Индуцирование Острая травма печени у крыс через углеродный тетрахлорид (CCl4) Воздействие через орогастрическую трубку

Резюме

Этот протокол описывает общий и осуществимый метод индуцирования острой травмы печени (ALI) через CCl₄ воздействия через орогастрическую трубку. Воздействие CCl₄ вызывает АЛИ путем формирования реактивных видов кислорода во время его биотрансформации в печени. Этот метод используется для анализа патофизиологии АЛИ и изучения различных стратегий гепатопротектор.

Аннотация

Острая травма печени (ALI) играет решающую роль в развитии печеночной недостаточности, которая характеризуется тяжелой дисфункцией печени, включая осложнения, такие как печеночная энцефалопатия и нарушение синтеза белка. Соответствующие модели животных имеют жизненно важное значение для проверки механизма и патофизиологии АЛИ и исследовать различные стратегии гепатозащиты. Благодаря своей способности выполнять химические преобразования, тетрахлорид углерода (CCl₄) широко используется в печени, чтобы вызвать АЛИ путем формирования реактивных видов кислорода. Воздействие CCl₄ может быть выполнено внутрипереперитонеально, путем вдыхания, или через назогастрическую или орогастрическую трубку. Здесь мы описываем модель грызунов, в которой ALI индуцируется воздействием CCl₄ через огазовачную трубку. Этот метод является недорогим, легко выполняется, и имеет минимальный риск опасности. Модель высоко воспроизводима и может быть широко использована для определения эффективности потенциальных стратегий гепатопротекторирования и оценки маркеров повреждения печени.

Введение

Растет частота токсичных оскорблений в печени, особенно из-за злоупотребления алкоголем и наркотиками. Острая травма печени (ALI) связана с высоким и сбольшим уровнем смертности и вызвала клинические проблемы^1,,2. Токсические травмы приводит к смерти сигнализации пути в печени, в результате чего гепатоцита апоптоза, некроз, или пироптоз. ALI играет решающую роль в развитии печеночной недостаточности, которая характеризуется тяжелой дисфункцией печени, включая осложнения, такие как печеночная энцефалопатия и нарушение синтеза белка^3,4. Хотя последние исследования расширили наши знания о физиологических и патологических изменениях, сопровождающих печеночную недостаточность, он не полностью объяснил патомолекулярные особенности, которые влияют на механизмы гибели клеток. Кроме того, в настоящее время нет лекарств, чтобы обратить вспять прогрессирующее ухудшение у пациентов ALI. В настоящее время единственным значительно эффективным методом лечения является трансплантация печени^5,,6.

Для того, чтобы исследовать механизм и патофизиологии АЛИ и проверить различные стратегии гепатозащиты, различные модели животных используются для индуцирования АЛИ. Предпочтительная модель животных АЛИ должна имитировать патологический процесс заболевания с помощью надежного, проверенного, недорогого и простого в применении метода. Примеры экспериментальных моделей включают гепатотоксические агенты, хирургические процедуры, такие как полная или частичная гепатэктомия, полная или преходящая деваскуляризация, а также инфекционные процедуры^7,,8,9. Известные гепатотоксические вещества включают галактозамин, ацетаминофен, тиоацетамид, азоксиметан и CCl₄. Из них, CCl₄ широко используется, хотя он еще не был хорошо характеризуется^10,11,12,13.

CCl₄ является органическим бесцветным жидким соединением со сладким запахом и почти без воспламеняемости при более низких температурах. Воздействие высоких концентраций CCl₄ может привести к повреждению центральной нервной системы, в том числе ухудшение печени и почек. CCl₄ индуцирует ALI через его биотрансформацию в печени, которая образует реактивные виды кислорода. Это происходит через P450 цитохромный фермент 2E1, образуя активный метаболит и в результате повреждения клеток при связывании макромолекулы, повышение перекисного окисления липидов и нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция¹⁴. Кроме того, модель CCl₄ может быть использована для стимуляции астроцитов на уровне синтеза РНК^15. Этот гепатотоксин был введен интраперитонеальных, интрапортальных, устных и интрагастральных маршрутов¹⁶.

В этом протоколе мы подробно₄описываем CCl 4-индуцированных ALI у крыс через огазовачную трубку. Этот метод индуцирует надежный и воспроизводимый АЛИ, который может быть использован для исследования патогенеза АЛИ. Определение тяжести заболевания печени контролируется путем измерения сывороточного глутамата-пирувате трансаминазы (GPT), глутамичных ферментов оксалоацетической трансаминазы (GOT) и общего билирубина (ТБ), а также окончательного гистологического диагноза гематоксилином и эозином (H и E) окрашенных тканей печени. Воздействие CCl₄ через внутрижелудочный доступ позволяет практичный, недорогой, минимально инвазивный метод с минимальным риском опасности.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Хельсинкских и Токиоских деклараций и Руководящими принципами по использованию экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Бен-Гуриона в Негеве.

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель CCl₄ была создана и использована в предыдущем исследовании¹⁷. Хронология протокола показана в таблице 1.

1. Подготовка крыс к экспериментальной процедуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите взрослых самцов крыс Sprague Dawley весом 300–350 г.

1. Получить одобрение на проведение экспериментов от Институционального комитета по уходу за животными и использованию (IACUC).
2. Поддерживайте крыс при комнатной температуре (22 градуса по Цельсию, 1 градус по Цельсию), с 12 ч светлыми и 12 ч темными циклами. Предоставьте крысиный чау и воду объявление libitum.
3. Выполняйте все эксперименты с 6:00 до 12:00.
4. Бритье крысы и дезинфицировать кожу с алкоголем.

2. Определение базовых уровней сыворотки, GPT и ТБ

1. Анестезии
   1. Подготовьте непрерывную систему администрирования изофруран для индуцирования анестезии. Убедитесь, что система испарителей заполнена изофрураном.
   2. Анестезируйтесь крысы с 2% изолюран. Подтвердите, что крыса полностью обезображен, наблюдая за движением и педали рефлекс в ответ на внешние раздражители.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изолюран и анестезию для индукции и обслуживания анестезии.
2. Канналист кабеля вены с 22 G катетер.
3. Соберите 0,5 мл крови на базовом уровне. Убедитесь, что извлеченный объем крови не превышает руководящие принципы IACUC.
4. Выполните биохимический анализ крови, включая измерения сыворотки GOT, GPT и ТБ, как ранее описано¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обследование ферментов печени и уровня туберкулеза проводилось в биохимической лаборатории Медицинского центра Сорока. Образцы крови были проанализированы с помощью метода флуоресценции на химии анализатор (Таблица материалов).

3. Индукция острой травмы печени у крыс

ВНИМАНИЕ: Воздействие высоких концентраций CCl₄, включая поглощение через пар или кожу, может иметь негативные последствия для центральной нервной системы и вызвать дегенерацию печени и почек. Длительное воздействие может привести к коме или смерти.

1. Подготовьте 50% раствор CCl₄ (Таблица материалов), смешивая CCl₄ с оливковым маслом в качестве транспортного средства в соотношении 1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решение должно быть подготовлено в соответствии с руководящими принципами IACUC для нефармацевтических соединений класса.
2. Индуцировать гепатотоксичность in vivo администрацией CCl₄ через огазовачную трубку.
   1. Вставьте 16 G орогастрической трубки (3 дюйма глубиной) через полость рта крысы.
   2. Выставляют крысу в различные дозы CCl₄ путем введения шприца с одним из следующих разбавленных растворов в желудок крысы: 1 мл/кг (мягкий ALI), 2,5 мл/кг (умеренный ALI), или 5 мл/кг (тяжелый ALI) 50% раствора. Для фиктивной контрольной группы, подвергать крысы 5 мл/кг оливкового масла только.

4. Определение уровня сыворотки GOT, GPT и ТБ после 24 ч

1. Анестезии
   1. Подготовьте непрерывную систему администрирования изофруран для индуцирования анестезии. Убедитесь, что система испарителей заполнена изофрураном.
   2. Анестезия крыс с 2% изолюран. Подтвердите, что крыса полностью обезображен, наблюдая за движением и педали рефлекс в ответ на внешние раздражители.
2. Соберите образцы крови при 24 ч от воздействия CCl_4.
3. Выполняйте биохимический анализ крови, включая измерения сыворотки GOT, GPT и Tb.

5. Сбор печени для гистологического обследования

1. Эвтаназия крысы, заменив вдохновил и газовой смеси с 20% O₂/80% CO₂. Убедитесь, что CO₂ поставляется по заранее определенной ставке в соответствии с руководящими принципами IACUC.
2. Обеспечить смерть, проверяя на отсутствие сердцебиения и подтвердить вторичным методом в соответствии с руководящими принципами IACUC.
3. Поместите крысу на рассекающую доску с ее царской поверхностью вниз и животом вверх. Бритье живота крысы.
4. Скальпелем, резни по всей длине кожи вентиляции от ануса до подбородка. Разделите кожу. Разрезайте брюшную стенку скальпелем из ануса в клифоидный хрящ, обнажая внутренности брюшной полости.
5. Используя ножницы и щипцы, изолировать печень, рассекая ее от связок и вложений. Начиная с печени hilum, тщательно выполнять гепатэктомии, выпустив все доли печени от вложений. Вскрыть и отрезать все связки и кровеносные сосуды.
6. Перенесите печень в чашку Петри. Исправить печень в 4% буферизированный раствор формальдегида (Таблица материалов) по крайней мере 24 ч.

6. Гистологическое обследование

1. Подготовка образцов
   1. После фиксации, разрезать образец на 5 мкм толщиной срез серии микротома секции.
   2. Аккуратно поместите ломтики на стеклянные горки с мягкой кистью, 1 ломтик на слайд.
   3. Выполните Н И E окрашивания, как ранее описано¹⁹.
2. Изучите ломтики под микроскопом при 200-x увеличении с помощью объектива 20 мм объективного объектива(Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секции печени должны быть оценены специализированным патологоанатомом, ослепленным протоколом лечения. Оценка 0 указывает на отсутствие аномалий печени, 1-2 указывает на легкую травму печени, 3-4 указывает на умеренную травму печени, и 5-6 указывает на серьезную травму печени^20,21,22.

Результаты

Уровень ТБ, GOT и GPT значительно увеличился на 24 ч после индуцирования ALI (больше при более высоких дозах CCl₄₎ по сравнению с фиктивными элементами управления (p qlt; 0.001)(рисунок 1). Уровни ТБ, ГОТ и ГПТ на базовом уровне были нормальными и не сильно отличались от фиктивных ?...

Обсуждение

В этом протоколе, CCl₄ используется в качестве токсина печени, чтобы вызвать АЛИ у крыс. АЛИ характеризуется потерей печеночной паранхимы и последующей дисрегуляцией метаболических и синтетических функций печени. Наркотики, вирусы, токсины, аутоиммунные заболевания, метаболическ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd