Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Resumen

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Resumen

La toma de imágenes de células beta es un paso clave hacia la comprensión del trasplante de islotes. Aunque se han desarrollado y utilizado in vivodiferentes plataformas de imágenes para el registro de la biología de células beta, están limitadas en términos de permitir la resolución de una sola célula y grabaciones longitudinales continuas. Debido a la transparencia de la córnea, la cámara anterior del ojo (ACE) en ratones es muy adecuada para estudiar la biología celular de los islotes pancreáticos humanos y de ratón. Aquí está una descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para realizar grabaciones longitudinales continuas de injerto y revascularización de injertos de islotes humanos individuales. Los injertos de islotes humanos se insertan en el ACE, utilizando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-ratones como receptores. Esto permite la investigación de la expansión de las células receptoras frente a las de los donantes y la contribución de las células receptoras en la promoción de la encapsulación y vascularización del injerto. Además, se describe un enfoque paso a paso para el análisis de imágenes y la cuantificación del volumen de los islotes o de la vasculatura segmentada y de las células receptoras que forman cápsulas de islotes.

Introducción

La diabetes mellitus describe un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la producción insuficiente de insulina por pérdida o disfunción de las células beta de islotes pancreáticos, a menudo acompañadas de resistencia a la insulina. La diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D) son enfermedades complejas en las que la disfunción progresiva de las células beta causa el desarrollo de la enfermedad. T1D se precipita por un ataque autoinmune en las células beta, mientras que T2D se considera impulsado por factores metabólicos, aunque con evidencia creciente de inflamación sistémica de bajo grado¹. El trasplante de islotes humanos donantes, particularmente a pacientes con T1D, ofrece la posibilidad de proporcionar control glucémico fisiológico. Sin embargo, la escasez de donantes de tejidos y el injerto deficiente de islotes han evitado que el trasplante de islotes se convierta en una opción terapéutica principal. Una proporción sustancial del injerto de islotes funcionales se pierde en el período inmediatamente posttrasplante (24-48 h) debido al entorno huésped hipoxico, inflamatorio e inmunogénico^2,,3. Para evaluar la eficiencia de los métodos de intervención para la mejora de la supervivencia de los islotes, es necesario un seguimiento continuo de dichos trasplantes.

Las técnicas in vivo para imaginar y rastrear el destino de los islotes pancreáticos humanos trasplantados después del trasplante siguen siendo un desafío para la investigación de la diabetes^4,,5. Hasta la fecha, las técnicas de imagen no invasiva, incluida la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética (RM) o la ecografía (EE.UU.) muestran un potencial para la cuantificación y evaluación funcional de islotes trasplantados en condiciones experimentales^5. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los islotes, las mediciones cuantitativas de esas modalidades son insuficientes. La cámara anterior del ojo (ACE) como lugar de trasplante para la observación es una solución de imagen no invasiva prometedora que ofrece una resolución espacial efectivamente más alta y un monitoreo frecuente durante largos períodos de tiempo^6. Este método ha sido explotado con éxito para estudiar la biología de los islotes de ratón (revisado en Yang et al.⁷), las respuestas inmunitarias autoinmunes⁸, así como el injerto de islote humano^9,10.

Aquí el método de trasplante de ACE se combina con un enfoque de imágenes de 2 fotones para investigar la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos mediante grabaciones continuas y repetidas en injertos de islotes individuales hasta 10 meses después del trasplante. Las propiedades de imagen multifotónica de mayores profundidades de imagen y reducción del fotoblancarido general y el daño fotográfico superan las limitaciones de imagen de la microscopía confocal¹¹. La cuantificación de imágenes fluorescentes implica varias etapas, incluyendo la preparación de muestras de islotes, el trasplante de islotes, la adquisición de imágenes, el filtrado de imágenes para eliminar el ruido o el fondo de los islotes, la segmentación, la cuantificación y el análisis de datos. El paso más difícil suele ser particionar o segmentar una imagen en varias partes o regiones. Esto podría implicar la separación de la señal del ruido de fondo, o las regiones de agrupación en clústeres de vóxeles en función de similitudes en el color o la forma para detectar y etiquetar los vóxeles de un volumen 3D que representa la vasculatura de islotes, por ejemplo. Una vez segmentadas, las estadísticas, como los tamaños de volumen de objetos, suelen ser fáciles de extraer. Se proporciona un método para la cuantificación y extracción de los datos de imágenes, como la segmentación y la visualización de datos. Se presta especial atención a la eliminación de la autofluorescencia en los islotes humanos y a la distinción entre la vasculatura del islote y la cápsula de islote que forma células receptoras.

Protocolo

El Comité Regional de ética en Lund, Suecia, aprobó el estudio de acuerdo con la Ley relativa a la revisión ética de la investigación que involucra a los seres humanos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ética sueca de los experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética de Malmá y Lund. NOD inmunodeficientes de 6 a 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. ROSA-tomate. Los ratones receptores Rag2^-/-) se utilizaron como receptores para el trasplante de islotes humanos¹⁰.

1. Preparación de islotes para trasplante

1. Cultivo de islotes humanos en CMRL 1066 complementado con 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 g/ml de gentamicina, 0,25 g/ml de fungizone, ciproxfloxacino de 20 g/ml, nicotinamida de 10 mM (NIC) y suero humano 10% inactivado por calor a 37 oC en 5% co₂ y aire humidificado hasta el trasplante, como se ha descrito anteriormente¹².
   NOTA: Los islotes deben estar libres de tejido exocrino y no tocarse entre sí en el cultivo. Los tejidos exocrinos parecen translúcidos.
2. El día del trasplante, transfiera los medios de cultivo que contienen los islotes a un nuevo plato de Petri utilizando un conjunto de tubos de aspirador conectado a un capilar de vidrio tirado.
   NOTA: Alternativamente, utilice una pipeta de 200 l. Colorear la parte posterior de la placa Petri ayuda a que los islotes sean más fácilmente distinguibles bajo el microscopio estéreo.
3. Usando un microscopio estéreo, escoge 20–40 islotes por trasplante y transfiéralos a un tubo de 1,5 ml. Llene el tubo hasta la parte superior con medios de cultivo de la incubadora.
4. Sellar los tubos con película de parafina y almacenar sobre hielo hasta el trasplante. Preparar una cantidad adecuada para el número de trasplantes realizados.
5. Alternativamente, asegúrese de que una incubadora de_CO2 esté disponible en la sala de cirugía para mantener los islotes en el cultivo y recogerlos inmediatamente antes de cada trasplante.

2. Preparación de equipos de trasplante y mesa de cirugía

NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben ser autoclavadas, y la mesa de cirugía y los instrumentos desinfectados con 70% de alcohol.

1. Conecte un soporte de cabeza estereotaxico a la anestesia a través de una máscara nasal y encienda la almohadilla de calentamiento.
2. Conecte una jeringa hermética de Hamilton a tubos de polietileno y una cánula de ojo final contundente.
   NOTA: Se recomienda llenar todas las piezas con PBS antes del montaje. Compruebe si hay burbujas de aire atrapadas y retírela si está presente.
3. Fije firmemente la jeringa de Hamilton a la mesa(Figura 1a)o a una base móvil (Figura 1e) y conecte el tubo al microscopio estéreo, con la cánula colgando hacia abajo (es decir, posición de espera).
   NOTA: Utilice cinta quirúrgica, ya que es fácil de quitar y volver a colocar.
4. Prepare una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 30 G llena de 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina.
5. Prepare una jeringa con PBS estéril. Alternativamente, utilice una pipeta.
6. Deje a un lado una jaula de despertador limpia con lámpara de calefacción.

3. Anestesia y posicionamiento de ratones receptores para la cirugía

NOTA: Todos los animales fueron criados y mantenidos en un ambiente libre de patógenos en las instalaciones de animales de la Universidad de Lund.

1. Anestfetar el ratón en una cámara llena de 40% O₂/60% N₂/3% isoflurano y transferir el ratón anestesiado a la plataforma del soporte de la cabeza en una almohadilla de calentamiento caliente (Figura 1a). Compruebe la falta de reflejos de pedal.
   NOTA: La anestesia isoflurano es el método preferido de anestesia para una rápida recuperación después de la cirugía. La sala del microscopio debe estar adecuadamente ventilada para utilizar isoflurano.
2. Coloque el hocico del ratón en la mascarilla de anestesia conectada a 40% O₂/60% N₂/0.9%–1.5% máquina de anestesia isoflurano. Utilice el pulgar y el dedo para levantar ligeramente la cabeza y fijarla con las piezas metálicas en los lados. Asegúrese de que los auriculares fijan la cabeza directamente debajo de las orejas. Inyectar 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina por vía subcutánea en la parte posterior del ratón.
   NOTA: La buprenorfina se utiliza como analgésico.
3. Incline la cabeza de modo que el ojo a operar esté mirando hacia arriba y esté cerca del investigador.
4. Retraiga suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados usando fórceps contundentes, saque el ojo y fíjelos libremente con un par de pinzas. Asegúrese de que las puntas de las pinzas estén cubiertas con un tubo de polietileno unido a la plataforma del soporte del cabezal(Figura 1a, inserto).
5. Mantenga siempre ambos ojos húmedos aplicando una gota de PBS estéril en el ojo.
6. Transfiera los islotes humanos del tubo sellado de 1,5 ml (sección 1) a una placa Petri con PBS estéril y asegúrese de que los islotes estén cerca uno del otro para minimizar la cantidad de medios de cultivo celular transferidos (Figura 1c).
7. Recoger los islotes de 20 a 30 en la cánula ocular conectados a través de tubos de polietileno a la jeringa de Hamilton.
   NOTA: Tome el menor líquido posible con los islotes.
8. Cuelgue el tubo boca abajo y adjúntelo al microscopio estéreo(Figura 1d). Pegue el tubo cuidadosamente para dejar que los islotes se hundan hasta el extremo del tubo hacia la cánula.

4. Procedimiento de trasplante

NOTA: Este método ha sido descrito previamente para el trasplante de islotes de^{ratón 6}. Aquí se presenta un procedimiento ligeramente modificado.

1. Pellizca las almohadillas en las patas traseras para asegurarte de que el ratón esté dormido.
2. Apriete los fórceps que sujetan el ojo sin interrumpir el flujo sanguíneo y aplique una gota de PBS estéril en el ojo.
3. Usando una aguja de 25 G como bisturí, biselar hacia arriba, penetrar cuidadosamente sólo la mitad de la punta en la córnea y hacer una sola incisión lateral. Hacer el agujero en un ángulo hacia arriba; el orificio se sellará más fácilmente después del trasplante(Figura 1f).
4. Levante cuidadosamente la córnea con la cánula precargada con islotes y aplique lentamente islotes en el ojo. Evite la inserción de la cánula en la cámara anterior para evitar daños en el iris, sino más bien empuje cuidadosamente contra la abertura corneal (Figura 1g).  Retraiga lentamente la cánula de la ACE.
   NOTA: Apunte a un volumen de inyección de 3-8 l. Si el volumen es demasiado grande, expondrá el ojo a una presión intraocular innecesariamente alta y puede provocar reflujo de los islotes inyectados fuera de la cámara anterior.
5. Cuando se enfrentan a dificultades con la inserción de los islotes debido al aumento de la presión en la cámara ocular, agrande el sitio de la incisión reforzando el sitio de la incisión lateral y volver a aplicar los islotes.
   NOTA: Ocasionalmente, las burbujas de aire introducidas se pueden utilizar como soportes de espacio.
6. Aplique gel para los ojos en el ojo, afloje los fórceps que sujetan los ojos y deje al ratón en isoflurano en la misma posición durante 8-10 minutos para dejar que los islotes se ajusten.
7. Retire los fórceps que sostienen el párpado y vuelva a colocar el párpado en su posición normal.
8. Retire el ratón del soporte de la cabeza y transfiéralo a una jaula de activación.
9. Cuando el ratón esté despierto y en movimiento, transfiételo de vuelta a la jaula original y manténgalo en la carcasa del animal hasta que se escanee (se recomiendan al menos 5 días).

5. Imágenes de islotes humanos implantados por microscopía de 2 fotones

NOTA: Se recomienda tomar imágenes generales del ojo con un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 2a–c) 4-5 días después del trasplante antes del trasplante antes de la toma de imágenes de 2 fotones para localizar los islotes de interés. Evite sujetar el ojo demasiado apretado tan temprano después del trasplante. Utilice imágenes de 2 fotones de 6 a 7 días después de la posttrasplante.

1. Inicie el software de adquisición de imágenes (consulte Tabla de materiales). En el menú"Láser"activar el láser Mai Tai (Power "ON") y en el menú "Light Path" establecer la longitud de onda a 900 nm y aplicar una potencia láser de transmisión mínima a partir de 5%–10% de potencia láser (utilice deslizadores).
   NOTA: Durante el escaneo, ajuste la potencia del láser según sea necesario.
2. Establezca canales verdes, naranjas y rojos. Recoger la luz de emisión simultáneamente en tres detectores no enlatados (NDD) utilizando un espejo dicrónico (LBF 760) e información del filtro de emisión de la siguiente manera: Rojo/Angiosense 680, 690–730 nm; Verde/Autofluorescencia, 500–550 nm; y Naranja/Tomate, 565–610nm(Figura 2d).
3. Coloque la etapa del soporte de la cabeza en la etapa motorizada del microscopio y conecte la máscara de gas al tubo de la máquina de anestesia y el tubo conectado al sistema de ventilación. Encienda la almohadilla de calefacción.
4. Anestesiar el ratón receptor, transferir a la plataforma del soporte de la cabeza, restringir el ojo para la toma de imágenes y administrar la solución de buprenorfina como se describió anteriormente (pasos 3.1–3.5).
5. Ajuste los vapores de isoflurano según sea necesario. Una frecuencia de respiración de 55 a 65 respiraciones por minuto (bpm) indica una anestesia óptima. Si la anestesia es demasiado profunda, la tasa será de <50 ppm con respiración intensa o jadeo; si es demasiado ligero, la velocidad será de >70 ppm con respiración superficial. Supervise cuidadosamente los ratones durante la anestesia mediante inspección visual cada 15 min.
   NOTA: La anestesia varía de ratón a ratón, entre las cepas del ratón, y a medida que avanza el tiempo bajo anestesia¹³.
6. Administrar suficiente gel para los ojos en el ojo como líquido de inmersión entre la córnea y la lente, lo que le permite acumular lentamente(Figura 2f, insertar). Evite las burbujas de aire.
   NOTA: Se recomienda la iluminación lateral con una lámpara de manguera metálica flexible para ajustar el enfoque y localizar los injertos de islotes.
7. Para visualizar los vasos sanguíneos, administre 100 l del agente de imágenes (p. ej., Angiosense 680) por vía intravenosa en la vena de la cola utilizando una jeringa desechable de insulina de 30 G.
8. En elmodo de adquisición" ajuste el tamaño del fotograma a 512 x 512 y la velocidad de escaneo.
   NOTA: Los escaneos más lentos (es decir, el aumento del tiempo de permanencia) mejorarán la relación señal-ruido.
9. En el menú"Canales"ajuste ganancia maestra para cada PMT en Voltios para amplificar la señal hasta que se vea una imagen en la pantalla en el modo de escaneo en vivo. Cuanto mayor sea este valor, más sensible será el detector a la señal y al ruido.
   NOTA: Preferiblemente, mantenga valores entre 500 y 800 V.
10. En el menú "Z-stack" defina el principio y el final de la pila z moviendo manualmente el foco a la parte superior del injerto de islote. Guardar posición seleccionando "Establecer primero". Muévase al último plano inferior que se puede enfocar en el injerto de islote y guarde la posición seleccionando"Establecer último". Utilice un tamaño de paso z de 2 m.
11. Recopile la pila de imágenes final haciendo clic en la pestaña"Iniciar experimento"y guárdelo como archivo CZI de 8 bits (es decir, formato Carl Zeiss).

6. Imágenes de islotes humanos implantados por microscopía confocal

NOTA: El volumen total, la morfología y la plasticidad de los islotes trasplantados se pueden evaluar mediante el seguimiento de la señal de dispersión in vivo en una exploración separada (es decir, pista separada) mediante la detección de la luz de retrobatería láser¹⁰.

1. Saque el divisor de haz principal (es decir, filtro LBF) y en el cuadro de diálogo"Ruta de luz"configure una pista independiente para la imagen confocal. Elija el láser Argon con longitud de onda de 633 nm y la detección en la misma longitud de onda que la luz láser. Las pilas Z se adquieren con un tamaño de paso de 2-3 m para la señal de luz de retrobatería.
2. Reajuste la configuración de la pila z para asegurarse de grabar todo el islote (consulte el paso 5.10).
3. Adquiera la pila de imágenes y guárdela como archivo CZI de 8 bits.

7. Análisis de imagen

NOTA: Para este paso se utilizó software comercial (consulte Tabla de materiales).

1. Extracción de la autofluorescencia de islotes (Figura 3b)
   1. En la pestaña "Procesamiento de imágenes"elija "Aritmética de canal" y escriba "ch1-ch2". Esto crea un nuevo canal 4 (ch 4); renombrar como "Vasculature".
      NOTA: El canal verde/autofluorescencia se resta del canal Rojo/Angiosense.
   2. Repita el paso anterior y escriba "ch3-ch2" para crear un nuevo canal (ch 5); renombrar como"Tomate (todo)".
      NOTA: El canal Verde/Autofluorescencia se resta del canal Naranja/Tomate.
2. Definición de la máscara de islote mediante dibujo manual (Figura 3c)
   1. Cree una nueva superficie (símbolo azul) y en el asistente elija "Editar manualmente". Mantenga el puntero en el modo"Seleccionar"y en la vista 3D haga clic en "Volumen" (en Escena)para visualizar las secciones.
   2. Para facilitar la discriminación fronteriza de los islotes, active todos los canales, incluido el ch 1–ch 3.
      NOTA: El canal naranja/tomate es útil para definir los bordes de los islotes mediante la señal de la cápsula de tomate. Alternativamente, aumente las intensidades del canal para utilizar la autofluorescencia del islote multicanal y la señal de fondo del detector como guía.
   3. En la pestaña "Dibujo"elija "Contorno"y haga clic en "Dibujar"para empezar a dibujar contornos alrededor del borde del islote comenzando en la posición de corte 1.
   4. Muévase a una nueva posición de corte y repita los contornos de dibujo. Termine con el último corte en la parte superior del islote y termine haciendo clic en la pestaña"Crear superficie". Por lo general, es suficiente para^th dibujar contornos cada 10a rebanada.
3. Segmentación de"Vasculatura de islote"y "Tomate de islote" fluorescencia utilizando máscara de islote ( Figura3d).
   1. Elija el objeto"Máscara de islot"previamente definido, vaya a la pestaña de edición (símbolode lápiz) y haga clic en la pestaña"Máscarar todo",que abre una nueva ventana.
   2. Elija el canal previamente nombrado "Vasculature" (ch 4) en el menú desplegable de selección de canales y active las opciones "Duplicar canal antes de aplicar la máscara", " Constanteinterior/fuera",y establezca voxels fuera de la superficie en "0.000", lo que crea un nuevo canal; renombrar como"Vasculatura de islote"(ch 6).
   3. Repita los pasos 7.3.1 y 7.3.2 y elija el canal creado anteriormente "Tomate (todo)" (ch 5) en el menú desplegable de selección de canales para crear el nuevo canal; renombrar como"Tomate de islote"(ch 7).
4. Renderizado superficial de vasculatura de islotes (Figura 3e)
   1. Cree una nueva superficie en el menú "Escena" y en el asistente elija "Creación automática".
   2. Establezca el canal de origen en"Vasculatura de islot"(ch 6) y elija la resta de fondo. La estimación automática del umbral se puede ajustar si es necesario. Compare con el canal de fluorescencia que responde (por ejemplo, mezclando la pestaña de superficie recién creada). Continúe con el asistente.
   3. Opcionalmente, utilice filtros. Por ejemplo, elija "Volumen"y ajuste el filtro (amarillo) en la ventana, que puede eliminar los objetos de superficie seleccionados. Finalice el asistente y asigne al nuevo objeto de superficie el nombre"Islet vasculature".
5. Segmentación de "Vasculatura de tomate de islote" señal de fluorescencia ( Figura3f)
   1. En el objeto de superficie"Islet vasculature" creado anteriormente, vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña"Máscara todo",que abre una nueva ventana.
   2. Elija el canal previamente nombrado "Islet tomate" (ch 7) en el menú desplegable de selección de canales y establezca los vóxeles fuera de la superficie en "10.000", que crea el nuevo canal; renombrar como"Vasculatura de tomate de islote"(ch 8).
6. Segmentación de " Cápsula detomate" señal de fluorescencia (Figura 3g)
   1. Elija "Channel Arithmetic's" en la pestaña "Image processing" y escriba "ch7-ch8", creando el nuevo canal; renombrar como"Cápsula de tomate"(ch 9).
      NOTA: La señal de fluorescencia de"vasculaturade tomate de islote" se resta de la señal de fluorescencia total"Tomate islote".
7. Representación superficial de"Vasculaturade tomate de islote" y "Cápsula de tomate" ( Figura3h)
   1. Siga el paso 7.4, y en el asistente elija los canales de origen "Vasculatura de tomate de islote" (ch 8) o "Cápsula de tomate" (ch 9) para crear nuevos objetos de superficie en consecuencia.
8. Representación superficial de la superficie total del islote (Figura 3i)
   1. Abra el archivo de retrocayador de islotes y cree una nueva superficie.
   2. En el asistente, elija "Creación automática" y defina " Regiónde interés".
      NOTA:"Región de interés"se utiliza para separar las señales de múltiples islotes y para definir la profundidad del islote a analizar (por ejemplo, 75 m superior).
   3. En"Intensidad absoluta"ajuste el umbral si es necesario. El objeto de superficie se puede hacer clic en o desactivar para realizar una comprobación cruzada con la intensidad de canal correspondiente. Cierre el asistente.
9. Cuantificación (Figura 3j)
   1. Seleccione un objeto de superficie creado en el menú "Escena" y vaya a la pestaña "Estadísticas".
   2. Para recuperar datos de volumen detallados en el objeto de superficie seleccionado, elija la pestaña "Detallado"y seleccione "Valores específicos"y "Volumen"en el menú desplegable. Para recuperar un valor de volumen total del objeto de superficie seleccionado, vaya a la pestaña "Detallado" y elija "Valores medios".

Resultados

Los islotes humanos no etiquetados fueron trasplantados a la ACE de la NOD femenina de 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. ROSA-tomate. Ratonesreceptores^{Rag2 .} Para prevenir el rechazo del tejido humano, se eligieron ratones noqueadores Rag2 inmunodeficientes como receptores. En estos ratones transgénicos, todas las células y tejidos expresaron una proteína de fluorescencia de tomate (mT) dirigida a la membrana que permite ...

Discusión

Se presenta un método para estudiar el proceso de injerto de células de islotes pancreáticos humanos observando la participación del tejido receptor y donante. Después de una cirugía mínima invasiva que implanta islotes humanos en la cámara anterior de un ojo de ratón inmunodeficient, el ratón se recupera rápidamente en cuestión de minutos después de la cirugía. El procedimiento se realiza en un ojo. Generalmente, de 5 a 7 días después de la posimplantación en adelante, la córnea está lo suficientement...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400	Agnthos	8323001	used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L	Agnthos	8329002	connect via tubing to U-400
-gas routing switch	Agnthos	8433005	connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies	Sigma	A5177-5EA	connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml	Schering-Plough Europé	64022	fluid, for pain relief
Capillary pipettes	VWR	321242C	used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa	Invitrogen	D1830	imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G	BVI Visitec/BD	BD585107	custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel	Novartis		Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT	Hamilton	81242	Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter	Narishige	SG-4N-S	assemled onto metal plate
-gas mask	Narishige	GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight	Agnthos	0207-5TI-PS or 0208-5-PS	attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made			taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		cell culture media for human islets
-HEPES	GIBCO BRL
-L-glutamin	GIBCO BRL
-Gentamycin	GIBCO BRL
-Fungizone	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	Bayer healthcare AG
-Nicotinamide	Sigma
Image analysis software	Bitplane		Imaris 9
Image Aquisition software	Zeiss		ZEN 2010
Infrared lamp	VWR	1010364937	used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo	Abott Scandinavia/Apotek		fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange	BD	10442204	used as scalpel
Petri dishes, 90mm	VWR	391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope	Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami	Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0	Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680)	Chroma	288003
-ET645/65m-2p (TR)	Chroma	NC528423
-ET525/50 (GFP)	Chroma
-ET610/75 (tomato)	Chroma
-main beam splitter T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)	Smiths Medical Danmark	800/100/120	to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope	Nikon		Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence)			for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom	Nikon		wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x	Nikon
-AZ Plan Apo 4x	Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp	Nikon
-HG Manual New Intensilight	Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)	Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix	Braun	9161406V	for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape	3M