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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali. Adeguate strategie cliniche e di laboratorio garantiscono la massima efficacia, efficienza e sicurezza dei trattamenti di conservazione della fertilità.

Abstract

Preservare la fertilità femminile è fondamentale in un sistema sanitario multifunzionale che si prende cura della futura qualità della vita dei pazienti. La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche. Le principali indicazioni mediche sono le malattie oncologiche, le malattie ginecologiche come l'endometriosi grave, le malattie sistemiche che compromettono la riserva ovarica e le condizioni genetiche che comportano la menopausa precoce. Questo documento descrive l'intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull'evidenza. Inoltre, si concentra sull'efficacia della procedura e descrive le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di prelievo degli ovociti, denudazione e vitrificazione sono state dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l'efficacia, l'efficienza e la sicurezza.

Introduzione

Lo sviluppo e l'implementazione di un efficiente programma di crioconservazione per gli ovociti umani è stato un passo avanti significativo nella medicina riproduttiva. Secondo recenti evidenze, la vitrificazione è la strategia più efficace per crioconservare gli ovociti della metafase II (MII), in quanto si traduce in tassi di sopravvivenza statisticamente più elevati rispetto al congelamento lento, indipendentemente dalla popolazione di pazienti (pazienti infertili o programma di donazione di ovociti)1,2,3. I notevoli risultati della vitrificazione degli ovociti hanno portato i comitati di pratica dell'American Society for Reproductive Medicine (ASRM) e della Society for Assisted Reproductive Technology (SART) a dichiarare questa tecnica come la più efficace per la conservazione elettiva della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche4,5,6. Le indicazioni mediche per la conservazione della fertilità includono (i) il cancro e le malattie autoimmuni che richiedono terapie7 come la radioterapia, la chemioterapia citotossica e la terapia endocrina (il cui effetto dannoso sulla riserva ovarica è associato all'età materna, nonché al tipo e alla dose del trattamento); (ii) malattie ovariche che richiedono un intervento chirurgico ripetuto o radicale (come l'endometriosi)8; e (iii) condizioni genetiche (ad esempio, X-fragile) o insufficienza ovarica prematura. Inoltre, la conservazione della fertilità è diventata un'opzione preziosa per tutte le donne che non hanno raggiunto il loro obiettivo genitoriale per motivi non medici (noto anche come congelamento sociale).

Indipendentemente dall'indicazione per la conservazione della fertilità e secondo le principali linee guida internazionali sulla conservazione della fertilità, tutti i pazienti disposti a vetrificare i loro ovociti dovrebbero ricevere una consulenza appropriata per essere informati sulle loro realistiche possibilità di successo, i costi, i rischi e le limitazioni della procedura9,10,11,12,13. Ancora più importante, dovrebbe essere chiaro che la vitrificazione di una coorte di ovociti MII non garantisce una gravidanza, ma che offre una maggiore possibilità di successo per il futuro trattamento di fecondazione in vitro (FIV), se necessario14. A questo proposito, l'età della donna al momento della vitrificazione degli ovociti è sicuramente il fattore limitante15 più importante in quanto l'età materna avanzata (AMA; >35 anni) è la causa principale dell'infertilità femminile16. Oltre a una progressiva riduzione della riserva ovarica, l'AMA è associata a una compromissione della competenza degli ovociti a causa di percorsi fisiologici difettosi come il metabolismo, la regolazione epigenetica, i checkpoint del ciclo cellulare e la segregazione meiotica17. Pertanto, il numero ragionevole di uova da vetrificare dipende principalmente dall'età materna. Nelle donne di età inferiore ai 36 anni, sono necessari almeno 8-10 ovociti MII18 per massimizzare le possibilità di successo. In generale, maggiore è il numero di ovociti vitrificati, maggiore è la probabilità di successo. Pertanto, adattare la stimolazione ovarica in base ai marcatori della riserva ovarica come i livelli di ormone anti-Mülleriano (AMH) o la conta dei follicoli antrali (AFC) è fondamentale per sfruttare appieno la riserva ovarica nel più breve tempo possibile.

La sicurezza dell'intera procedura è l'altra questione chiave quando si arruolano pazienti per la conservazione della fertilità. I medici dovrebbero impiegare le migliori strategie per ridurre al minimo i rischi e prevenire la sindrome da iperstimolazione (i) ovarica (OHSS) utilizzando approcci sicuri come il protocollo antagonista dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) seguito da un trigger agonista GnRH19 e (ii) i rischi remoti, ma possibili, di sanguinamento peritoneale, lesioni alle strutture pelviche (uretere, intestino, appendice, nervi) o infezione pelvica durante il recupero degli ovociti. Infine, (iii) i regimi tradizionali per la stimolazione sono associati all'estradiolo sierico soprafisiologico e, pertanto, non sono raccomandati nelle malattie sensibili agli estrogeni come il cancro al seno. I protocolli che coinvolgono inibitori dell'aromatasi (come letrozolo o tamoxifene) sono più adatti in questi casi20,21. In laboratorio, il protocollo più diffuso per la vitrificazione degli ovociti è ancora quello descritto per la prima volta da Kuwayama e colleghi2,23,che consiste in una procedura graduale che prevede l'aggiunta graduale di crioprotezioni (CPA). Nella prima fase (equilibrio/disidratazione), gli ovociti sono esposti in una soluzione di CPA contenente il 7,5% v/v di glicole etilenico e il 7,5% v/v dimetilsolfossido (DMSO), mentre nella seconda fase gli ovociti vengono spostati in una soluzione di vetrificazione con 15% v/v etilenglicole e 15% v/v DMSO, più 0,5 mol/L saccarosio. Dopo una breve incubazione nel mezzo della vitrificazione, gli ovociti possono essere collocati in criodevice aperte appositamente progettate e infine immersi in azoto liquido a -196 °C per essere conservati fino all'uso.

Qui, l'intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità è stato descritto (i) delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull'evidenza, (ii) concentrandosi sul rapporto costo-efficacia della procedura e (iii) descrivendo le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di recupero degli ovociti, denudazione e vitrificazione saranno dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l'efficacia, l'efficienza e la sicurezza. Poiché esistono altri protocolli o adattamenti di questo protocollo in letteratura, i risultati rappresentativi e le sezioni di discussione di questo manoscritto si applicano solo a questa procedura.

Protocollo

1. Work-up e consulenza clinica

NOTA: Nel caso di pazienti che richiedono la conservazione della fertilità per motivi oncologici, assicurarsi che non vi sia alcuna lista d'attesa per la pianificazione della consultazione e che l'appuntamento sia fornito il prima possibile.

  1. Esaminare la storia medica e la documentazione precedente e valutare lo stato di salute generale del paziente.
  2. Registrare tutte le informazioni (compresa l'approvazione dell'oncologo a sottoporsi a stimolazione ovarica in caso di pazienti oncologiche) in un database relazionale.
  3. Fornire al paziente una consulenza specifica sulla fattibilità della procedura. Spiegare le fasi della procedura (stimolazione ovarica, prelievo di ovociti, vitrificazione degli ovociti) e informarla sulle realistiche possibilità di successo (principalmente a seconda dell'età materna e del numero previsto di ovociti MII al momento del prelievo degli ovociti), nonché del costo e dei limiti della procedura.
  4. Eseguire l'ecografia transvaginale per ottenere informazioni sulla riserva ovarica (cioè AFC) e per valutare l'accessibilità delle ovaie per la raccolta degli ovuli.
  5. Richiedere esami del sangue per valutare il gruppo sanguigno e il fattore Rhesus, lo screening della coagulazione (emocromo, protrombina, tromboplastina, fibrinogeno, proteina C, proteina S, antitrombina III, omocisteina) e malattie infettive (epatite B, epatite C, HIV, laboratorio di ricerca sulle malattie veneree / Treponema pallidum Hemagglutinanation Assay).
    NOTA: Nel caso di pazienti che accedono a un programma di conservazione della fertilità per motivi medici non urgenti, una valutazione più completa può includere l'ormone follicolo-stimolante basale (FSH), l'ormone luteinizzante (LH), estradiolo, AMH, esame del seno, test Papanicolaou, screening genetico della coagulazione (fattore V di Leida e protrombina) e screening TORCH (toxoplasmosi, rosolia, citomegalovirus).
  6. Richiedi una valutazione cardiologica (elettrocardiogramma).
  7. Raccomandare la consulenza psicologica.

2. Protocolli di stimolazione ovarica controllata per la conservazione della fertilità

NOTA: Quando il tempo disponibile prima di iniziare il trattamento del cancro è limitato, il protocollo di avvio casuale (cioè l'inizio della stimolazione ovarica in qualsiasi momento durante il ciclo mestruale) è raccomandato per la stimolazione ovarica in pazienti oncologiche che sono candidate per la conservazione della fertilità. In un programma di conservazione della fertilità per motivi medici non urgenti o sociali, è preferibile la stimolazione convenzionale che inizia nella fase follicolare precoce e la stimolazione ovarica viene avviata in base al ciclo mestruale. Gli approcci di stimolazione ovarica controllata (COS) dovrebbero essere eseguiti secondo le recenti linee guida della Società europea di riproduzione umana ed embriologia (ESHRE)24.

  1. Personalizza il COS in base alle caratteristiche della paziente e ai marcatori di riserva ovarica, principalmente età materna, FSH, AMH e AFC.
  2. Iniziare cos il giorno 5 del ciclo mestruale utilizzando FSH ricombinante o urinario con una dose fissa di 150-300 UI / die (protocollo antagonista).
    NOTA: In una specifica popolazione di pazienti con deficit di LH o scarsa risposta non ottimale, può essere somministrato un ulteriore LH 75/150 UI/die in base alla risposta ovarica, ai livelli di LH e al giudizio del ginecologo.
  3. Nei pazienti con malattie sensibili agli estrogeni, includere gonadotropine associate a inibitori dell'aromatasi (letrozolo) dal giorno 1 della stimolazione fino al giorno 7 dopo il recupero degli ovociti.
  4. Somministrare una dose fissa di gonadotropine per 4 giorni.
  5. Monitorare la crescita follicolare il giorno 5 e poi ogni 2-3 giorni; eventualmente, regolare il dosaggio di gonadotropina.
  6. Una volta che almeno 3 follicoli raggiungono i 17-18 mm di diametro, somministrare il trigger per la maturazione finale degli ovociti con un singolo bolo sottocutaneo di agonista del GnRH alla dose di 0,5 ml.

3. Recupero degli ovociti

  1. Preparazione per il recupero degli ovociti
    1. Per i materiali richiesti, fare riferimento alla Tabella dei materialie tenere pronte calzature e abbigliamento da laboratorio, maschera facciale chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinzette, piccole garze sterili, speculum monouso o riutilizzabile, attrezzature per la chirurgia vaginale e disinfettante per superfici. Garantire la disponibilità di attrezzature per la rianimazione, farmaci anestetici per l'inversione, un kit preparato per il trattamento dello shock anafilattico e ossigeno in sala operatoria.
    2. Eseguire la procedura di prelievo degli ovociti secondo le raccomandazioni del gruppo di lavoro ESHRE sugli ultrasuoni nelle tecnologie di riproduzione assistita (ART)25.
      1. Somministrare sedazione o anestesia generale e antibiotici per la profilassi.
        NOTA: In questo protocollo, la sedazione profonda è stata ottenuta ingostrando propofol (il cui dosaggio è regolato in base al peso del paziente) e 50-100 μg di fentanil, 1000 mg di paracetamolo e ventilazione assistita della maschera con ossigeno.
      2. Eseguire il prelievo degli ovociti utilizzando un'unità di aspirazione composta da una pompa per vuoto, un tubo di raccolta collegato a un ago da 17 G a lume singolo e un tubo di raccolta degli ovociti. Durante la raccolta, non superare una pressione di ~ 120 mmHg per evitare il rischio di danni agli ovociti come la rimozione delle cellule del cumulo o la fratturazione della zona pellucida.
      3. Calibrare la temperatura della superficie di lavoro per garantire 37 °C nel substrato di coltura. Durante l'intera procedura, ridurre al minimo l'esposizione degli ovociti anche a temperature transitorie che possono influire sulla loro competenza evolutiva.
      4. Alla fine del recupero degli ovociti, osservare il paziente per 3-4 ore prima della dimissione.
  2. Sala operatoria
    1. Prima di entrare in sala operatoria, identificare il paziente e confermare il momento di attivazione dell'ovulazione.
    2. Avere il paziente sdraiato sul tavolo operatorio in posizione ginecologica.
    3. Pulire la vagina / cervice prima del recupero degli ovociti per ridurre al minimo la contaminazione batterica.
    4. Eseguire un'ecografia transvaginale preliminare per valutare la posizione delle ovaie e le relazioni anatomiche con i vari organi e vasi sanguigni.
    5. Sotto guida ecografica, inserire un ago a singolo lume attraverso la parete vaginale e in un follicolo ovarico, facendo attenzione a non ferire gli organi o i vasi sanguigni situati tra la parete vaginale e l'ovaio.
    6. Inizia l'aspirazione dal follicolo più vicino e passa a quelli più distali.
    7. Forare tutti i follicoli di diametro superiore a 11-12 mm, eseguendo "movimenti di torsione" dell'ago per aspirare l'intero fluido follicolare, che viene poi rilasciato in un tubo sterile (fondo rotondo 14 mL) preriscaldato nel riscaldatore a blocchi della sala operatoria.
    8. Subito dopo il recupero, sigillare ed etichettare il tubo con i dettagli dell'identità del paziente.
    9. Assicurarsi che l'infermiere porti il tubo in laboratorio, dove viene immediatamente sottoposto a screening per la presenza di complessi cumulo-ovociti (COC).
    10. Istruire gli embriologi a informare il clinico del numero totale di COC recuperati.
    11. Una volta completata la procedura per la prima ovaia, lavare l'ago con un mezzo pulito e procedere con la seconda ovaia utilizzando la stessa procedura.
    12. Dopo il prelievo degli ovociti, valutare qualsiasi sanguinamento dalle ovaie o dai vasi sanguigni del parametrio e del liquido libero nella sacca di Douglas.
      NOTA: Per automatizzare e migliorare l'efficacia della tracciabilità dei gameti e degli embrioni a livello clinico, nel centro26è stato implementato un sistema di testimonianza elettronica (EWS). Tuttavia, questo protocollo non menziona l'EWS, per garantire la riproducibilità del protocollo in qualsiasi laboratorio di fecondazione in vitro. Tuttavia, considera che tutte le fasi della procedura richiedono un secondo operatore (cioè un testimone) per garantire la tracciabilità dei gameti e degli embrioni.

4. Laboratorio di fecondazione in vitro

  1. Il giorno prima della procedura di prelievo degli ovociti
    1. Preparare le provette per la raccolta degli ovociti (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
      1. Erogare 1 mL di terreno di fecondazione in vitro (fare riferimento alla Tabella dei materiali)in ogni tubo di raccolta degli ovociti (fondo tondo, 5 ml) e coprire con 0,2 ml di olio minerale (fare riferimento alla Tabella dei materiali)per la coltura embrionale.
        NOTA: Il numero di tubi sarà definito in base al numero di follicoli che si prevede di recuperare. Ogni tubo può contenere fino a 4 COC.
    2. Sigillare i tubi con il cappuccio (primo scatto). Etichettare i tubi con i dettagli del tipo di mezzo e della data di preparazione. Incubare i tubi durante la notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO2, 5% 02).
  2. Il giorno del prelievo degli ovociti
    1. Preriscaldare le forniture di plastica a 37 °C (piatti di coltura sterili e pipette Pasteur).
    2. Chiedi alle pazienti di confermare la loro identità (nome completo e data di nascita) e l'ora di attivazione dell'ovulazione. Annotare sul foglio di laboratorio che la procedura di identificazione (ID) è stata eseguita e che il tempo di attivazione dell'ovulazione è stato confermato.
    3. Togliere i tubi di raccolta degli ovociti dall'incubatrice (subito prima dell'inizio della procedura) e spingere verso il basso il cappuccio per garantire una chiusura ermetica. Etichettare i tubi di raccolta degli ovociti con le informazioni del paziente. Posizionare le provette di raccolta degli ovociti nel riscaldatore a blocchi a 37 °C.
    4. Esaminare il fluido follicolare nei piatti di coltura sterili prebellici e identificare i COC. Una volta identificati uno o più COC, sciacquarli due volte in due gocce di mezzo per rimuovere il fluido follicolare e la contaminazione del sangue.
    5. Trasferire i COC nelle tubette di raccolta degli ovociti e annotare il numero di COC sul tubo. Allentare i tappi dei tubi medi, e incubarli prontamente a 37 °C in un'atmosfera del 6% CO2,5% O2.
    6. Ripetere i passaggi da 7 a 9 in base al numero di ovociti recuperati. Aggiornare la scheda di laboratorio.
      NOTA: Assicurarsi che un testimone controlli che tutti i blocchi riscaldanti del tubo (compresi quelli in sala operatoria) siano vuoti e segni la chiusura della procedura sul foglio di laboratorio.
    7. Pulire la fase di lavoro dopo il completamento della procedura.

5. Denudazione degli ovociti

  1. Mezzo tamponato con acido prebellico 4-(2-idrossietil)-1-piperazinetansolfonico (HEPES) e ialuronidasi (fare riferimento alla tabella dei materiali)a 37 °C almeno 1 ora prima dell'inizio.
  2. Preparare una piastra per fecondazione in vitro a 4 pozzetti (fare riferimento alla Tabella dei materiali)con 0,6 ml / pozzetti di terreno tamponato HEPES preriscaldato (integrato con il 5% di albumina sierica umana [HSA]) coperto con 0,3 ml di olio minerale per la coltura embrionale e riscaldare a 37 ° C per almeno 30 minuti.
  3. Etichettare la piastra di denudazione degli ovociti con i dettagli dell'identità del paziente.
  4. Immediatamente prima di iniziare la procedura, aggiungere la ialuronidasi al primo pozzet per ottenere una concentrazione finale di circa 20 UI/ml.
  5. Posizionare un numero limitato di COC (fino a 6) nel primo pozzo contenente l'enzima per disperdere le cellule del cumulo.
  6. Per migliorare la rimozione enzimatica delle cellule del cumulo e della corona, eseguire lo stripping delle cellule del cumulo pipettando ripetutamente gli ovociti attraverso una pipetta Pasteur con un diametro interno di circa 250 μm per un massimo di 30 s. Dopo aver osservato la dissociazione cellulare iniziale, trasferire gli ovociti al secondo pozzo contenente solo mezzo tamponato con HEPES, avendo cura di trasportare una quantità minima dell'enzima.
  7. Eseguire un'ulteriore denudazione per rimuovere le cellule corona utilizzando pipette denudanti con diametri interni decrescenti (170-145 μm). Utilizzare diametri inferiori (135μm) solo se strettamente necessario.
  8. Lavare accuratamente gli ovociti denudati per lavare via l'enzima.
  9. Dopo la denudazione, esaminare gli ovociti al microscopio invertito per valutarne l'integrità e lo stadio di maturazione. Separare gli ovociti MII da quelli immaturi (vescicola germinale e metafase-I).
  10. Spostare gli ovociti MII nell'area di vitrificazione per eseguire immediatamente la crioconservazione. Aggiornare la scheda di laboratorio.

6. Vitrificazione degli ovociti

NOTA: Eseguire la vitrificazione degli ovociti preferibilmente entro 38 ore dal prelievo degli ovociti e immediatamente dopo la denudazione. La procedura di vitrificazione qui descritta deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) e utilizzando una pipetta stripper con un diametro interno di 170 μm in modo da non danneggiare gli ovociti durante la manipolazione.

  1. Circa 30 minuti prima della procedura, portare la soluzione di equilibratura (ES) e la soluzione di vetrificazione (VS) a RT (25-27 °C).
  2. Etichettare correttamente i criodevici con il nome e l'ID del paziente, l'ID del trattamento, la data di congelamento, il numero di ovociti e il criobarcodice.
  3. Riempire un rack di raffreddamento monouso fino all'alto con azoto liquido fresco e avviare il processo di sterilizzazione.
  4. Etichettare la piastra di vetrificazione (fare riferimento alla Tabella dei Materiali)con il nome e l'ID del paziente. Chiedere a un testimone di verificare l'ID corretto dei criododvici.
  5. Invertire con cautela ogni flaconcino due volte per mescolarne il contenuto prima dell'uso e preparare il coperchio di una capsula di Petri da 6 mm con una goccia di 30 μL di mezzo tamponato HEPES (con il 5% di HSA) e una goccia adiacente di 30 μL di ES.
    NOTA: Posizionare le gocce appena prima dell'uso per limitare l'evaporazione media.
  6. Utilizzando una pipetta stripper da 170 μm di diametro, posizionare gli ovociti (fino a 9) nella prima goccia con il minor volume possibile di mezzo. Utilizzando la pipetta stripper, creare un ponte di mezzo tra la goccia n.1 e n.2 per ottenere un graduale aumento della concentrazione dei CPA (Figura 1A).
  7. Incubare gli ovociti nella prima goccia per 3 minuti. Aggiungere una terza goccia di 30 μL di ES (n.3). Dopo 3 min, trasferire gli ovociti nella seconda goccia di ES, e creare un ponte medio tra le gocce n.3 e n.2 (Figura 1B). Incubare gli ovociti in goccia n.3 per 3 min.
  8. Durante l'incubazione, aggiungere una goccia di ES da 30 μL per ogni criodevice che verrà utilizzata (se 9 ovociti devono essere crioconservati, posizionare 3 gocce di ES con 3 ovociti in ogni goccia di ES). Spostare gli ovociti in soluzione ES pura e lasciarli per 6-9 minuti (fino a quando non recuperano la loro dimensione iniziale dopo il restringimento) (Figura 1C).
  9. Preparare un piatto centrale (60 x 15 mm) con 1 ml di VS. Alla fine dei primi 6 minuti, trasferire gli ovociti da crioconservare nella soluzione VS, rilasciando il minor mezzo possibile. Lasciare gli ovociti in VS per 1 minuto e lavarli accuratamente spostandoli dal basso verso l'alto del piatto per rimuovere l'eccesso di ES.
  10. Circa 10 s prima della fine del minuto di incubazione, posizionare la criodevica sotto il microscopio e regolare la messa a fuoco sul segno nero (cioè la punta della criodevica). Posizionare gli ovociti sulla criodevica accanto al segno nero con la quantità minima di VS (Figura 2A).
  11. Spostare la pipetta stripper lontano dagli ovociti e rimuovere l'eccesso di mezzo VS (Figura 2B) in modo che gli ovociti rimangano coperti da un sottile strato di mezzo (Figura 2C).
  12. Immergere rapidamente la criodevica in azoto liquido, scuotendola rapidamente per rimuovere le bolle d'aria dalla sua superficie. Tenere il cappuccio protettivo della criodevica con una pinzetta e riempirlo con azoto liquido; quindi inserire la criodevica in esso mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido.
  13. Conservare il criodevice in un visiotube precedentemente etichettato con le informazioni del paziente. Aggiornare la scheda di laboratorio.

7. Riscaldamento degli ovociti

  1. Circa 30 minuti prima della procedura, riscaldare la soluzione di scongelamento (TS), la soluzione di diluizione (DS) e la soluzione di lavaggio (WS) a RT (25-27 °C). Invertire con cautela ogni flaconcino due volte per mescolarne il contenuto. Posizionare 1 mL di TS in una capsula di Petri del pozzef bene centrale e riscaldarla a 37 °C per almeno 1 ora prima di iniziare la procedura.
  2. Etichettare tutti i materiali di plastica con il nome e l'ID del paziente e il tipo di soluzione. Chiedere a un testimone di confermare le informazioni del paziente sulla criodevica.
  3. Per ogni criodevice da riscaldare, preparare una piastra a 6 pozzetti con 200 μL di DS nel primo pozzo e una quantità uguale di WS nel secondo e nel terzo (denominati WS1 e WS2, rispettivamente). Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o acqua sterile nell'area esterna ai pozzi per evitare l'evaporazione.
  4. Prendi la parabola TS dall'incubatrice e mettila sotto il microscopio. Regolare la messa a fuoco del microscopio al centro della capsula di Petri.
  5. Ruotare e rimuovere con attenzione il cappuccio protettivo della criodevica, mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido. Trasferire il criodevice dall'azoto liquido nel TS il più rapidamente possibile per evitare il rischio di devitrificazione e iniziare il conto alla rovescia (1 min).
  6. Localizzare gli ovociti concentrandosi sulla punta della criodevica (cioè il segno nero). Usando una pipetta stripper, rilascia gli ovociti dalla criodevica.
    NOTA: Cercare di non aspirare gli ovociti dalla criodevica; rilasciare delicatamente alcuni media su di loro fino a quando non si spostano nel TS.
  7. Utilizzando una pipetta stripper da 170 μm di diametro, trasferire gli ovociti in DS con una piccola quantità di TS (per creare un gradiente) e lasciarli nel DS per 3 minuti. Spostare gli ovociti su WS1 allo stesso modo e lasciarli per 5 minuti. Infine, trasferire gli ovociti a WS2 per 1 min.
  8. Trasferire gli ovociti in un terreno di coltura IVF preequilibrato appropriato e incubarli per 1 ora prima di procedere con l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). Aggiornare la scheda di laboratorio.

Risultati

Panoramica del programma di conservazione della fertilità al centro

In un periodo di 12 anni (2008-2020), 285 donne sono state sottoposte ad almeno un prelievo di ovociti che ha comportato la vitrificazione dell'intera coorte di ovuli maturi raccolti. La maggior parte di queste donne (n = 250) ha subito un singolo recupero e 35 hanno subito più recuperi. Le ragioni per sottoporsi al prelievo di ovociti per la vitrificazione degli ovuli sono riassunte in 4 categorie: medico (...

Discussione

Considerazioni cliniche

Sebbene siano state esplorate strategie emergenti, come la crioconservazione del tessuto ovarico e la maturazione in vitro, la vitrificazione degli ovociti dopo COS è la tecnica gold standard per la conservazione della fertilità. In questo scenario, il numero di ovociti recuperati e crioconservati dovrebbe essere massimizzato nel più breve tempo possibile poiché la maggior parte dei pazienti oncologici potrebbe beneficiare esclusivamente di un cicl...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Nessuno

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Vacuum PumpCookK-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria DishCorning353803Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubesFalcon352001Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubesFalcon352003Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubatorEppendorfGalaxy 14S
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum AlbuminthermoFisher Scietific9988
HyaluronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dishFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
Rubber BulbSigma AldrichZ111589-12EA1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettesHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum AlbuminFujifilm Irvine Scientific9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kitFujifilm Irvine Scientific90133-so2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Stainless Container for Cooling RackKitazatoLiquid nitrogen container for vitrification
StereomicroscopeLeicaLeica M80
Consumables
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lidThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo cultureFujifilm Irvine Scientific9305
SAtripping pipette tips (300µm)CookK-FPIP-1300-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kitFujifilm Irvine Scientific90137-so4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

Riferimenti

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