды, генерируемые в этом протоколе, также отображают признаки соответствующей временной и пространственной организации, продемонстрированной яркими изображениями поля, гистологией, иммунофлуоресценцией и в режиме реального времени количественной реверсивной транспрессионной цепной реакцией ( qRT-PCR). Поскольку эти органоиды содержат типы клеток из различных частей мозга, они могут быть использованы для изучения множества заболеваний. Например, в недавней работе мы продемонстрировали использование органоидов, полученных из этого протокола, для изучения влияния гипоксии на человеческий мозг. Этот подход может быть использован для изучения массива в противном случае трудно изучить условия, такие как нейроразвития гандикапы, генетические расстройства, и неврологические заболевания.

Введение

Из-за множества практических и этических ограничений, было много трудностей в изучении человеческого мозга. Хотя исследования с использованием грызунов имеют решающее значение для нашего понимания человеческого мозга, мыши мозг имеет много различий^1,2. Интересно, что мыши имеют плотность нейронов, что, по крайней мере в 7 раз меньше, чем приматов мозга^3,4. Хотя приматы ближе к человеку, чем грызуны с эволюционной точки зрения, это не практично для большинства исследователей, чтобы работать с ними. Цель этого протокола состояла в том, чтобы резюмировать многие важные особенности человеческого мозга с помощью упрощенного и менее дорогостоящего метода без необходимости гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста при сохранении разнообразия клеток мозга и клеточной организации.

Формативная работа из лаборатории Сасай использовала сыворотку свободной культуры эмбриональных тел (SFEBq) метод для создания двух- и трехмерных нейронных типов клеток из сигнализированных эмбриональных стволовых клеток (ESCs)^5,6. Многие органоидные методы мозга человека следовали относительно похожим путем от сигнализированных ESCs^7,8. В отличие от этого, этот протокол начинается с кластеров отдельных человека ESCs (hESCs), похожие на начальные шаги семенной работы Лаборатории Томсона и Чжана до покрытия шаги⁹,^10, а также начальный шаг мозга органоидпротокол лаборатории Паска до добавления экзогенных факторов роста¹¹. Подвал мембраны матрицы (например, матригель) были использованы во многих мозг органоидных протоколов и было показано, что эффективный эшафот⁸. Однако, наиболее часто используемые мембранные матрицы подвала не приходят без усложнений по мере того как они co-purify с неизвестными количествами факторов роста с партией к изменчивости партии во время продукции^12. Кроме того, эти матрицы могут осложнить визуализацию и увеличить риск загрязнения и стоимости.

Хотя человеческий мозг органоиды могут быть использованы для ответа на многие вопросы, Есть определенные ограничения, чтобы иметь в виду. С одной стороны, начиная с эмбриональных стволовых клеток, органоиды больше напоминают незрелые мозги, чем в возрасте мозга и как таковой не может быть идеальным и моделям для заболеваний, которые происходят в пожилом возрасте, как болезнь Альцгеймера. Во-вторых, в то время как наш протокол нашел маркеры развития головного мозга, среднего и заднего мозга, которые полезны для изучения влияния лечения или болезни на клетки из нескольких областей мозга в согласии, другие протоколы могут быть соблюдены, чтобы сосредоточиться на конкретных областях мозга^13,14. Наконец, еще одним ограничением органоидных моделей является то, что размер, в то время как средняя длина человеческого мозга около 167 мм, мозг органоидов, сделанных с использованием агитации вырастают до 4 мм⁸ и органоиды, сформированные этим протоколом, вырастают до 1-2 мм на 10 недель. Тем не менее, этот протокол является важным инструментом для изучения тканей мозга человека и взаимодействия нескольких типов клеток.

протокол

1. Обслуживание стволовых клеток

1. Поддерживать H9 hESCs на слое фактора роста снижение подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов, отныне просто называют матрицы) в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Чтобы покрыть одну 6-колодую тарелку или одну тарелку 10 см, смешайте 100 л матрицы с 5,9 мл модифицированной среды Eagle (DMEM)/F12. Оберните тарелки в парафина фильм и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия. Используйте их на следующий день для прохождения клеток после избыточной матрицы / медиа аспирируется.
2. Культура клетки неделю к неделе примерно 1:12 сплит-коэффициент каждые 7 дней. Поддержание клеток с помощью mTESR-1 средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию, низкий кислород инкубатор (5% O_2,5% CO₂). Обновлять средства массовой информации ежедневно. Отсеял дифференивационные клетки от культуры между проходами с помощью стеклянных инструментов.
3. Клетки H9 должны пройти за четыре-шесть дней до их использования для производства органоидов. Клетки должны быть проложено примерно при соотношении 1:8 клеточных кластеров. Для этого начните с промывки ячеек с помощью DMEM F12 media и разъедините клетки с нейтральной протеазой (например, диспаз, отныне именуемый просто протеазой), промыть DMEM/F-12, а также пластины как 30-60 клеточные кластеры через 4 пластины (6-ну или 10 см) при неприязни. За два дня до сбора урожая, переход их в обычный инкубатор (21% O₂, 5% CO₂). Плиты должны достигать 80% вспыхиваемости при начале органоидного образования.

2. Диссоциация hESCs для Органоидной культуры

1. Aliquot решение запаса протеже (5 U/mL).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно замораживаем вниз 1 мл aliquots на -20 градусов по Цельсию для использования в течение нескольких месяцев.
2. Разбавить раствор протеазы до рабочей концентрации, добавив 1 мл бульонного раствора плюс 5 мл DMEM/F12 для каждой 6-ну скважины или 10 см пластины гЭСК.
3. Аспирируйте и удаляйте средства культуры клеток, а затем покрывайте hESCs раствором протеазы. Поместите пластины в инкубатор на 10-15 мин или до тех пор, пока края колоний округляются и начинают отделяться от матрицы.
4. Наклоните пластину, аспирировать раствор протеазы, и осторожно промыть клетки с DMEM / F12 три раза. Используйте 2 мл/хорошо для каждой стирки при использовании 6-колодца пластины и 6 мл при использовании 10 см пластины. Убедитесь, что колонии остаются прикрепленными к матрице при выполнении этого шага.
5. Добавьте обратно около 1,5 мл свежих mTESR-носителей к каждому колодцу (или 5 мл для тарелки 10 см) и смойте клетки с пластины с помощью нежного пипетки.
6. Используя пипетку объемом 10 мл, аккуратно аспирировать и распределять hESC в пределах пластины, пока они не достигнут примерно 1/30^тыс. от их первоначального размера. Кластеры колоний должны напоминать квадраты размером 250-350 мкм по завершении этих ступеней.

3. Поколение органоидов

1. Передача клеток в одну ультра-низкую колбу T75, содержащую 30 мл мт mTESR-носителей без основного фактора роста фибробластов (bFGF).
2. На следующий день наклоните колбу (ы) так, что живые клетки бассейн в углу (это может занять 5-10 минут в первый день, но будет получать быстрее, как кластеры получить больше).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть большое количество клеток, которые придерживались нижней части колбы на этом этапе или любых последующих шагах, перенесите клетки в новую колбу. Это нормально иметь высокую популяцию мертвых клеток в течение первых двух дней. При выполнении изменений мультимедиа, не забудьте удалить как можно больше мусора клетки, как это возможно.
3. После того, как клетки оседают, аспирируются от средств массовой информации и мертвых клеток оставляя около 10 мл средств массовой информации, содержащей живые клетки.
4. Добавьте 20 мл низкой bFGF-медиа (DMEM/F12 дополнен 1x N2, 1x B27, 1x L-глютамин, 1x NEAA, 0,05% бычьего сывороточная альбумин (BSA), и 0,1 мМ монотиоглицерола (MTG) дополнены 30 нг/мЛ bFGF).
5. Проверьте клетки на 2-й день. Если большинство клеток выглядят здоровыми и яркими, нет необходимости ничего делать. Однако, если более трети ячеек кажутся темными, замените носители (используя ту же технику наклона, что и в шаге 3.2) на 20 мл низких средств массовой информации bFGF, дополненных 20 ng/mL bFGF.
6. На 3-й день замените половину носителя (используя технику наклона в шаге 3.2) на 20 мл низкой bFGF-носителей, дополненных 10 ng/mL bFGF.
7. На 5-й день замените половину среды (с использованием метода наклона в шаге 3.2) на 20 мл нервной индукции (NIM: DMEM/F12, 1x N2 добавка, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг/мл гепарина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть какие-либо большие кластеры клеток или органоидов, которые гораздо больше, чем другие, они должны быть удалены из культуры. Размер оценивается по внешнему виду под микроскопом; например, использование окуляра с ретиком. Большинство органоидов имеют аналогичное размера (примерно 100 и 20 мкм). Мы удалили органоиды, которые были примерно в 2 раза меньше или больше, чем другие.
8. Замените половину среды (15 мл) (с использованием техники наклона) с НИМ через день.
9. После 3 недель в культуре, добавить 100x пенициллина / стрептомицина в средствах массовой информации (NIM: DMEM/ F12, 1x N2 дополнения, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг /мл гепарина) в окончательной концентрации 1x при желании. Обновлять средства массовой информации через день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, мы поддерживали органоиды на срок до 6 месяцев в культуре.

4. Извлечение рнки и подготовка

1. Аккуратно извлеките около 15 органоидов (в зависимости от размера) из колбы с помощью 10 мл пипетки и поместите в трубку 1,5 мл.
   1. Аккуратно гранулы органоидов в центрифуге (200 х г в течение 1 мин), и промыть с 1x Dulbecco в PBS (DPBS) в три раза.
2. Извлекайте РНК с помощью проверенной системы или протокола (например, комплект RNeasy).
3. Измерьте значение оптической плотности каждого образца на уровне 260 и 280 нм.
4. Подготовка кДНК с помощью проверенной системы или протокола (например, набор синтеза iScript cDNA).
5. Выполните qRT-PCR с помощью предварительно проверенных грунтовщиков(Таблица 1),включая по крайней мере один ген ведения домашнего хозяйства.

5. Иммуногистохимия

1. Фиксации
   1. Подготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его на 4 градуса Цельсия.
   2. Используя стерильную бритву, отрежьте кончик стерильной передачи пипетки.
   3. Аккуратно извлекайте органоиды с помощью срезаного трубопровода пипетки, так как они могут быть легко разбиты на части, особенно когда они становятся большими, и поместите их в 6-колодную пластину с дополнительными носителями или DPBS.
   4. Наклоните пластину, аспирируйте носители и замените 1x DPBS. Промыть клетки с 1x DPBS два дополнительных раза.
   5. Замените DPBS 4% раствором PFA и поместите на шейкер при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мы фиксируют в течение 2 дней (для малых органоидов) до 7 дней (для органоидов ,3 месяца), более короткие времена (например, 16-24 ч) также может быть возможным.
   6. Приготовьте 30%, 20% и 10% сахарозных растворов в DPBS.
   7. После фиксации в PFA, заменить 10% раствор сахарозы и место на шейкер на 4 КК в течение 24 ч.
   8. Замените 10% сахарозу 20% сахарозой и поместите на шейкер при 4 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
   9. Замените 20% сахарозу 30% сахарозой и поместите на шейкер при 4 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
2. Замороженные секции
   1. Приготовьте плоский слой сухого льда и поместите на нее маркированную пластиковую форму.
   2. Налейте тонкий слой оптимальной температуры резки среды (OCT) в форму и дайте ему начать затвердевать (в течение нескольких секунд).
   3. Поместите несколько органоидов на верхней части OCT в форму с помощью передачи пипетки с наконечником отрезали и обратить пристальное внимание на расположение органоидов.
   4. Медленно добавляйте OCT до тех пор, пока плесень не будет полной и органоиды покрыты. Пусть он затвердеет полностью в течение дополнительных 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При замораживании более 10 мин помогает обеспечить идеальное относительное размещение нескольких органоидов для секции, можно использовать этанол сухой ледяной смеси или жидкого азота, чтобы заморозить быстрее.
   5. Отметьте относительное расположение органоидов маркером, чтобы было легче найти их при резке.
   6. Поместите формы в сумку или коробку и хранить при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока готовы сократить разделы.
   7. Используя криостат, нарежьте 10 мкм секций и поместите ткань на помеченные, положительно заряженные слайды.
3. Окрашивания
   1. Приготовьте блокирующее решение (0,3% Triton X-100, 4% нормальная сыворотка осла в PBS).
   2. Используйте гидрофобную пап-ручку, чтобы нарисовать по периметру ткани.
   3. Промыть слайды с PBS 3 раза в течение 5 минут каждый.
   4. Замените PBS блокирующим раствором на 1 ч при комнатной температуре.
   5. Замените блокирующий раствор раствором антител (антитела при соответствующей концентрации, 0,1% Triton X-100, 4% нормальной сыворотки осла в PBS) на 4 градусов по Цельсию за одну ночь.
   6. На следующий день, мыть слайд 3 раза с PBS в течение 10 минут каждый.
   7. Замените PBS соответствующимвторичным антителом (при соответствующей концентрации), разбавленным в антител оменитель номиналу на 1 ч при комнатной температуре.
   8. Промыть 3 раза в течение 10 минут каждый раз с 1x PBS.
   9. Нанесите 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно и промыть три раза в течение 10 минут каждый с 1x PBS.
   10. Affix покрывает спереди горки монтажным раствором, высушивает при комнатной температуре в темноте и хранит в темноте при температуре 4 градусов цельсия.

Результаты

На рисунке 1 показаны репрезентативные яркие изображения нескольких точек времени, чтобы продемонстрировать, как выглядят клетки/органоиды на разных этапах протокола. HESCs были удалены из ткани культуры пластины, разбиты на мелкие кусочки, и помещены в T75 ультра-низкой к?...

Обсуждение

Как и другие модели органоидов, это искусственная система, которая поставляется с несколькими оговорками. Хотя было мало партии партии изменения с точки зрения общего уровня выражения, отдельные органоиды действительно проявлять различия. Например, расположение положительных област?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814