Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und zum Einfrieren vor der Röntgenfluoreszenz-Bildgebung mit einer synchromtronen kryogenen Röntgensonde vorgestellt. Wenn nur raumtemperaturnano-analyse zur Verfügung gestellt wird, können die gefrorenen Proben weiter gefriergetrocknet werden. Dies sind wichtige Schritte, um Informationen über die intrazelluläre elementare Zusammensetzung zu erhalten.

Zusammenfassung

Über die Verteilung von Metallionen auf subzellulärer Ebene ist nur sehr wenig bekannt. Diese chemischen Elemente haben jedoch wesentliche regulatorische Funktionen und ihre gestörte Homöostase ist an verschiedenen Krankheiten beteiligt. Modernste Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden bieten die erforderliche Empfindlichkeit und räumliche Auflösung, um die zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Verteilung und Konzentration von Metallen in ganzen Zellen an der Organelle-Ebene. Dies eröffnet neue spannende wissenschaftliche Forschungsfelder zur Rolle von Metallen in der Physiopathologie der Zelle. Die zelluläre Vorbereitung ist ein schlüsseleines und oft komplexes Verfahren, insbesondere für die Basisanalyse. Obwohl Röntgenfluoreszenztechniken inzwischen weit verbreitet sind und verschiedene Präparationsmethoden verwendet wurden, haben nur sehr wenige Studien die Erhaltung des Elementargehalts von Zellen bestenfalls untersucht, und kein schrittweises detailliertes Protokoll für die Kryovorbereitung von anhaftende Zellen für Röntgenfluoreszenz-Nanosonden wurden bisher freigesetzt. Dies ist eine Beschreibung eines Protokolls, das die schrittweise zelluläre Vorbereitung für eine schnelle Kryofixierung bereitstellt, um die Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanoanalyse von Zellen in einem gefrorenen hydratisierten Zustand zu ermöglichen, wenn eine kryogene Umgebung und Übertragung verfügbar ist. Für den Fall, dass eine Nanoanalyse bei Raumtemperatur durchgeführt werden muss, wird ein zusätzliches Verfahren zur Gefriertrocknung der kryofixierten zellulären Präparation vorgesehen. Die vorgeschlagenen Protokolle wurden in früheren Arbeiten erfolgreich eingesetzt, zuletzt bei der Untersuchung der 2D- und 3D-intrazellulären Verteilung einer organometallischen Verbindung in Brustkrebszellen.

Einleitung

Neu entwickelte Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden (SR-XRF) ermöglichen eine vollständig quantitative Visualisierung der subzellulären Verteilung von Elementen. Diese analytische Fähigkeit ermöglicht beispielsweise die Untersuchung der Aufnahme von Nanopartikeln¹ oder organometallischen Molekülen wie Osmium-basierten Komplexen², die Einen Einblick in die intrazelluläre Aufnahme von metallbasierten Molekülen mit potenten Krebseigenschaften geben. Als Multielement-Technik bietet SR-XRF³ mit Nanosonde eine Möglichkeit, intrazellulär die biologisch wichtigsten Elemente wie Phosphor, Schwefel, Kalium, Kalzium, Eisen, Kupfer und Zink zu quantifizieren und zu lokalisieren. Tatsächlich bietet die Verwendung von harten Röntgenstrahlen eine große Eindringtiefe, um ganze tiefgefrorene Zellen etikettenfrei abzubilden. Darüber hinaus wird die Röntgenfluoreszenz, die den Zugriff auf die K-Kante der meisten Elemente von Interesse bietet, am effizientesten angeregt. Der Einsatz kryogener Ansätze ermöglicht die Reduzierung von Strahlungsschäden und die Optimierung der Erhaltung der Zellstruktur und der Elementarverteilung.

Die meisten verfügbaren räumlich aufgelösten Analysetechniken zum Untersuchen von Metallen in Zellen sind Oberflächentechniken, die sehr dünne und flache Zellabschnitte erfordern. Dazu gehören vor allem die Rastertransmissionselektronenmikroskopie mit energiedispersiver Röntgenanalyse (STEM-EDX), die energiegefilterte Transmissionselektronenmikroskopie (EF-TEM) und die nanoskalige Sekundärionenmassenspektrometrie (nanoSIMS). Letzteres kann nicht an gefrorenen, hydratisierten Zellabschnitten durchgeführt werden, während die Kryoanalyse mit Elektronenmikroskopie mit unübertroffener räumlicher Auflösung, aber schlechter Elementarempfindlichkeit durchgeführt werden kann. Die partikelinduzierte Röntgenemission (PIXE) ermöglichte die Untersuchung von Elementarverteilungen in ganzen Zellen. Es hat den Vorteil, dass es vollständig quantitativ mit einer fairen Elementarempfindlichkeit auf der Mikronskala und sogar bei Submikron-Auflösung⁴ist, aber leidet unter Strahlenschäden und mangelnden kryogenen Fähigkeiten, gefrorene hydratisierte Zellen zu untersuchen. Alle diese Analysetechniken ergänzen sich in der elementaren Abbildung von Zellen, aber für alle Techniken ist das Probenvorbereitungsverfahren ein entscheidender Schritt. Es sollte einfach gehalten werden, mögliche Kontaminationen sowie elementare Umverteilung und/oder Leckage zu begrenzen, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Wie in der Elektronenmikroskopie gezeigt, ermöglicht ein kryogener Arbeitsablauf, einschließlich Kryo-Immobilisierung der Zelle und Kryotransfer in ein Kryoscan-Stadium, eine optimale elementare Konservierung auf subzellulärer Ebene so nah wie möglich am nativen Zustand^5,6,7,8,9,10. Dieses Verständnis wurde erfolgreich in die Entwicklung der Synchrotron-Kryo-Soft-Röntgenmikroskopie (z.B. Vollfeldmikroskope und Rastermikroskope) umgesetzt, um ultrastrukturelle Bildgebung ganzer gefrorenhydratisierter Zellen in 2D oder 3D zu erzeugen. Verschiedene kryogene Arbeitsabläufe wurden¹¹ für weiche Röntgenmikroskope bei Beamline 2.1 (XM-2) der Advanced Light Source am Lawrence Berkeley National Laboratory¹²entwickelt, Beamline U41-XM am Elektronenspeicherring BESSY II (Deutschland)¹³, Beamline MISTRAL der ALBA Lichtquelle (Spanien)¹⁴, und bei Beamline B24 der Diamantlichtquelle¹⁵, unter anderem. Ein ähnlicher Workflow erwies sich kürzlich als die zuverlässigste Methode zur Herstellung und Konservierung der intrazellulären Elementaranalyse mit Röntgenmikrosonden^16,17.

Obwohl Röntgen-Nanosonden-Techniken beginnen, weit verbreitet für zelluläre Elementaranalyse verwendet werden, vor allem mit dem Aufkommen von kryogenen SR-XRF-Fähigkeiten, wurde bisher kein stufenweisen Protokoll an die Forschungsgemeinschaft verbreitet. Hier beieinem detaillierten Verfahren wird ein detailliertes Verfahren zur Herstellung kryofixierter haftierter, als Monolayer auf Siliziumnitridmembranen kultivierten, die unter kryogenen Bedingungen analysiert werden sollen. Ein Gefriertrocknungsschritt, der nach dem Protokoll angewendet werden muss, falls die Röntgenanalyse bei Raumtemperatur durchgeführt werden muss, ist ebenfalls vorgesehen. Während das vorgeschlagene Protokoll erfolgreich mit menschlichen Brustkrebszellen MD-MB-231² verwendet wurde und die Gefriertrocknung unter anderem an Den Mausneuronen^18,20,21gezeigt wurde, kann es leicht auf verschiedene Arten von menschlichen oder tierischen Zellen ausgedehnt werden.

Protokoll

Experimentelle Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der Life Sciences Division der CEA (CETEA, A14-006) genehmigt. Sie wurden in Übereinstimmung mit den französischen Rechtsvorschriften und der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 24. November 1986 (86/609/EWG) durchgeführt.

1. Siliziumnitrid (Si₃N₄) Membranunterstützungspräparation

HINWEIS: Da die Membran zerbrechlich und empfindlich ist, muss ihre Stütze (200 m dicker Siliziumrahmen) schonend gehandhabt werden, idealerweise mit einer dünnen Carbon-Pinzette oder Dumont Pinzette #5, Gerade selbstschließende Feine. Dieses Protokoll verwendete Siliziumnitridmembranen mit einem Rahmen von 5 mm x 5 mm und einer Membrangröße von 1,5 mm x 1,5 mm. Die Membran sollte etwa 12 h vor Beginn des Experiments vorbereitet werden (d.h. Zellsaat). Membranen können am Ende des Tages vorbereitet werden und über Nacht unter einer laminaren Strömungshaube der Klasse II trocknen, so dass sie am nächsten Morgen einsatzbereit sind. Eine Siliziumrahmendicke von 200 m ist Standard für die meisten Unternehmen, die Siliziumnitridfenster verkaufen. Wenn das in diesem Protokoll verwendete Produkt nicht verfügbar ist, kann eine Membrangröße im Bereich von 0,5 bis 1,5 mm mit einer Standardrahmengröße von 5 mm x 5 mm verwendet werden. Die größere Membrangröße wird bevorzugt, wenn Röntgentomographie verwendet wird. TEM Gittertyp Siliziumnitridfenster mit einer Membrangröße von 0,5 mm und einer Dicke von 50 nm können ebenfalls verwendet werden.

1. Öffnen Sie die Kapsel mit der Membranstütze Si₃N₄ (Abbildung 1). Drücken Sie die Kapsel vorsichtig, um die Stütze leicht zu lösen.
2. Halten Sie eine der Ecken des Silikonrahmens mit der dünnen Pinzette. Achten Sie darauf, die Si₃N₄ Membran in der Mitte nicht zu berühren. Die 200 oder 500 nm dicke Membran kann leicht beschädigt werden.
3. Mit der dünnen Pinzette, legen Sie die Si₃N₄ Membranstütze vorsichtig in eine sterile Glas Petrischale, flache Oberfläche des Siliziumnitridfensters nach oben (d. h. den Hohlraum nach oben).
4. Entfernen Sie den Deckel der Petrischale und lassen Sie die Membranen unter UV-Licht für 25-30 min unter dem laminaren Strömungsschrank.
   HINWEIS: Das UVC-Licht (254 nm) ist in der Regel auf 200 w/cm²eingestellt.
5. Legen Sie 10 l Poly-L-Lysin auf die Membran. Der Tropfen sollte die Si₃N₄ Membran gut abdecken und kann sich etwas über den Siliziumrahmen ausbreiten. Lassen Sie es bei 37 °C für 25 min im Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit und 95% Luft, 5%_CO2.
   HINWEIS: In diesem Fall wurde eine Poly-L-Lysin-Beschichtung für die MDA-MB-231 Brustkrebszellen verwendet. Je nach Art der Zelllinie können verschiedene Beschichtungen verwendet werden, und dieser Schritt sollte entsprechend optimiert werden.
6. Füllen Sie in einer sterilen 48-Well-Platte verschiedene Brunnen mit 200 bis 250 l ultrareinem und ultraspurigem Wasser, das durch einen 0,22 m sterilen Filter gefiltert wird. In der Regel kann jeder Brunnen verwendet werden, um bis zu 2-3 Membranen zu spülen. Mit einer feinen Pinzette nehmen Sie die Membranstütze an einer Ecke des Siliziumrahmens auf. Spülen Sie die Membran sanft, indem Sie sie vertikal 10 s in drei aufeinanderfolgenden Brunnen untertauchen.
   HINWEIS: Die Membranstützen werden aus dem Inkubator entnommen und können bei Raumtemperatur verarbeitet werden, wobei die Temperatur und die Feuchtigkeit durch eine laminare Strömungshaube der Klasse II definiert werden.
7. Die Membranhalterung vertikal in einen leeren Brunnen einer sterilen 96-Wellplatte geben, bedecken und über Nacht unter einer laminaren Strömungshaube der Klasse II trocknen lassen.

2. Zellaussaat

1. In eine sterile 4 Brunnenplatte, legen Sie die Membranen mit ihrer flachen Seite nachoben.
2. MDA-MB-231-Zellen werden in DMEM in einer Monolayer-Kultur mit Phenolrot/Glutamax I gehalten, ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin bei 37 °C in einem 5% CO2-Luftbefeuchter.
3. Wenn die Zellen 60 bis 70 % Koninfluenza erreichen, entfernen Sie das Medium aus der Schale oder dem Kolben.
4. 1x mit 10 ml Phosphatgepufferte Saline von Dulbecco ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺waschen.
5. Fügen Sie 3 ml/T75 Kolben 0,05% Trypsin/EDTA Lösung hinzu und stellen Sie sicher, dass die gesamte Monoschicht mit der Trypsin-Lösung abgedeckt ist.
6. Inkubieren Sie für 3 x 5 min bei 37 °C, bis sich die Zellen zu lösen beginnen. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Zellen nicht übermäßig trypsinisieren und die Zellen nicht dazu zwingen, sich vorzeitig zu lösen.
7. Fügen Sie 8 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin oder kompletten Medien, hinzu und sammeln Sie die Zellen durch Pipettieren. Das Serum in den Medien neutralisiert das Trypsin.
8. Drehen Sie bei 250 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand.
9. Fügen Sie 8 ml frisches Komplettmedium in die 15 ml Tube mit dem Zellpellet und pipet die Zellen nach oben und unten, bis die Zellen in eine Einzelzellsuspension verteilt sind.
10. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie auf eine Konzentration von 5 x 10⁶ Zellen pro ml in vollständigen Medien (DMEM mit Phenol Red/1% eines 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptids in 0,85% NaCl-Lösung, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin).
11. Nehmen Sie 10 l der MDA-MB-231-Zellsuspension und legen Sie sie auf die Membran ab. Dies entspricht 50.000 Zellen/10 l für MDA-MB-231. Der Tropfen sollte die Si₃N₄ Membran gut abdecken und kann sich ein wenig auf dem Siliziumrahmen ausbreiten. Es ist darauf zu achten, dass die Membran Si_3N4 nicht mit der Spitze der Mikropipette berührt wird.
    HINWEIS: Je nach Art der Zelllinie und Experimenten oder Messungen kann die Zelldichte variieren und sollte entsprechend getestet werden. Hier wurde die vorgeschlagene Zelldichte für die Aussaat der Si₃N₄ Membran für die experimentellen Bedingungen und die weitere SR-XRF-Nanoanalyse der MDA-MB-231-Zellen²optimal befunden.
12. Bei Hippocampus-Neuronen (HN) entfernen Sie das Hippocampus-Gehirngewebe von embryonalen 18,5 Mäusen und verdauen Esin in 0,25% Trypsin in Hepes-HBSS (5,3 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 137,9 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 5,56 mM Glukose) bei 37 °C für 15 min^18,19.
13. Führen Sie die mechanische Dissoziation mit einer P1000-Pipette mit einer P1000-Spitze und einer P200-Spitze durch, indem Sie den Kegelinhalt mit der Pipette mehrmals zeichnen und freigeben. Achten Sie in diesem Schritt darauf, keine Luftblasen im Medium zu erzeugen, da Luftblasen für Neuronen giftig sind.
14. Warten Sie einige Minuten, bis sich das Aggregat am unteren Rand des Rohres absetzt.
15. Den Überstand, der die dispergierten Zellen enthält, in eine sterile Eppendorfröhre übertragen. Lassen Sie das Kulturmedium mit dem Aggregat 25 l.
16. Zählen Sie die dissoziierten Zellen mit einem Hämozytometer. Isolierte HN-Neuronen werden in einer Konzentration von 7 x 10⁴ Zellen cm^-2 auf Poly-L-Lysin (1 mg/ml Poly-L-Lysin)-beschichtete Siliziumnitridmembran plattiert.
17. Nur für Membranen mit HN, inkubieren die Neuronen in der ersten DMEM mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt. Ein h nach der Beschichtung von HN in DMEM wird das Medium in neurobasale Beschichtungsmedien (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl-Lösung und B27-Ergänzung d = 1/50 in Neurobasal verdünnt)^18,19geändert.
18. Für die MDA-MB-231-Zellen die Membranstützen 25 min bei 37 °C in den Inkubator (100% relative Luftfeuchtigkeit, 95% Luft und 5% CO₂) geben. Dadurch können sich die Zellen absetzen und mit der Ansteckung am Substrat beginnen. Dies kann in Abhängigkeit von der verwendeten Zelllinie angepasst werden.
19. Fügen Sie 1 ml des erforderlichen kompletten Kulturmediums hinzu (DMEM mit Phenol Red/1% eines 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptids in 0,85% NaCl-Lösung, ergänzt mit 10% fetalen Waden 1% Penicillin und Streptomycin) in jedem Brunnen der MDA-MB-231 Zellen, indem die Pipettenspitze gegen die Wand des Kunststoffbrunnens gelegt und das Medium sehr langsam freigesetzt wird, während es die Membran bedeckt.
20. Setzen Sie die Membran vertikal an die Wand der 4 Brunnenplatte, um alle Luftblasen zu entfernen, die in der Brunnenhöhle der Si₃N₄ Membran gefangen sind (Abbildung 2). Verwenden Sie dazu eine feine Pinzette und schieben Sie die Blase sehr sanft weg, indem Sie sich parallel zum Si₃N₄ Backside Frame bewegen, um zu vermeiden, dass die Membran berührt und beschädigt wird.
21. Legen Sie die Membran horizontal an der Unterseite des Brunnens zurück und lassen Sie die 4 Wellplatte im Inkubator für die erforderliche Zeit in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der verwendeten Zelllinie. Die MDA-MB-231-Zellen wurden über Nacht inkubiert.

3. Behandlung oder mittlere rindes

1. Entfernen Sie das Medium von der 4 Wellplatte.
2. Einmal mit 1 ml PBS-Lösung bei 37 °C abspülen. Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie 1 ml warmes komplettes frisches Medium in Gegenwart oder in Abwesenheit (Kontrollen) der gewünschten Behandlung mit einer 1 ml Pipettenspitze hinzu, wodurch die Flüssigkeit sehr langsam an die Wand der Brunnenplatte freigesetzt wird. Die Membran Si₃N₄ sollte langsam ohne Störungen untergetaucht werden, um Membranbewegungen oder Hebungen zu vermeiden.

4. Kryo-Immobilisierung der zellulären Zubereitung durch

HINWEIS: Am Ende der erforderlichen Inkubationszeit müssen die Zellen bei Vorhandensein oder Fehlen einer Behandlung sorgfältig abspült und kryofixiert werden. Etwa 30 min vor dem Abspülen und Abspülen der zellulären Vorbereitung vor dem Einfrieren, erst einstellen und abkühlen die automatische Tauchgefriermaschine. Bei der Manipulation von Kryogenen sind die Verwendung geeigneter kryogener Handschuhe, einer Schutzbrille, geschlossener Schuhe und eines Labormantels erforderlich. Flüssigstickstoff muss in geeigneten Dewars transportiert werden, und der Arbeitsplatz sollte mit einem Sauerstoffmonitor ausreichend belüftet werden. Im Idealfall trägt ein niedriger Hygrometriespiegel von 20 bis 30 % dazu bei, die Eiskontamination der Materialien, Dewars und Kryogene zu begrenzen, was der Verglasung der Proben (d. h. einer amorphen Eisschicht) abträglich ist. Idealerweise können je nach Erfahrungsniveau des Forschers bis zu 10 bis 12 Proben für eine einzelne Sitzung mit dem gleichen sekundären Kryogen-Flüssigethanbecher für die Vitrifizierung vorbereitet werden. Zwischen den Sitzungen erfordert der automatische Tauchgefrierschrank ein 1 h automatisches Backen. Idealerweise sollten Proben mit identischen Inkubationsbedingungen verarbeitet werden. Dennoch können Kontrollen zuerst verarbeitet werden, gefolgt von den Proben mit einer bestimmten Behandlungsbedingung.

HINWEIS: Beim Einfrieren des Eintauchens gelten die folgenden Schritte sowohl für MDA-MB-231- als auch für HN-Zellen.

1. Richten Sie den Kryoplunger für eine schnelle Kryofixierung von Zellen ein.
   1. Schalten Sie den automatischen Tauchgefrierschrank ein.
   2. Geben Sie die Parameter (z. B. Temperatur, prozentuale Luftfeuchtigkeit, Blotting-Zeit, wenn automatisches Blotting verwendet wird, und Position zum Anheben der Probe an die Oberfläche des Kryogens, um den Transfer in einen kryogenen Behälter zu erleichtern) direkt von der Konsole und Parametern ein. Einstellungsmenü. Im vorliegenden Fall wurden die Parameter der Feuchtekammer auf 37 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit eingestellt.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden bessere Verglasungsergebnisse und Röntgenaufnahmen mit schneller und sorgfältiger manueller Blotting erzielt. Daher verwendet das Protokoll kein automatisches Blotting-Sequenzprogramm.
   3. Befestigen Sie die Luftbefeuchterkammer und füllen Sie sie, um die Feuchtigkeit zu erhalten, zunächst mit einer Spritze mit 60 ml doppelt destilliertem Wasser und dann mit 20 ml, wie auf der automatischen Tauchgefrierkonsole gefordert.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Reinstwasser, da es das Verdampfersystem beschädigen kann. Schließen Sie das Ventil und lassen Sie die Schläuche an der Rückseite des Luftbefeuchters befestigt.
   4. Installieren Sie den schwarzen Ethanbecher in seinen Halter und bedecken Sie ihn mit den Kunststoffkappen.
   5. Füllen Sie den Dewar der Kühlkammer mit LN₂und bringen Sie ihn auf die Ebene des Gitters im Arbeitsbereich.
   6. Legen Sie eine spezielle Kryo-Box auf, um die Membranen nach der Kryofixation im Transferbehälter am entsprechenden Standort im EM-GP-Arbeitsbereich und in der Nähe des Ethanbecherhalters zu lagern.
      HINWEIS: Die spezielle Kryo-Box ist eine eigenhausinterne Entwicklung an der Nanoprobe-Beamline ID16A der europäischen Synchrotronstrahlung in Grenoble. Zeichnungen mit Spezifikationen sind auf Anfrage erhältlich (Abbildung 3). Sie können vier gleichzeitig in einem 50 ml konischen Rohr gelagert werden, um es langfristig in einem LN2-Dewar zu lagern. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, ein kleines 0,2 ml normales PCR-Dünnwandrohr mit Kuppelkappen zu verwenden, um eine einzelne Si₃N₄ Membranunterstützung zu speichern. Sie müssen ein 2 mm langes Loch im oberen Teil des Wandrohrs mit einer beheizten Spritzennadel bohren, damit LN₂ das Rohr füllen kann.
   7. Füllen Sie den Transferbehälter mit LN₂ und bedecken Sie ihn mit dem dafür vorgesehenen Aluminiumdeckel. Füllen Sie die Kühlkammer weiterhin mit LN₂ (normalerweise werden 2 L benötigt), sodass die LN 2-Level-Monitoranzeige auf der Konsole bei 100 % bleibt. Warten Sie, bis die endgültige erforderliche Temperatur erreicht ist.
   8. Entfernen Sie die Kunststoffkappe und bedecken Sie den Ethanbecher mit dem an die Ethanflasche angeschlossenen Verflüssiger. Warten Sie, bis die Temperatur des Ethanbechers auf den Temperatursollwert gleicht. Wenn sie erreicht sind, beginnen Sie mit der Verwendung des sekundären Kryogens (d. h. verflüssigtem Ethan).
      HINWEIS: Der verwendete Sollwert lag bei -180 °C und damit leicht über dem Ethanschmelzpunkt (-182,8 °C). Sie müssen den Ethan-Verflüssiger nicht vorkühlen, da er eine Quelle der Frostbildung und Kontamination des Ethanbechers sein kann.
   9. Öffnen Sie das hochreine Ethanflaschen-Hauptventil und öffnen Sie sehr langsam den Druckregler, bis Sie einen langsamen Ethannebel erhalten. Halten Sie diesen sehr niedrigen Durchfluss, bis sich flüssiges Ethan aufbaut. Füllen Sie den Becher bis zur Oberkante. Schließen Sie den Druckregler und das Hauptventil der Ethanflasche. Entfernen Sie den Leica Verflüssiger vorsichtig und lassen Sie ihn beiseite auf einem kleinen Polystyrolträger unter der Dunstabzugshaube. Halten Sie den Arbeitsbereich lose mit der schwarzen Polystyrolkappe bedeckt, die mit der Maschine geliefert wird, um Frostkontaminationen des Arbeitsbereichs und des Ethanbehälters zu verhindern.
   10. Kurz vor dem manuellen Blotgen der Probe entfernen Sie die schwarze Polystyrolkappe und aus dem Menü der Konsolenpresse"Unterkammer", die die Umweltkammer mit dem kryogenen Arbeitsbereich in Kontakt bringt.
2. Bereiten Sie sich darauf vor, die Probe zu blots.
   1. Bereiten Sie den entsprechenden Puffer vor, um Spuren von Salzen aus dem Kulturmedium zu entfernen. Für dieses Protokoll wurde ein Ammoniumacetatpuffer zum Spülen der MDA-MB-231-Zellen verwendet.
      HINWEIS: Ammoniumacetatpuffer ist für die meisten Zelltypen geeignet und fügt dem Röntgenfluoreszenzsignal nicht hinzu (unter Berücksichtigung von Elementen mit Z > 9). Einige bestimmte Zelllinien wie neuronale Zellen können die Verwendung eines dedizierten Puffers erfordern. Beispielsweise kann für primäre kortikale Neuronen eine saline Lösung verwendet werden, die aus 1,8 Volumen von 0,5 M Na₂HPO₄ und 1,9 Volumen von 0,5 M NaH₂PO₄ besteht¹⁵. Auf der anderen Seite trägt Phosphor oder Chlor, der im Puffer enthalten ist, zum XRF-Spektrum bei. Diese Begrenzung der fadenscheinigen Röntgenemissionsleitungen muss in Abhängigkeit von den zu erkennenden Elementen im Auge behalten werden.
   2. 150 mM Ammoniumacetatlösung aus Ammoniumacetat-Ultrapure-Lösung vorbereiten und auf pH-Wert (7,0–7,3) und Osmolarität (270–300 mOsm/kg) überprüfen
      HINWEIS: Die oben genannte Osmolarität entspricht der Phosphatpuffer-Saline (D-PBS) von Dulbecco ohne Kalzium und Magnesium und kann mit einem Mikroosmometer überprüft werden.
   3. Füllen Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen aus einer 12 Brunnenkunststoffplatte mit dem Ammoniumacetatpuffer ein.
   4. Schneiden Sie ein Viertel Filterpapier zum Blotgen, entweder aus Filterpapier Nr. 1 mit vorgeschnittenem Loch oder aus manuell gestanztem Filterpapier mit 55 mm Durchmesser mit einem 15 mm Mittelloch.
   5. Nehmen Sie die benötigte Probe, die im letzten Moment bei 37 °C im Inkubator gelagert wird, vor dem Spülen und Einfrieren der Membran heraus.
   6. Entriegeln Sie die Pinzette mit dem schwarzen Klemmring der Schnellspannzange (typischerweise ein Dumont Spannring hochpräzise medizinische Pinzette) und greifen Sie die Si₃N₄ Membranunterstützung aus der Kultur gut.
      HINWEIS: Schnappen Sie sich die Mitte des Silikonrahmens und halten Sie die Spitze der Pinzette in der Nähe der Membran. Bewegen Sie den schwarzen Klemmenring bis zu den ersten Streifen, um die Pinzette zu verriegeln.
   7. Tauchen Sie die Si_3N4 Membranstütze vertikal in die Ammoniumacetat-Pufferlösung ein, die bei 37 °C für 5 s gehalten wird.
      HINWEIS: Die Unterstützung sollte vertikal im Puffer bleiben. Beachten Sie, dass die Pufferlösung in jedem Bohrgut der Platte für bis zu drei Membranen für die gleichen Inkubationsbedingungen verwendet werden kann.
   8. Mit Filterpapier manuell bübeln, um den überschüssigen Puffer aus der Membranspüllösung abtropfen zu lassen (Abbildung 4), um eine dünne und homogene Schicht aus wässriger Ammoniumacetatlösung zu hinterlassen, die die Zellen bedeckt.
      HINWEIS: Drücken Sie dazu zuerst die Rückseite des Fensters auf das Filterpapier, um fast den gesamten wässrigen Puffer zu entfernen, der im Brunnen und auf der Rückseite der Membran verbleibt. Zweitens, blot die Vorderseite, beginnend von beiden Seiten der Pinzette, dann jede Seite des Rahmens (Abbildung 4). Berühren Sie niemals die Membran. Der Überschuss des entleerten Puffers kann mit dem auf dem Filterpapier gebildeten Aureole überwacht werden.
   9. Öffnen Sie die Umweltkammertür und montieren Sie schnell die Pinzette, schieben Sie sie in die Zangenverriegelung, und schließen Sie die Tür (Abbildung 5).
   10. Drücken Sie "Blot/A plunge". Die Pinzette mit der Membran Si₃N₄ wird schnell in skryogen getaucht.
   11. Entfernen Sie den Deckel des Transferbehälters mit vorgekühlten Zangen.
   12. Drücken Sie "Transfer". Die Si₃N₄ Membran wird leicht über dem Kryogen nach oben bewegt.
   13. Trennen Sie die Pinzette in einer einzigen schnellen Bewegung, indem Sie sie aus der Zangenverriegelung schieben und leicht aus der Verriegelung kippen, um direkt in einen leeren Schlitz der Kryo-Box im mit LN₂gefüllten Transferbehälter zu gelangen. Lösen Sie den schwarzen Klemmenring, um die Membran zu befreien (Abbildung 5).
       HINWEIS: Der Transferbehälter sollte immer mit LN₂abgedeckt werden. Wenn eine Nachfüllung erforderlich ist, bedecken Sie den Ethanbecher mit dem mit gelieferten Kunststoffdeckel, um ln₂ und Ethan nicht zu mischen.
   14. Bedecken Sie den Transferbehälter mit einem Deckel und verwenden Sie einen kleinen weißen Polystyrolbecher, der mit LN₂ gefüllt ist, um ihn in eine mit LN₂gefüllte Polystyrolbox zu übertragen.
       HINWEIS: Die Kryo-Box oder Tube, die die Membranen enthält, kann dann in 50 ml konischen Rohren gelagert, die mit LN_{2 gefüllt} sind, und in eine Langzeitlagerung LN₂ Dewar übertragen werden. Bevor Sie mit dem Tauchen beginnen, die nächste Probe einfrieren, wärmen Sie alle kalten und gefrosteten Pinzette mit einem Haartrockner oder einem Kochplatten-/Kryowerkzeugtrockner (45 °C) auf, um eine Kontamination mit Eiskristallen zu vermeiden.

5. Gefriertrocknung von tauchgefrorenen Zellen, die auf Siliziumnitridmembranen kultiviert werden

HINWEIS: Für die Gefriertrocknung gelten die folgenden Schritte für MDA-MB-231- und HN-Zellen. Um den Gefriertrockner abzukühlen, müssen Sie etwa 40 min bis 1 h warten.

1. Einrichten des Gefriertrockners
   1. Schalten Sie das Gerät mit dem Wippschalter auf der Rückseite des Instruments ein.
   2. Beginnen Sie mit der Eingabe der Parameter nach dem LCD-Menü: Segment 1 = 2 h bei -120 °C; Segment 2 = 2 h Rampe von -120 °C bis -80 °C; Segment 3 = 2 h bei -80 °C; Segment 4 = 2 h Rampe von -80 °C bis 50 °C; Segment 5 = 2 h bei -50 °C; Segment 6 = 6 h Rampe von -50 °C bis 30 °C.
   3. Speichern Sie am Ende der Parametereinrichtung die Einstellungen, schließen Sie den Kammerdeckel und drücken Sie "START".
   4. Das Gerät pumpt bis 1,10^-5 mbar. Wenn dieser Druck erreicht ist, zeigt die Befehlszeile des Displays "Starten Sie jetzt ab, START wird fortgesetzt".
   5. Füllen Sie den flüssigen Stickstoff Dewar regelmäßig, um die Stufe unterhalb der Temperatur-Dreifachpunkteinstellung abzukühlen.
      HINWEIS: Die Stufe dreifachpunkttemperatur ist auf -140 °C eingestellt. Bevor Sie die Probe für dieses Protokoll laden, ist es am besten, etwa 1 h und eine Temperaturstufe von -160 °C zu warten.
   6. Das Display zeigt "Drücken Sie ENTER", wenn Sie bereit sind, "Sample laden".
   7. Kühlen Sie die Temperatur in einem LN₂ gefüllten Polystyrol Dewar, dem vom Lieferanten zur Verfügung gestellten Probentransferhalter und den beiden zusätzlichen zylindrischen Si₃N₄ Membranhaltern aus Messing auf.
   8. Montieren Sie den Membranmessinghalter Si₃N₄ auf den vom Lieferanten im Polystyrol-Dewar bereitgestellten Probentransferhalter (Abbildung 6A). Halten Sie den Pegel von LN₂ bis ca. 1 x 2 mm unter der Oberkante des ersten Messingstücks.
   9. Nehmen Sie eine Si₃N₄ Membranprobenunterstützung aus der Kryo-Box oder dem PCR-Rohr mit vorgekühlter selbstschließender Pinzette in Inox oder Teflon-beschichtet auf.
   10. Legen Sie die Membran mit der ZellprobeSeite nach oben in der Messinghalter nummerierten Kavität.
   11. Bedecken Sie die Baugruppe mit dem zweiten Messingstück als Deckel(Abbildung 6C).
       HINWEIS: Wir haben zwei Messingscheiben mit einer Dicke von jeweils 5 mm, einem Durchmesser von 50 mm und einem zentralen Loch mit 11 mm Durchmesser entworfen. Die erste Messingscheibe hat 14 gefräste rechteckige (8 mm x 6 mm) Positionen für Stützen (5 mm x 5 mm). Jeder Schlitz hat einen flachen und polierten Brunnen mit einer Tiefe von 2 mm. Die zweite Messingscheibe ist flach, um die Si₃N₄ Membran Messingträger zu decken und fungiert als Kaltfalle Gehäuse.
   12. Kühlen Sie die Transferstange in der LN₂ gefüllten Polystyrolschaumbox vor und verriegeln Sie sie in der Vollmontage (Abbildung 6D,E).
   13. Drücken Sie "ENTER" auf die Frontplatte des Gefriertrockners.
   14. Die Turbo- und Drehpumpen werden anhalten und die Kammer mit trockenem Stickstoffgas gereinigt, um das Öffnen des Deckels der Kammer zu ermöglichen.
   15. Die Probentransferbaugruppe mit dem federbelasteten Transferstab sofort in die Gefriertrocknerkammer geben und auf der Kupfer-LN_2-Kaltstufe befestigen.
       HINWEIS: Lassen Sie die volle Montage mit der Transferstange in die Kammer.
   16. Schließen Sie sofort den Deckel der Gefriertrocknerkammer und drücken Sie "START", um den Gefriertrocknungszyklus fortzusetzen.
   17. Füllen Sie das LN₂ Reservoir des Gefriertrockners alle 2 h manuell auf.
       HINWEIS: An dieses Reservoir kann ein automatisches LN 2-Füllsystem angeschlossen werden.
   18. Am Ende des Gefriertrocknungszyklus drücken Sie "STOP", um die Kammer zu entlüften, und entfernen Sie die vollständige Baugruppe, um auf die gefriergetrockneten Proben zuzugreifen.

Ergebnisse

Eine typische optische Videomikroskopansicht von gefrorenen hydratisierten MDA-MB-231-Zellen, die auf eine poly-L-Lysin beschichtete Si₃N₄ Membranunterstützung subkultiviert wurden, ist in Abbildung 7Adargestellt. Die optische Ansicht der Probe in der Vakuumkammer wurde im Reflexionsmodus mit dem speziellen Online-Videomikroskop der ID16A-Beamline des ESRF²²erhalten. Während die Elektronen- oder Weichröntgenmikroskopie erfordert, dass die Eisschicht, die die Zelle einbettet, so dünn wie möglich ist (typischerweise <0,5 m), haben harte Röntgenstrahlen (>10 keV) den Vorteil einer viel höheren Eindringtiefe und einer niedrigeren Dosisabscheidung. Die Eisdicke kann daher größer sein, typischerweise <10 m einschließlich der Zelle, so dass das Eis, das die Zelle einbettet, ein paar m dicke ist. Dies kann durch die gemessene Röntgenintensität bei der Übertragung im Vergleich zur Intensität ohne die Probe unter Berücksichtigung der Absorption der 500 nm dicken Si₃N₄ Membran geschätzt werden. Diese Eisdicke kann durch manuelles Blotting erreicht werden, wie im vorliegenden Protokoll beschrieben. Im Bereich der Newton-Ringe kann die Eisdicke noch dünner (nicht gemessen) werden.

Die Röntgenfluoreszenz-Elementarkartierung der gefrorenen hydratisierten Zelle ist in Abbildung 7B mit den repräsentativen Verteilungen physiologischer Elemente wie Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn) dargestellt. Diese Karten stellen die elementare areale Masse (d. h. die elementare projizierte Masse) dar. Obwohl dies im vorliegenden Fall nicht der Fall ist, können solche Karten durch röntgenbasierte Propagierungs-basierte Phasenkontrast-Bildgebung normalisiert werden, die die Schätzung der projizierten Masse der Probe²³liefert. Wie in vielen Studien berichtet, wurde angenommen, dass das stark diffusible K-Ionen in Zellen, die in ihrem nah nativen Zustand konserviert wurden, homogen über die gesamte Zelle^23,24,16verteilt war. Wie in den 2D-Röntgenfluoreszenz-Elementarbildern in Abbildung 7Bdargestellt, war das eng gebundene Element S ähnlich wie K gleichmäßig innerhalb der Zelle verteilt und stellt eine gute Schätzung des zellulären Massenprofils dar. Die Zn-Verteilung hatte ein höheres Signal im Kern als im Zytosol und umriss den Kern klar. Es ist anzumerken, dass kleine Zn-angereicherte Regionen bei der räumlichen Auflösung (50 nm) im Nuklearbereich nachgewiesen werden können.

Die vorhandenen Röntgen-Nanosonden oder die zu bauenden sind nicht unbedingt kryogenen Fähigkeiten rechnung. In diesem Fall ist die beste Alternative, Um Röntgenfluoreszenzbilder von Zellen mit sub-100 nm räumlichen Auflösungen zu erhalten, ein in diesem Protokoll beschriebenes Gefriertrocknungsverfahren nach dem Einfrieren der Zelle durchzuführen. Abbildung 8A zeigt eine typische Hellfeldmikroskopieansicht der resultierenden gefriergetrockneten primären Maus-Hippocampus-Neuronen, die direkt auf der Si₃N₄ Membran kultiviert werden. In diesem Fall können die Proben, wenn sie in einer sauberen Trockenkammer gelagert werden, 1-2 Wochen im Voraus vorbereitet und mit einem gewöhnlichen aufrechten optischen Mikroskop zur Registrierung von Interessengebieten beobachtet werden. Es sollte darauf geachtet werden, die Exposition gegenüber Der Umgebungsfeuchtigkeit zu verhindern, da sie von der gefriergetrockneten Probe erfasst werden kann und zu Schäden unter dem Röntgen-Nanostrahl führen kann. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf sehr empfindliche Zellen (d. h. neuronale Zellen) angewendet und noch bessere Ergebnisse wurden mit anderen robusteren Zelltypen, wie Krebszellen, erzielt. Was die tauchgefrorenen Zellen betrifft, so ähneln die Röntgenfluoreszenzbilder von K, S und Zn auf dem gesamten gefriergetrockneten Zelldisplay den oben beschriebenen. Sie sind repräsentativ für die Elementarverteilungen, die in verschiedenen Arten von gefriergetrockneten Zellen mit einer räumlichen Auflösung von 50 bis 100 nm zu finden sind. Während das Einfrieren von ganzen Zellen eine Alternative zur Erhaltung der elementaren Integrität ist, geht es auf Kosten einer perfekten Konservierung der Zellmorphologie^16,insbesondere der Zellmembranen.

Abbildung 1: Typische Probenunterstützung für röntgenfluoreszenz-Nanoanalysen. Eine Si₃N₄ Membranstütze in ihrer Schutzkapsel. Diese Art von Substrat kann sowohl für die Raumtemperaturanalyse (Plunge-Freeze-Zellpräparation gefolgt von niedrigtemperatur- und vakuumarmem Gefriertrocknungsprozess) als auch für die kryogene Röntgenfluoreszenzanalyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Ansicht der Siliziumnitridfenster nach dem Aussäen der Zelle. Die Zellen werden direkt auf die poly-L-Lysin beschichtete flache Oberfläche der Si_3N4 Membranträger kultiviert. Manchmal können Luftblasen in der hinteren Kavität der Si₃N₄ Membranstütze gefangen werden und müssen wie im Protokoll beschrieben entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Eigenentwickelte 3D-gedruckte Kryobox zur Langzeitlagerung von tauchgefrorenen Si₃N₄ Membranstützen in flüssigem Stickstoff Dewar. (A) Kryo-Box mit dem Behälter und den Kappen (unterer Teil) und (B) der montierten Kryo-Box mit verschlossenen Kappen zerlegt. Die Kappen können mit der Pinzette manipuliert werden, öffnen oder verriegeln durch Drehung. Ein detaillierter Plan für den 3D-Druck ist auf Anfrage bei ESRF ID16A erhältlich. Das Design wurde für Siliziumnitrid-TEM-Gitter hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Blotting von Zellen, die auf Si₃N 4 kultiviert_werden. Vor dem Einfrieren muss die auf eine Si₃N_4-Membran kultivierte Zellmonoschicht in Ammoniumacetatlösung (A) abspült und sorgfältig manuell mit Filterpapier (B)geblutet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Automatisches Einfrieren em-GP Maschine. (A) Der automatische Tauchgefrierschrank. (B) Umweltkammer mit eingeschlossener Pinzette. (C) Der Ethanbecher, der mit dem Leica-Verflüssiger bedeckt ist, der mit einer Ethanflasche verbunden ist. (D) Das Gefriergehäuse mit dem schwarzen Becher voller verflüssigtem Ethan und der Kryo-Box zur weiteren Lagerung in LN₂ der verglasten Si_3N4 Membranen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Probenkryotransfer-Baugruppe für Gefriertrocknungsverfahren. (A) Der erste Messingempfänger für Si₃N₄ Membranen ist auf dem vom Gefriertrocknerlieferanten bereitgestellten Probentransferhalter montiert. (B) und (C) zeigen, dass die zweite flache Messingscheibe als Abdeckung verwendet wird und als Kaltfanggehäuse dient, das in das Vakuumgehäuse des Gefriertrockners eingesetzt werden soll. (D) Die Vollmontage mit dem federbelasteten Transferstab. (E) Der Probenhalter, der die verglaste Zellzubereitung auf der Membran Si_3N4 trägt, muss weiter in den LN_2-gekühltenGefriertrockner eingesetzt werden. Alle Schritte zur Montage der Montage erfolgen in LN₂ in einer Styroporbox. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden alle Bilder in Abwesenheit von LN₂erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Kryo-Röntgenfluoreszenz-Bilder einer gefrorenen hydratisierten Zelle mit harter Röntgen-Nanosonde. (A) Typische Online-Ansicht im Reflexionsmodus mit dem dedizierten optischen Videomikroskop der ESRF ID16A Beamline. Nach der manuellen Blotting wurde eine Gesamteisdicke von ca. 5 x 10 m erreicht, die eine klare Sicht auf die gefrorenen hydratisierten Zellen ermöglicht. Eine Region mit Newton-Ringen, die auf noch viel dünneres Eis hindeuten, ist spürbar. (B) Repräsentative Kryo-Röntgen-Fluoreszenz zelluläre Verteilungen der physiologischen Elemente Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Röntgenfluoreszenzbilder einer gefriergetrockneten neuronalen Zelle mit harter Röntgen-Nanosonde. (A) Typische Hellfeldmikroskopieansicht der resultierenden gefriergetrockneten primären kortikalen Zellen, die direkt auf die Si_3N4 Membran kultiviert werden. Skala bar = 200 m (B) Repräsentative Raumtemperatur-Röntgenfluoreszenzbilder eines einzelnen gefriergetrockneten Hippocampus-Neurons, das die Verteilungen der physiologischen Elemente Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn) zeigt. Maßstabsleiste = 2 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) erhielt 2017 den Nobelpreis für Chemie und damit die von J. Dubochet durchgeführte Entwicklung zur Verglasung von biologischem Material zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen in Lösung²⁵. Wie Dubochet in seinem Nobelvortrag "Wissen, wie man ein Tröpfchen Wasser vitrifyn, ist eine Sache, die Vorbereitung einer biologischen Probe für die biologische Beobachtung ist eine andere"²⁵. Kryovorbereitungsschritte gelten heute als Standardtechnik zur Minderung von Strahlendosisschäden und zur Untersuchung von Zellen in der Nähe ihres Mutterlandes. Die Vorbereitung bleibt jedoch mühsam. Dies liegt daran, dass die Elektronenmikroskopie aufgrund ihrer unübertroffenen räumlichen Auflösung empfindlich auf ultrastrukturelle Artefakte reagiert, die während der Probenvorbereitung auftreten. Die Synchrotron-Kryonanosonden nähern sich nun ähnlichen Schwierigkeiten, die auf räumliche Auflösungen von bis zu 13 nm im Hochenergie-Röntgenbereich²⁶sinken. Die harte Röntgenmikroskopie kann ganze Zellen analysieren, während die Elektronenmikroskopie unter der schlechten Eindringtiefe von Elektronen leidet, die es ermöglicht, nur sehr dünne Zellscheiben zu beobachten.

Monolayer von Zellen sind dünn genug, so dass durch Eintauchen in flüssiges Ethan die erforderlichen Kühlraten für die Wasserverglasung erreicht werden. Theoretisch sind Kühlraten von bis zu 10⁸ K/s mit Hochdruckgefrieren²⁷ möglich, was die Verglasung von Proben ermöglicht, die zu dick für das Eintauchen sind. Eine Kühlleistung von 10⁵ K/s, die erforderlich ist, um eine vollständige Verglasung der Probe bei Umgebungsdruck²⁸zu ermöglichen, wird mit der hier vorgestellten automatischen Eintauchmaschine und den hier dargestellten Parametern reproduzierbar erreicht. Dies ermöglicht es einem Forscher, dünne biologische Proben (<10 m) wie eine Monoschicht der Zellen^{12,13,14,15,29,30} durch Eintauchen in flüssiges Ethan zu vitrifyn.

Eine wichtige Herausforderung bei diesem Protokoll besteht darin, auch die chemische Integrität des intrazellulären Inhalts so weit wie möglich zu erhalten, um zuverlässige Elementarverteilungen innerhalb der Zelle in 2D oder 3D zu gewährleisten. Wie an anderer Stelle veröffentlicht^2,16,17,31, im Falle der elementaren Bildgebung auf subzellulärer Ebene sollte die Analyse von gefrorenen hydratisierten Zellen in Betracht gezogen werden. Ansonsten kann die Kombination aus Tauchfrost und Gefriertrocknung von Zellen für die Raumtemperaturanalyse verwendet werden. Für letztere wird das amorphe Eis durch den Prozess der Sublimation entfernt, während die gebundenen Wassermoleküle durch den Prozess der Desorption entfernt werden. Dieser Prozess kann im Vergleich zu gefrorenen hydratisierten Proben aufgrund der möglichen Veränderung der Zellmembranen und der Morphologie einiger subzellulärer Strukturen bei weitem nicht ideal sein³². Auch für Speziationsstudien kann die Wasserextraktion zu Metall-Speziationsartefakten führen. Dennoch war es erfolgreich und die beste Alternative zu gefrorenen hydratisierten Proben für elementare Bildgebung auf sub-100 nm Ebenen^{2,16,17,18,20,33,34,35,36}.

Wie berichtet³⁷, kann die Qualität der kryokonservierten zellulären Präparate durch das Kalium-Natrium-K/Na-Verhältnis bewertet werden. Leider kann sie mit der hier verwendeten harten Röntgen-Nanosonde aufgrund der geringen Energieabschaltung des Silizium-Driftdetektors, mit dem die Röntgenfluoreszenzphotonen der Elemente (E- 1,3 keV Magnesium) erkannt werden, noch nicht ermittelt werden. Tatsächlich ist ein hohes K/Na-Verhältnis (>10), das mit TOF-SIMS, EPMA oder Kernmikrosonde PIXE¹⁶gemessen werden kann,³⁷ ein Hinweis auf die erhaltene chemische Integrität der Zelle im Vergleich zu der erwarteten K/Na von 25 in einer lebenden Zelle³⁷. Dies kann durch ein gleichzeitig niedriges Cl/K-Verhältnis³⁸unterstützt werden. Dennoch kann eine unvollkommene Verglasung, insbesondere wenn die Geschwindigkeit der Probenkühlung zu niedrig ist, zur Bildung großer Eiskristalle führen, die Zellmembranen und Organellen schädigen können, was die Verteilung chemischer Elemente verändern kann. Obwohl es kein routinemäßiges Verfahren zur Überwachung dieser potenziellen Schäden und Auswirkungen auf die intrazelluläre Verteilung gibt, können die oben genannten Elementarverhältnisse und die Möglichkeit, die Zelle mit hoher Auflösung mit Röntgenphasenkontrast oder kryoweicher Röntgenmikroskopie abzubilden, die besten Ansätze sein, um eine gute Erhaltung der intrazellulären Kompartimente mit gleichzeitiger Erhaltung der elementaren Integrität zu unterstützen. Die Kombination dieser Techniken und der Einsatz neu entwickelter kryokorrelativer Fluoreszenz-Optischen Mikroskope werden dabei helfen zu beurteilen, inwieweit diese Schädigung auftritt und sich auf die intrazelluläre Elementarverteilung auswirkt.

Insgesamt wird ein detailliertes und umfassendes Protokoll zur Vorbereitung zellulärer Proben für die Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanoanalyse vorgestellt. Es ist ein guter Ausgangspunkt für die Forschungsgemeinschaft und hilft, die schwierige Frage zu lösen, wie geeignete zelluläre Proben für 2D- und 3D-Elementaraufnahmen bei (Kryo) harten Röntgen-Nanosonden vorbereitet werden können. Diese Ansätze können mit optischen Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie-Fähigkeiten für eine tiefgehende korrelative chemische und strukturelle Bildgebung von Zellen zusammengeführt werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O	SIGMA	09691-250mL	One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x	Life Technologies, Invitrogen	17504-044	for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)	GIBCO	14190-094	cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)	GIBCO	21885025	cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies, Invitrogen	31966-02	for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology	World Precision Instrument	501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer	Quorum Technology	EK3147
Ethane N45	Air Liquid	p0505s05r0a001	C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin	GIBCO	A31604-02	cell culture
HBSS 10x	Life Technologies, Invitrogen	14185-052	for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps	Leica	16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell	ATCC	ATCC HTB-26	cell culture
Neurobasal medium	Life Technologies, Invitrogen	21103-049	for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate	Thermo Fisher	176740	cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer	Advanced Instruments	Osmo1	Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin	SIGMA	P4333	cell culture
poly-L-lysine	SIGMA	P4707	Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit	Leica	16706401	Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4)	Silson Ltd.	SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl	The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4%	GIBCO	15250061	cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	GIBCO	25300-054	cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water	Fisher Chemicals	W9-1	MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole	Leica	16706440	Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.