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要約

エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA のプロトコルについて説明します。

要約

ECLIAは、96ウェル形式で内因性および組換えタンパク質量を定量化することができる汎用性の高い方法です。ECLIAの効率を実証するために、このアッセイは、マウス脳組織におけるMeCP2の本質的なレベルとヒト真皮線維芽細胞におけるTAT-MeCP2の取り込みの分析に使用された。MeCP2-ECLIAは、低いイントラおよびインターアッセイ誤差で、高精度で再現性の高い測定を行います。要約すると、高スループットスクリーンで利用できるMeCP2タンパク質変異体の定量的手法を開発しました。

概要

エレクトロケミフルミネッセンスイムノアッセイ(ECLIA)は、電気化学的に刺激された際に発光を放出するように設計されたラベルを利用するプロセスに基づいています。これは、基礎産業および学術研究、食品産業、ならびに臨床診断における生物学的分析物の定量的検出のための広く適用可能な技術である1.一般的に、カーボンインク電極を備えた使い捨て可能な96ウェルプレートが使用されます。これらの電極は、免疫測定のための固相担体として機能する。二次抗体は電気化学発光ラベルに結合され、電気がシステムに適用されると、化学ラベルの発光がトリガされます。超低雑音電荷結合装置(CCD)は、捕捉抗体に結合した抗原に直接比例する光強度を記録し、その結果、試料2の標的検体の定量化を行う。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)と比較して、ECLIAは高感度、再現性、ならびにより優れた自動化および一貫性を提供するので有利であると考えられる3。

ここでは、新開発のECLIAシステムを用いて、ヒトおよびマウス由来のサンプルおよび組換えタンパク質の異なる変異体におけるメチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)レベルを分析した。MecP2は、メチル化DNA配列と相互作用することが知られているX結合型核酸結合タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子発現44,55の調節に関与している。このタンパク質をコードする遺伝子の機能喪失変異は、Tett症候群(RTT)を引き起こす主な原因である、重度の神経発達障害6である。別のMeCP2関連障害、MECP2重複症候群は、RTT 7のものと重なり合う神経学的症状にもつながりる。特に、女性は主にRTTの影響を受け、男性は主にMECP2複製症候群66、77に苦しんでいます。

これらの障害は、中枢神経系(CNS)においてそれぞれ不十分または過剰なMeCP2レベルに関連している。したがって、CNSでMeCP2レベルを増加させるRTTの治療オプションは、MeCP27の過剰に関連する有害な影響を避ける必要があります。この事実により、ECLIAシステムによって提供されるMeCP2タンパク質レベルの高感度かつ正確な定量化は、RTTの進歩とMECP2重複症候群の研究にとって非常に重要です。ヒト細胞株およびマウス組織サンプルからの内因性および外因性MeCP2レベルの正確な測定と、ヒトMeCP2アイソフォームB(アイソフォームe1とも呼ばれる)からなる組換えタンパク質、および血液脳関門8を横断する可能性を有する最小N末端HIV-TAT伝達ドメイン(TAT-MeCP2)が提示される。

プロトコル

研究目的での皮膚生検調達の承認は、オーストラリアのウェストミードにある小児病院の人間研究倫理委員会から得られました。動物実験の同意は、オーストリア連邦科学研究経済省から取得され、地元の動物福祉規制に従って実施されました(GZ:66.009/0218-II/3b/2015)。

注: ECLIA システムの原理は図1に示されています。

1. 抗体の選択

  1. 様々なMeCP2抗体の範囲のシグナル対雑音比を評価し、一次マウスモノクローナルMeCP2抗体(クローンMec-168)とウサギポリクローナルMeCP2検出抗体(カスタムメイド)の組み合わせ内で最良のシグナル強度と最高特異性を同定します。二次抗体については、実験的に検証されたシステム特異的抗体(材料表)を用いた。
    注:表 1は、MeCP2-ECLIA の開発中に検証されたすべての抗体とその試験希釈範囲の概要を示しています。
関数名前クローン希釈
プライマリマウス、抗MeCP2メック-1681:500-1:10,000
プライマリマウス、抗MeCP24B61:250-1:4,000
プライマリマウス、抗MeCP2男性-81:500-1:4,000
プライマリマウス、抗MeCP21B111:500-1:4,000
プライマリウサギ、抗MeCP2D4F31:500-1:4,000
セカンダリウサギ、抗MeCP2ポリクローナル1:2,000-1:20,000
セカンダリウサギ、抗MeCP2ポリクローナル1:2,000-1:20,000
検出スルフォタグラベル付抗ウサギポリクローナル1:500-1:1,000

表1:抗体および使用される働き希釈剤のリスト。

  1. あるいは、従来のELISAとうまく機能するMeCP2抗体の各ペアを使用してください。

2. TAT-MeCP2融合タンパク質によるHDFの治療

注:TAT-MeCP2は、エシェリヒア・コリで組換え発現し、前に説明した8の標準的なクロマトグラフィー技術を用いて精製し、-80°Cで保存しました。

  1. プレート 1 x 106ヒト皮膚線維芽細胞 (HDF) 細胞を 100 mm 皿に入れ、5% CO2で一晩 37 °C で細胞を成長させ、約 90% の合流度に達します。
  2. TAT-MeCP2融合タンパク質のバイアルを1個取り出します。氷の上で解凍し、穏やかに混ぜます。
  3. TAT-MeCP2をHDF培養培地の50mLで500 nMの最終濃度に希釈します。
  4. 100 mmの皿から培地を取り出し、37°Cで500 nM TAT-MeCP2で細胞を24時間まで様々なインキュベーション期間にインキュベートします。
  5. TAT-MeCP2 溶液をセルから削除します。あらかじめ温められたダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)で細胞2倍を洗浄します。
  6. 37 °C10で5分間0.05%トリプシン-EDTA溶液の2 mLで細胞を治療します。
  7. 6 mLのHDF培養培地を添加してトリプシンを不活性化し、15 mLチューブ内の細胞を収集します。
  8. ペレット細胞は、室温で5分間500xgで遠g心分離して細胞をペレット化した。
  9. 上清を取り除き、氷冷DPBSで細胞2倍を洗います。ペレットを氷の上に保管し、サンプル調製に進みます。

3. サンプル準備

  1. HDFライセート
    1. スズキら11によれば細胞質および核下膜内への細胞内分画のためのREAP法を用いてMeCP2の最高タンパク質レベルを決定する。分数を実験ごとに 6 個以下のサンプルに制限します。
  2. マウスの脳のライセート
    1. 各低張性リシス試薬および抽出バッファーの 100 mL を調製します。
      1. 低張性のリシス試薬の場合は、10 mM HEPES、1.5 mM塩化マグネシウム、10 mMの塩化カリウムをよく混ぜます。
      2. 抽出バッファーの場合は、20 mM HEPES、1.5 mM 塩化マグネシウム、0.42 M 塩化ナトリウム、0.2 mM EDTA、および 25% (v/v) グリセロールをよく混ぜます。
      3. 両方のバッファーの pH を 7.9 に調整します。
      4. 1 mMジチオスレイトール(DTT)と1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを両方のバッファーに新たに加えます。使用前に氷の上で冷やします。
    2. 全マウス脳(株:C57BL/6J、野生型男性と女性、B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J、ヘミジグウス男性およびヘテロ接合雌;年齢:4〜8週齢)の全マウス脳(株:C57BL/6J)を1mLの氷冷低血圧リシス試薬で中断する。
    3. ホモジナイザーA(緩い、大きなクリアランスのために)とB(狭い、小さなクリアランスのために)の15ストロークによって、事前に冷却されたDounceオールガラス組織ホモジナイザーで脳を均質化する。
    4. 均質化した細胞をクリーンチューブに移し、4°Cで20分間10,000 x gで遠心分離機を送ります。上清を捨てる(または、さらなる使用のためにサイトプラズマ分画として保管する)。
    5. 出発原料の100mgあたり140μLの抽出バッファーでペレットを再懸濁します。チューブをあらかじめ冷却したサーモブロックに入れ、4°Cで30分間軽く混ぜます。
    6. チューブを16,000gで4°Cで10分間遠心分離します。上清(すなわち、核分率)を新しい前冷蔵チューブに移し、使用するまで-80°Cで保管します。
      注:マウス脳およびHDFに由来するライゼートのタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイによって評価することができます。

4. MeCP2-ECLIA プロトコル

  1. 洗浄液の調製、ブロッキング緩衝液およびアッセイ希釈液(1日目)
    1. 500 μLの Tween 20 ~ 1 L の PBS を加えて、PBS 溶液に 0.05% Tween 20 を準備し、激しく混ぜ合わせて「洗浄液」とラベルを付けます。
      メモ:準備したての洗浄バッファのみを使用するようにしてください。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3%ブロッカーA(材料表)のブロッキング溶液を調製します。穏やかな攪拌で混ぜ、殺菌し、最大2週間使用するまで冷蔵庫に保管します。
    3. PBSの10 mLに5mLのブロッキング溶液を加え、アッセイ希釈液(PBS中の1%ブロッカーA)を調製する。
  2. 高結合プレートのコーティング
    1. 96ウェルマルチアレイシングルスポット高バインドプレートを取り出します。
      注:高結合プレートは、結合能力が高く、疎水性表面を持つ標準プレートよりもダイナミックレンジが大きくなります。
    2. モノクローナルマウス抗MeCP2抗体を氷上で解凍し、抗体の0.67 μLを4 mLのPBS(PBSで1:6,000抗体希釈)と混合します。ボルテックス抗体溶液を良好に混合し、チューブを「コーティング溶液」としてラベル付けする。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの下隅に25 μLのコーティング溶液を慎重に分配します。これを溶液コーティング法と呼んでいます。コーティング液が各ウェルの底部を覆っていることを確認するために、両側の96ウェルプレートを軽くタップします。
    4. 粘着ホイルでプレートを密封し、一晩(12-16時間)4°Cで冷蔵庫にプレートをインキュベートします。
  3. ブロック(2日目)
    1. 冷蔵庫から皿を取り出し、ホイルを取り出します。
    2. 抗体コーティング液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップしてウェルからすべてのコーティング溶液を取り除きます。
    3. 1ウェルあたり125μLのブロッキングソリューションを追加します。プレートをもう一度シールし、軌道マイクロプレートシェーカーに置きます。
    4. 800 rpmで一定の揺れを保ち、室温で90分間プレートをインキュベートします。
  4. 標準およびサンプルの準備
    1. インキュベーションの時間中に、MeCP2および/またはTAT-MeCP2タンパク質標準および様々なサンプルを準備してください。
      注: 標準希釈に使用する Lysis バッファーは、分析されたサンプルで使用されるリシス バッファーと同じである必要があります。
    2. MePC2および/またはTAT-MeCP2タンパク質ストック溶液(250 μg/mL)、マウス脳溶解物、HDF溶解液を-80°Cから取り出します。氷の上でそれらを解凍します。
    3. 表2に従って、標準ストック溶液(MeCP2および/またはTAT-MeCP2)をクリーンチューブで希釈します。
    4. サンプルをリシスバッファーで希釈する:25μLのリシスバッファーあたり1-20 μgのマウス脳リゼート、および25μLのリシスバッファーあたり0.25-1 μgのHDFリセートを、リシスバッファーの25 μLあたりにします。各サンプルの十分な量を準備して、三重で分析を行います。
標準濃度希釈
標準 11,800 ng/mL1.08 μL 標準ストックソリューション + 148.92 μL 溶解バッファー
スタンダード2600 ng/mL50 μL 標準 1 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード3200 ng/mL50 μL 標準 2 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード466.67 ng/mL50 μL 標準 3 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード522.22 ng/mL50 μL 標準 4 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード67.41 ng/mL50 μL 標準 5 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード72.47 ng/mL50 μL 標準 6 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード80.82 ng/mL50 μL 標準 7 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード90.27 ng/mL50 μL 標準 8 + 100 μL リシスバッファー
標準 100 ng/mL150 μL のリシスバッファー

表2:0から1,800 ng/mLまでの標準シリーズ。

  1. サンプルと標準ソリューションの追加
    1. ブロック溶液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップして、すべてのブロッキング溶液を井戸から取り除きます。
    2. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    3. 単一のチャネルピペットを使用して、ウェルの下隅に25 ulの標準とサンプルを追加します。
    4. プレートを密封し、800rpmで一定の揺れを保って室温で4時間プレートをインキュベートします。
  2. 標識されていない検出抗体
    1. ポリクローナルウサギ抗MeCP2抗体を氷上で解凍します。抗体を1:6,000のアッセイ希釈液で希釈します。
    2. ゴミ箱にフリックして標準とサンプルを取り除き、ペーパータオルのプレートをタップします。
    3. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    4. マルチチャネルピペットを用いて、25 μLの非標識検出抗体を各ウェルに添加します。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。
  3. 特異的共役抗体
    1. 特定の二次抗体(材料表)を冷蔵庫から取り出し、氷の上に置きます。抗体1:666.67をアッセイ希釈液で希釈し、軽く混ぜます。
    2. 廃棄バスケットにフリックして、ラベル付けされていない無料の二次抗体を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。
    3. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    4. マルチチャネルピペットを用いて、各ウェルに25μLの特異的共役抗体(材料表)を加えます。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。
  4. プレートを読む
    1. 廃棄バスケットにフリックしてフリーコンジュゲート抗体(材料表)を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。
    2. 150 μLの洗浄液でプレート3xを洗います。
    3. 1x Trisベースのゴールド読み取りバッファー(材料表)の150 μLを加え、トリプロピルアミンを含む界面活性剤をプレートへの光生成のための共反応剤として追加します。逆ピペット技術を使用して、気泡を避けてください。
    4. プレートをマイクロプレート検出プラットフォーム(材料表)に置き、すぐに測定を開始します。96 ウェルプレート取得の設定を使用します。
    5. 電気化学発光検出システム(表)で内蔵CCDカメラで電気化学発光信号をキャプチャし、相対光ユニット(RLU)に対応し、光の強度に直接比例する信号数を記録します。
      注:電気化学的刺激の際、炭素電極に結合したルテニウムラベルは、620nmで発光光を発します。計測器付属のソフトウェア(資料一覧)を使用してデータを分析します。

結果

ECLIA システムの原理は図 1に説明されています。図2に、2 つの MeCP2 バリアントの標準曲線を示します。幅広い濃度(1-1,800 ng/mL)で正確な定量が可能でした。図3では、マウス脳およびHDFに由来するライセートのMeCP2レベルを分析した。図3Aでは、ヘテロ接合、野生型およびノックアウトマウス由来の脳核ラ?...

ディスカッション

内因性MeCP2、組換えMeCP2およびTAT-MeCP2レベルを測定するために、96ウェルプレートECLIAが開発されました。MeCP2タンパク質機能の喪失は、現在、治療が症状管理および理学療法に限定されているRTT症候群6につながることが示されている。1つの有望な治療手段は、MeCP2レベルが必要な,濃度12、13、14、15,13まで滴定することがで?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ブリジット・シュトゥルム博士がECLIAの楽器を支えてくれたことにとても感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbitMeso Scale DiagnosticsR32AB-1Antibody
Discovery workbench 4.0Meso Scale DiscoverySoftware
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)Sigma-AldrichD8537-500MLSample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTASigma-AldrichEDSExtraction Buffer
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF9665Sample preperation
GlycerolSigma-AldrichG2025Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactantMeso Scale DiagnosticsR92TGMeCP2 ECLIA protocol
HEPESSigma-AldrichH3375Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD8938Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)GFL3014MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Cell treatment
Microseal B sealBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulinSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075Antibody, Coating solution
MSD Blocker AMeso Scale DiagnosticsR93BA-4Blocker
MSD SECTOR Imager 2400Meso Scale DiagnosticsI30AA-0MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well PlateMeso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycingibco by Life Technologies15140122Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbitEurogentec S.A.custom-designedAntibody
Potassium chloride (KCl)Merck KGaA1049361000Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)Cell Signaling Technology3456S; RRID:AB_2143849Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)Sigma-Aldrich8340Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Eurogentec S.A.customAntibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Merck07-013Antibody
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)Meso Scale DiagnosticsW0015528SAntibody
TAT-MeCP2 fusion proteinin-house productionCell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)gibco by Life Technologies25200-056Cell treatment
Tween 20Sigma-AldrichP9416Washing solution

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