Un ensayo basado en electroquimioluminiscencia para variantes de proteínames MeCP2

Resumen

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.

Resumen

El ECLIA es un método versátil que es capaz de cuantificar cantidades de proteínaendógenas y recombinantes en un formato de 96 pozos. Para demostrar la eficiencia de ECLIA, este ensayo se utilizó para analizar los niveles intrínsecos de MeCP2 en el tejido cerebral del ratón y la aceptación de TAT-MeCP2 en fibroblastos dérmales humanos. El MeCP2-ECLIA produce mediciones altamente precisas y reproducibles con un error bajo de intra e interensayo. En resumen, desarrollamos un método cuantitativo para la evaluación de variantes de proteínaMeCP2 que se puede utilizar en pantallas de alto rendimiento.

Introducción

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) se basa en un proceso que utiliza etiquetas diseñadas para emitir luminiscencia cuando se estimula electroquímicamente. Es una técnica ampliamente aplicable para la detección cuantitativa de analitos biológicos en la industria básica y la investigación académica, la industria alimentaria, así como en el diagnóstico clínico¹. Comúnmente, se utiliza una placa desechable de 96 pocillos con electrodos de tinta de carbono. Estos electrodos actúan como un portador de fase sólida para el inmunoensayo. Un anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta electroquimioluminiscente y cuando se aplica electricidad al sistema, se desencadena la emisión de luz de la etiqueta química. Un dispositivo acoplado a carga de ruido ultrabajo (CCD) registra la intensidad de la luz que es directamente proporcional al antígeno enlazado al anticuerpo de captura, lo que resulta en la cuantificación del analito objetivo de la muestra². En comparación con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ECLIA se considera ventajoso, ya que ofrece una mayor sensibilidad y reproducibilidad, así como una mejor automatización y consistencia^3.

Aquí analizamos los niveles de proteína de unión metil-CpG 2 (MeCP2) en muestras de origen humano y murino, así como diferentes variantes de la proteína recombinante utilizando el sistema ECLIA recién desarrollado. MecP2 es una proteína de unión a ácido nucleico ligada al X que se sabe que interactúa con secuencias de ADN metiladas. Esta proteína ha estado implicada en la regulación de la expresión génica^4,5. Las mutaciones de pérdida de función en el gen que codifica esta proteína son los principales culpables que causan el síndrome de Rett (RTT), un trastorno grave del neurodesarrollo^6. Otro trastorno relacionado con MeCP2, el síndrome de duplicación MECP2, también conduce a síntomas neurológicos que pueden superponerse con los de RTT^7. En particular, las hembras se ven afectadas principalmente por la RTT, mientras que los machos se ven afectados en su mayoría por el síndrome de duplicación MECP2 ^6,7.

Estos trastornos se asocian con niveles insuficientes o excesivos de MeCP2 respectivamente en el sistema nervioso central (SNC). Por lo tanto, las opciones de tratamiento para la RTT que implican el aumento de los niveles de MeCP2 en el SNC tendrían que evitar los efectos perjudiciales asociados con el exceso de MeCP2⁷. Debido a este hecho, una cuantificación altamente sensible y precisa de los niveles de proteína MeCP2, según lo proporcionado por el sistema ECLIA, es crucial para el avance de la RTT, así como la investigación del síndrome de duplicación MECP2. Las mediciones precisas de los niveles endógenos y exógenos de MeCP2 a partir de líneas celulares humanas y muestras de tejido de ratón, así como una proteína recombinante que consiste en isoforma B mecp2 humana (también conocida como isoforma e1), y un dominio mínimo de transducción N-terminal VIH-TAT (TAT-MeCP2) que tiene el potencial de cruzar la barrera hemorrágucciona-cerebro^8,9 se presentan en este trabajo.

Protocolo

La aprobación para la adquisición de biopsias de piel con fines de investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación humana del Hospital de Niños en Westmead, Australia. El consentimiento para experimentos con animales se obtuvo del Ministerio Federal de Ciencia, Investigación y Economía de Austria, que se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

NOTA: El principio del sistema ECLIA se muestra en la Figura 1.

1. Selección de anticuerpos

1. Evaluar la relación señal-ruido para una gama de varios anticuerpos MeCP2 e identificar la mejor intensidad de señal y la mayor especificidad dentro de la combinación de un anticuerpo monoclonal primario MeCP2 (clon Mec-168) y un anticuerpo de detección MeCP2 policlonal de conejo (hecho a medida). Para el anticuerpo secundario, utilice un anticuerpo específico del sistema(Tabla de materiales),que también se verificó experimentalmente.
   NOTA: La Tabla 1 ofrece una visión general de todos los anticuerpos verificados durante el desarrollo de MeCP2-ECLIA y sus rangos de dilución probados.

Función	Nombre	Clon	Dilución
Primaria	Ratón, anti-MeCP2	Mec-168	1:500-1:10.000
Primaria	Ratón, anti-MeCP2	4B6	1:250-1:4,000
Primaria	Ratón, anti-MeCP2	Hombres-8	1:500-1:4.000
Primaria	Ratón, anti-MeCP2	1B11	1:500-1:4.000
Primaria	Conejo, anti-MeCP2	D4F3	1:500-1:4.000
Secundaria	Conejo, anti-MeCP2	Policlonal	1:2,000-1:20,000
Secundaria	Conejo, anti-MeCP2	Policlonal	1:2,000-1:20,000
Detección	SULFO-TAG etiquetado anticonejo	Policlonal	1:500-1:1,000

Tabla 1: Lista de anticuerpos y diluciones de trabajo usadas.

2. Alternativamente, utilice cada par de anticuerpos MeCP2 que funcione bien con ELISA convencional.

2. Tratamiento de HDF con proteína de fusión TAT-MeCP2

NOTA: TAT-MeCP2 se expresó de forma recombinante en Escherichia coli y se purificó utilizando técnicas cromatográficas estándar como se describió anteriormente⁸ y se almacenó a -80 oC.

1. Placa 1 x 10⁶ células de fibroexplosdor humano (HDF) en platos de 100 mm y crecen las células durante la noche a 37 oC con 5% co₂ hasta que alcanzan una confluencia de aproximadamente el 90%.
2. Saque un vial de proteína de fusión TAT-MeCP2. Descongelar sobre hielo y mezclar suavemente.
3. Diluir TAT-MeCP2 a una concentración final de 500 nM en 50 mL de medios de cultivo HDF.
4. Retirar el medio de los platos de 100 mm e incubar las células con 500 nM TAT-MeCP2 a 37 oC durante varios periodos de incubación de hasta 24 h.
5. Quite la solución TAT-MeCP2 de las células. Lave las células 2veces con la salina con fosfato (DPBS) precalentada de Dulbecco.
6. Tratar las células con 2 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 oC¹⁰.
7. Añadir 6 ml de medios de cultivo HDF para desactivar la trippsina y recoger las células en tubos de 15 ml.
8. Reventar las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Retire el sobrenadante y lave las células 2 veces con DPBS helado. Conservar el pellet en hielo y proceder con la preparación de la muestra.

3. Preparación de la muestra

1. Lisatos HDF
   1. Determinar los niveles más altos de proteína de MeCP2 utilizando el método REAP para el fraccionamiento subcelular en los compartimentos subcelulares citoplasmáticos y nucleares según Suzuki et al.¹¹. Limite el fraccionamiento a no más de seis muestras por experimento.
2. El cerebro del ratón se lisa
   1. Prepare 100 ml de cada reactivo de lisis hipotónica y tampón de extracción.
      1. Para el reactivo de lisis hipotónica, mezcle bien 10 mM HEPES, 1,5 mM de cloruro de magnesio y cloruro de potasio de 10 mM.
      2. Para el tampón de extracción, mezcle bien 20 mM HEPES, cloruro de magnesio de 1,5 mM, cloruro de sodio 0,42 M, 0,2 mM de EDTA y 25% (v/v) glicerol.
      3. Ajuste el pH de ambos búferes a 7.9.
      4. Añadir 1 mM de ditiothreitol (TDT) y 1 cóctel inhibidor de la proteasa a ambos tampones recién. Enfríe en hielo antes de usar.
   2. Suspenda 100 mg de cerebro total del ratón (strain: C57BL/6J, wildtype masculino y femenino y B6.129P2(C)-Mecp2^tm1.1Bird/J, hemizygous male and heterozygous female; age: 4-8 weeks old) in 1 mL of ice-cold hypotonic lyagent.
   3. Homogeneizar el cerebro con un homogeneizador de tejido de vidrio Dounce pre-enfriado por 15 golpes de homogeneizador A (flojo, para un gran aclaramiento) y B (apretado, para un pequeño aclaramiento), respectivamente.
   4. Transfiera las células homogeneizadas a un tubo limpio y centrífuga a 10.000 x g durante 20 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante (o guárdelo como fracción citoplasmapara su uso posterior).
   5. Resuspenda el pellet en 140 ml de tampón de extracción por cada 100 mg de material de partida. Colocar el tubo en un termobloque preenfriado y mezclar suavemente durante 30 minutos a 4 oC.
   6. Centrifugar el tubo a 16.000 g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante (es decir, la fracción nuclear) a un nuevo tubo preenfriado y guárdelo a -80 oC hasta su uso.
      NOTA: La concentración proteica de los licitares derivados del cerebro del ratón y los HDF puede ser evaluada por el ensayo de proteínaBCA.

4. Protocolo MeCP2-ECLIA

1. Preparación de la solución de lavado, tampón de bloqueo y solución diluyente de ensayo (día 1)
   1. Añadir 500 éL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar un 0.05% Tween 20 en solución DE PBS, mezclar vigorosamente y etiquetar como "solución de lavado".
      NOTA: Asegúrese de que solo se utilice un tampón de lavado recién preparado.
   2. Preparar una solución de bloqueo del 3% del bloqueador A(Tabla de materiales)en solución salina con fosfato (PBS). Mezclar con agitación suave, filtrar el esterilizar y mantenerlos en la nevera hasta que lo usen durante un máximo de dos semanas.
   3. Añadir 5 ml de solución de bloqueo a 10 ml de PBS para preparar la solución diluyente de ensayo (1% bloqueador A en PBS).
2. Recubrimiento de placas de alta unión
   1. Saque una placa de unión de un solo punto de un solo punto de 96 polos de pozo.
      NOTA: Las placas de unión altas tienen una mayor capacidad de unión y, por lo tanto, un rango dinámico más grande que las placas estándar con superficies hidrofóbicas.
   2. Descongelar el anticuerpo anti-MeCP2 del ratón monoclonal sobre hielo y mezclar 0,67 l del anticuerpo con 4 ml de PBS (1:6.000 dilución de anticuerpos en PBS). Vortex la solución de anticuerpos para mezclar bien y etiquetar el tubo como "solución de recubrimiento".
   3. Dispense cuidadosamente 25 l de solución de recubrimiento en la esquina inferior de cada pozo utilizando un pipeteador multicanal; esto se denomina método de recubrimiento de solución. Toque suavemente la placa de 96 pocillos en cada lado para asegurarse de que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de cada pocal.
   4. Sellar la placa con una lámina adhesiva e incubar la placa en la nevera a 4oC durante la noche (12-16 h).
3. Bloqueo (día 2)
   1. Saque el plato de la nevera y retire el papel de aluminio.
   2. Retire la solución de recubrimiento de anticuerpos golpeándola en la cesta de residuos y toque la placa en una toalla de papel para eliminar toda la solución de recubrimiento de los pozos.
   3. Añadir 125 sl de solución de bloqueo por poca. Vuelva a sellar la placa y colóquela en un agitador de microplacas orbital.
   4. Incubar la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación constante a 800 rpm.
4. Preparación de normas y muestras
   1. Durante el tiempo de incubación, preparar las normas de proteína MeCP2 y/o TAT-MeCP2 y varias muestras.
      NOTA: El tampón de lysis utilizado para la dilución estándar debe ser el mismo que el utilizado en las muestras analizadas.
   2. Sacar un vial de mePC2 y/o tAT-MeCP2 solución de material de proteína (250 g /ml), lisiamientos cerebrales de ratón y lysates HDF de -80 oC. Descongelarlos en hielo.
   3. Diluir la solución de stock estándar (MeCP2 y/o TAT-MeCP2) en tubos limpios según la Tabla 2.
   4. Diluir las muestras en el tampón de lisis de la siguiente manera: 1 a 20 g de lisato cerebral del ratón por 25 ml de tampón de lisis, y 0,25 a 1 g de lisato de HDF por 25 ml de tampón de lisis. Preparar el volumen suficiente de cada muestra para realizar análisis por triplicado.

Estándar	Concentración	Dilución
Estándar 1	1.800 ng/mL	1,08 l Solución de stock estándar + tampón de lisis de 148,92 l
Estándar 2	600 ng/mL	50 L Estándar 1 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 3	200 ng/mL	50 L Estándar 2 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 4	66.67 ng/mL	50 L Estándar 3 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 5	22.22 ng/mL	50 L Estándar 4 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 6	7.41 ng/mL	50 L Estándar 5 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 7	2.47 ng/mL	50 L Estándar 6 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 8	0.82 ng/mL	50 L Estándar 7 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 9	0.27 ng/mL	50 L Estándar 8 + 100 L Tampón de lisis
Estándar 10	0 ng/mL	Tampón de lisis de 150 l

Tabla 2: Serie estándar de 0 a 1.800 ng/mL.

5. Adición de muestras y soluciones estándar
   1. Retire la solución de bloqueo desvelándola a la cesta de residuos y toque la placa de una toalla de papel para eliminar toda la solución de bloqueo de los pozos.
   2. Lavar la placa 3x con 150 sl de solución de lavado añadiendo la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   3. Agregue 25 ul de estándares y muestras a la esquina inferior del pozo utilizando una pipeta de un solo canal.
   4. Sellar la placa e incubar la placa durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación constante a 800 rpm.
6. Anticuerpo de detección sin etiquetar
   1. Descongelar el anticuerpo anti-MeCP2 del conejo policlonal sobre hielo. Diluir el anticuerpo 1:6,000 en la solución diluyente de ensayo.
   2. Retire las normas y las muestras desvelándolas a la cesta de residuos y toque el plato en una toalla de papel.
   3. Lavar la placa 3x con 150 sl de solución de lavado añadiendo la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   4. Añadir 25 l de anticuerpo de detección sin etiquetar a cada pocedés con el pipeteador multicanal. Sellar la placa e incubarla durante 1 h con agitación constante a 800 rpm a temperatura ambiente.
7. Anticuerpo conjugado específico
   1. Saque el anticuerpo secundario específico(Tabla de Materiales)de la nevera y colóquelo sobre hielo. Diluir el anticuerpo 1:666.67 en la solución diluyente del ensayo y mezclar suavemente.
   2. Retire el anticuerpo secundario libre sin etiquetar golpeándolo en la cesta de residuos y toque la placa en una toalla de papel.
   3. Lavar la placa 3x con 150 sl de solución de lavado añadiendo la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   4. Añadir 25 l de anticuerpo conjugado específico(Tabla de materiales)a cada pocto con el pipeteador multicanal. Sellar la placa e incubar durante 1 h con agitación constante a 800 rpm a temperatura ambiente.
8. Lectura de la placa
   1. Retire el anticuerpo conjugado libre(Tabla de materiales)desvelándolo a la cesta de residuos y toque el plato en una toalla de papel.
   2. Lavar la placa 3veces con 150 ml de solución de lavado.
   3. Añadir 150 l de 1 búfer de lectura de oro a base de Tris(Tabla de materiales)con surfactante que contiene triprotilamina como co-reactante para la generación de luz a la placa. Evite las burbujas de aire mediante técnicas de pipeteo inverso.
   4. Coloque la placa en la plataforma de detección de microplacas(Tabla de materiales)e inicie la medición inmediatamente. Utilice los ajustes para la adquisición de placas de 96 pocillos.
   5. Capturar las señales de electroquimioluminiscencia por una cámara CCD incorporada en un sistema de detección de electroquimioluminiscencia (Tabla de Materiales) y registrar los recuentos de señales, que corresponden a unidades de luz relativas (RLU) y son directamente proporcionales a la intensidad de la luz.
      NOTA: Tras la estimulación electroquímica, la etiqueta de rutenio unida al electrodo de carbono emite luz de luminiscencia a 620 nm. Analice los datos con el software acompañado por el instrumento(Tabla de materiales).

Resultados

El principio del sistema ECLIA se describe en la Figura 1. Las curvas estándar para dos variantes de MeCP2 se muestran en la Figura 2. La cuantificación precisa fue posible en una amplia gama de concentraciones (1-1.800 ng/mL). En la Figura 3,se analizaron los niveles de meCP2 de lisados derivados del cerebro del ratón y los HDF. La expresión de MeCP2 en los licentos nucleares cerebrales de ratones heterocigotos, salvajes y noqu...

Discusión

Para medir los niveles endógenos de MeCP2, MeCP2 y TAT-MeCP2, se desarrolló una placa de 96 pocillos ECLIA. Se ha demostrado que la pérdida de la función proteica MeCP2 conduce al síndrome de RTT^6,para lo cual el tratamiento se limita actualmente al manejo de síntomas y terapia física. Una vía de tratamiento prometedora es la llamada terapia de reemplazo de proteínas, donde los niveles de MeCP2 se pueden valorar hasta su concentración necesaria^12,,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution