Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

Riepilogo

Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.

Abstract

La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l'equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell'udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L'indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all'orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell'imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l'approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.

Introduzione

La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva¹. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell'orecchio interno, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'idrope dell'orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualizzazione del CoBF intravitale consentirà una migliore comprensione dei legami tra funzione uditiva e patologia vascolare cocleare.

Sebbene la complessità e la posizione della coclea all'interno dell'osso temporale precludano la visualizzazione diretta e la misurazione del CoBF, sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione del CoBF tra cui la flussimetria laser-doppler (LDF)10,11,12, la risonanza magnetica (MRI)13, la microscopia intravitale a fluorescenza (FIVM)¹⁴, la microendoscopia a fluorescenza (FME)15^, l'imaging endoscopico a contrasto laser speckle (LSCI)¹⁶ , e approcci basati sull'iniezione di marcatori marcati e microsfere marcate radioattivamente nel flusso sanguigno (microangiografia ottica, OMAG)^17,18,19,20. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha consentito il monitoraggio assoluto in tempo reale delle variazioni del CoBF in vivo, ad eccezione di FIVM. FIVM, in combinazione con una finestra del vaso nella parete cocleare laterale, è un approccio che è stato utilizzato e validato in cavie in diverse condizioni sperimentali da vari laboratori 14,21,22.

È stato stabilito con successo un metodo FIVM per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nella microcircolazione cocleare nel topo utilizzando isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano come mezzo di contrasto e un colorante di fluorescenza - DiO (3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato, verde) o Dil (1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato, rosso) - per premarcare le cellule del sangue, visualizzare i vasi e monitorare la velocità del flusso sanguigno. Nel presente studio, il protocollo di questo metodo è stato descritto per l'imaging e la quantificazione dei cambiamenti nel CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche (come dopo l'esposizione al rumore). Questa tecnica fornisce al ricercatore gli strumenti necessari per studiare i meccanismi alla base del CoBF correlati alla disfunzione uditiva e alla patologia nella stria vascolare, specialmente se applicata in combinazione con modelli murini transgenici prontamente disponibili.

Protocollo

NOTA: Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oregon Health & Science University (numero di approvazione IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza

1. Anestetizzare i topi donatori (topi maschi C57BL/6J di età ~6 settimane) con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di soluzione anestetica ketamina/xilazina (5 ml/kg, vedere la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Questo protocollo di anestesia è molto affidabile e mantiene la pressione sanguigna sistemica.
2. Appoggiare il mouse sulla schiena, aprire la pelle ed esporre la cavità toracica usando pinzette e forbici da dissezione. Tagliare il diaframma, afferrare alla base dello sterno usando le forbici a morsetto, tagliare la gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Raccogliere 1 mL di sangue nell'eparina (15 UI/mL di sangue) mediante puntura cardiaca e centrifugare a 3.000 × g per 3 minuti a 4 °C. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale dopo la raccolta del sangue.
3. Rimuovere il plasma, lavare il pellet delle cellule del sangue con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C.
4. Etichettare le cellule del sangue con 1 mL di 20 mM DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente^23,24.
5. Centrifugare e lavare le cellule del sangue marcate con 1 mL di PBS, centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con ~0,9 mL di PBS (volume finale ~1,3 mL) prima dell'iniezione.

2. Intervento chirurgico per creare una finestra aperta ²⁵

1. Preparare gli strumenti chirurgici sterili e la piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo (Figura 1A). Anestetizzare i topi (topi maschi C57BL / 6J di età ~ 6 settimane) come descritto al punto 1.1 e controllare la profondità dell'anestesia monitorando il riflesso della zampa e il tono muscolare generale. Posizionare l'animale sul termoforo caldo e mantenere la temperatura rettale a 37 °C.
2. Posizionare la coda dell'animale nel sistema di monitoraggio CODATM per monitorare la pressione sanguigna e il battito cardiaco (vedere la tabella dei materiali). Registrare la pressione arteriosa sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media (MBP) nella condizione anestetizzata.
   NOTA: Nessuna differenza è osservata nella MBP animale nello stato anestetizzato e non anestetizzato (107 ± 11 mmHg vs 97 ± 7 mmHg). La frequenza cardiaca animale è stabile sotto anestesia, anche se inferiore (ancora entro il range di normalità) rispetto alla condizione non anestetizzata (357 ± 12 bmp vs 709 ± 3 bmp). Un leggero aumento del battito cardiaco dovrebbe essere previsto negli animali posti in contenzione²⁶.
3. Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e ventrale al microscopio stereoscopico (vedi la Tabella dei Materiali), lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini²¹.
   1. Fare un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata e posizionata per ridurre al minimo il movimento (Figura 1B). Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare.
      NOTA: iniettare per via sottocutanea buprenorfina a 0,05 mg/kg per ridurre il dolore durante l'intervento chirurgico.
   2. Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla.
   3. Aprire la bolla ossea con un ago da 30 G e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara della coclea e dell'arteria stapediale, con il margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e scorre anteriore-superiore verso la finestra ovale (Figura 1C, D).
      NOTA: La tracheotomia viene eseguita per mantenere le vie aeree libere e deve essere eseguita solo quando l'animale ha un problema respiratorio durante l'intervento chirurgico. In generale, la maggior parte degli animali sotto anestesia ha una respirazione regolare. Tuttavia, se gli animali hanno ricevuto una tracheotomia durante l'intervento chirurgico, il flusso sanguigno registrato non deve essere utilizzato per alcun confronto.
4. Utilizzare una piccola lama di coltello (bisturi #16 fresato su misura) per raschiare l'osso della parete laterale all'apice-giro medio della coclea del topo, a circa 1,25 mm dall'apice fino a quando non si rompe un punto sottile. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici (Figura 1E).
5. Coprire la finestra della nave con un coprislip tagliato per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave.
   NOTA: tutte le procedure devono essere eseguite con cautela. Oltre a monitorare la temperatura corporea, anche i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.

3. Imaging di CoBF sotto FIVM

1. Fare un'incisione di ~ 1 cm lungo la vena safena destra per esporre il vaso (Figura 1F).
2. Infondere successivamente nell'animale 100 μL della soluzione di destrano FITC (2000 kDa, 40 mg/mL in PBS) e 100 μL di sospensione di cellule del sangue (ematocrito al 30%) attraverso la vena safena (Figura 1G) per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio della velocità del flusso sanguigno.
3. Osservare il flusso sanguigno in tempo reale direttamente su un monitor video 5 minuti dopo l'iniezione. Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro (W.D.) (W.D. 30,5 mm, 10x, apertura numerica 0,26) e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile (Table of Materials). Registrare il video utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione in bianco e nero ad accoppiamento di carica (Table of Materials) a 2 fotogrammi / s). Acquisisci più di 350 immagini per video per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso.
   NOTA: I vasi sanguigni sia del legamento a spirale che della stria vascolare possono essere visualizzati regolando la messa a fuoco ottica (video supplementare 1).

4. Analisi video

1. Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato (Table of Materials) e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite.
2. Calcolare la velocità del flusso sanguigno dai fotogrammi video acquisiti tracciando il movimento delle cellule del sangue marcate nella distanza spaziale tra le posizioni delle immagini²⁷.
   1. Apri il video del flusso sanguigno nel software (Fiji [ImageJ] è stato utilizzato in questo protocollo) e imposta la scala delle immagini.
   2. Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento. Utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso.
3. Calcolare la portata volumetrica (F) secondo la seguente equazione: F = V × A. (V: velocità; A: area della sezione trasversale della nave).

5. Esposizione al rumore

1. Metti gli animali in gabbie di rete metallica. Esporli al rumore a banda larga a 120 dB di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per 3 ore e per altre 3 ore il giorno successivo.
   NOTA: Questo regime di esposizione al rumore, abitualmente utilizzato in questo laboratorio, produce una perdita permanente della sensibilità cocleare²⁸.

Risultati

Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale (Figura 1), l'osservazione microscopica a fluorescenza intravitale ad alta risoluzione delle cellule del sangue marcate con Dil in vasi marcati con FITC era fattibile attraverso una finestra aperta del vaso. La Figura 2A è un'immagine rappresentativa scattata sotto FIVM che mostra i capillari della parete laterale dell'apice cocleare del topo. La lumina d...

Discussione

Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l'etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l'imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope