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要約

リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。リンパ浮腫の慢性マウステールモデルと、尾部への遺伝的貨物輸送のための組織ナノトランスフェクション技術(TNT)の新しい使用について述べています。

要約

リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。影響を受けた四肢は、体液、脂肪、線維症の蓄積のために拡大する。この病気の治療法はありません。尾のベース付近での皮膚の焦点全体の切除を用いたマウステールモデルは、尾の腫脹をもたらし、リンパ浮腫を研究するために使用されてきた。しかし、このモデルは、血管を含み、結果的に尾壊死および早期の尾の腫脹分解能をもたらし、その臨床的翻訳性を制限する。慢性マウス尾リンパ浮腫モデルは、15週間にわたって持続的なリンパ浮腫と尾部への信頼性の高い灌流を誘発する。従来のマウス尾リンパ浮腫モデルの強化には、1)外科顕微鏡を用いた正確な全厚切除およびリンパ切開、2)高分解能レーザースペックルを用いた術後動脈および静脈灌流の確認、および3)インドシアニングリーン近赤外レーザーリンパ管造影を用いた機能評価が含まれる。また、新しい非ウイルス、経皮的、マウス尾脈管構造への遺伝的貨物の焦点送達のために組織ナノトランスフェクション技術(TNT)を使用しています。

概要

リンパ浮腫はリンパ機能障害によって引き起こされる四肢腫脹である。影響を受けた四肢は、体液、脂肪、線維症の蓄積のために拡大する。リンパ浮腫は、世界中で2億5000万人の人々に影響を与えます2,3,4.乳癌、黒色腫、婦人科/泌尿器腫瘍、肉腫などの固形悪性腫瘍の治療を受ける患者の20〜40%がリンパ浮腫2、4、5を発症すると推定される。リンパ浮腫による罹患率は、再発性感染、疼痛、および変形6を含む。この進行性の生涯にわたる病気の治療法はありません。現在の治療法はvariaby有効7であり、理学療法士による完全な鬱血療法、切除処置、および血管導入リンパ節移移およびリンパバイパス7、8、9、10、11、12、13、14を含む微小手術を含む。リンパ浮腫の理想的な治療法はまだ発見されていません。

リンパ浮腫のメカニズムと治療の研究は限られています。リンパ傷害15、16の後に1年の平均遅延発症があり、放射線および手術で気球原性侮辱を経験するほとんどの個人はリンパ浮腫4、6、17を発症しない。イヌ、ヒツジ、ブタなどの大型動物モデルは18、19、20と記載されていますが、マウステールモデルは容易さ、コスト、再現性のために最も広く適用されています。リンパ浮腫を調査するためのマウスモデルは、尾型モデル、ジプテリア毒素媒介性リンパ切除、腋窩または亜素リンパ節解剖21、22、23、24、25、26を含む。ほとんどのテールモデルは、尾部22の基部付近で行われるリンパ管切り抜きを伴う焦点的な完全な皮膚切除を使用し、ヒトリンパ浮腫24、27、28、29に似た尾の腫脹および組織学的特徴をもたらす。しかし、標準的なマウステールモデルは、通常、わずか20日で自発的に解決し、周期的尾壊死30を伴う。リンパ浮腫マウスの尾モデルは、15週間を超えて持続的なリンパ浮腫を拡張し、確認された動脈および静脈開存を示し、機能的リンパ機能障害評価を可能にする。

リンパ浮腫のマウステールモデルは、リンパ浮腫を治療するための新しい治療法の評価を可能にする。遺伝子ベースの戦略は、ウイルスベクター31、32によって媒介されるマウスモデルにおいて使用されてきた。また、新しい組織ナノトランスフェクション技術(TNT)を用いて、リンパ浮腫マウス尾部への遺伝貨物輸送にも使用しています。TNTは急速に焦点を合った電界33、34、35、36のナノチャネルを備えたチップを使用して、直接的な、経皮的な遺伝子の送達を促進する。このモデルは、マウス尾部35のリンパ損傷部位への潜在的な遺伝子ベースの治療薬の焦点遺伝子送達を可能にするTNT2.0を用いることを含む。

プロトコル

このプロトコルは、施設の動物研究倫理委員会のガイドラインに従っています。すべての動物実験は、インディアナ大学医学部の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました。動物は、食べ物と水のアドリビタムと12時間の明暗サイクルの下で収容されました。

1. マウスの尾リンパ球の外科的破壊

  1. 男女分布の8週齢のC57BL/6マウスを使用してください。
  2. 100%酸素中の3-4%のイオブルランを有する誘導室の全身麻酔下にマウスを置き、その後、処置中に1〜3%で維持沈下した。
  3. 0.5 mg/kg 持続放出(SR)ブプレノルフィンを皮下に投与して疼痛制御を行う。
    注: ポストオペで投与された追加の鎮痛薬: Carprofen 1回 24 時間ごとに少なくとも 48 時間とブピバカインは、切開が行われた後、または切開を閉じる前に一度, 皮膚の端に滴下することによって適用されます (4 – 6 時間まで続きます).
  4. マウスをドーサリーに置き、70%イソプロピルアルコールで尾を準備します。
  5. キャリパーを使用して、尾部のベースから20mmから始まる5mm増分で手順の前に尾の直径を測定します。これらの測定値は、切り捨てられたコーン方程式37を使用して体積を計算するために使用されます。
  6. ベースから尾部20mmに3mmの円周切除をマークします。
  7. 滅菌外科用ブレード(サイズ15)で細心の3mmの完全な皮膚切除を行い、外科顕微鏡的拡大の下で基礎となるすべての血管構造をそのまま残します。上周マーク(尾部ベースから20mm)を最初に真皮を通し、最初の切開に対して3mmの周縁部の完全な厚さの切開を行います。
    1. 垂直な完全な厚さの垂直切開を行い、2つの切開を接続します。歯付きの細かいピックアップを使用して先端をつかみ、マイクロシザーを使用して、真皮に対する血管面内の深部を慎重に解剖し、静脈の冒険に表面化します。
  8. 0.1 mLのイソスルファンブルー(1%)を尾部の先端に皮下近位に注入する。
  9. 手術顕微鏡下で横尾静脈に隣接する2つのリンパ管を特定します。イソスルファン注射のためリンパ球は青色に見えます。まっすぐなマイクロ外科用ハサミを使用してリンパ球をトランスフェクトする。はさみを使用して、横静脈とリンパ管の間の平面を慎重に解剖します。次に、リンパ管と横静脈の間に1つのはさみ刃の先端を渡し、刃を閉じてリンパ管を移す。
  10. 無菌付着透明なドレッシングで尾の傷をドレスアップ。毎日、感染や出血を防ぐために、op後の切開をチェックし、2週間の創傷ケアを提供します。
  11. 動物を1人で収容して、尾にこれ以上の怪我を防ぎ、動物がお互いに噛み合うことを防ぎ、外科的合併症につながる。

2. レーザースペックルコントラストイメージングによる尾血管評価

  1. ステップ 1.2 のようにマウスを麻酔します。
  2. レーザースペックルコントラストイメージングを使用して尾部血管を可視化するには、幅を0.8cm、高さを1.8cmに、点密度を高く、フレームレートを44枚の画像/秒、時間を30秒に、カラー写真を1秒あたり1に設定します。
  3. 静脈および動脈灌流を評価して、開血を評価する。定性的に、流れの連続性を視覚化する必要があります。

3. 近赤外レーザー血管造影による機能性リンパ解析

  1. ステップ 1.2 のように動物を麻酔する
  2. インドシアニングリーン(ICG)(25mg/10 mL)を再構成し、先端付近の遠位マウス尾部に皮下0.1mLを投与する。
  3. 部屋の明かりを暗くする。近赤外線レーザー血管造影をバッファリング設定に入れ、その後ライブキャプチャを行います。

4. TNTを用いたマウス尾への核酸貨物のフォーカルデリバリー

  1. ステップ1.2のように動物を麻酔します。
  2. 局所皮膚剥離クリームを使用してマウスの尾を剥離します。
  3. マウスの尾をコラゲターゼ溶液(10mg/mL)に37°Cで5分間浸します。
  4. TNT2.0 チップリザーバ35に DNA をロードします。
  5. TNT2.0 シリコーンチップデバイスを、尾部に接触するナノニードルで尾部に所望の送達部位を置きます。
  6. 正の電気プローブを貯留槽に入れる。負のプローブを30G針に取り付け、針を皮下に尾に入れ、配達現場に挿入します。
  7. 矩波パルス電気刺激(10 x 10 msパルス、250 V、10 mA)を適用します。

結果

持続的なリンパ浮腫のマウス尾モデルの技術を 図1に示す。この図は、マウスの尾型モデルの関連する解剖学を示しています。 図2 は、リンパ浮腫誘導後のマウス尾部における進行性の腫脹および持続性持続性リンパ浮腫を示す。マウスの尾部の体積は、切り捨てられたコーン方程式で計算されるように、第4週でピークを?...

ディスカッション

リンパ浮腫は、原発(先天性)または二次(気中原性リンパ)傷害38、39に分類される。二次リンパ浮腫は、症例の99%を含む39.二次リンパ浮腫は、最も一般的に感染(フィラリア症)またはリンパ節切術または放射線による事後の治療によって引き起こされる4,39.翻訳動物モデルは、リンパ12次16>?...

開示事項

著者らは競合する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、米国形成外科医学術奨学金協会と国防総省W81XWH2110135がAHHに提供する助成金によって支えられた   。美容外科教育研究財団は、CKSに対して、MS. NIH U01DK119099、R01NS042617およびR01DK125835に助成金を与えます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tegaderm Film1626W
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

参考文献

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