Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Riepilogo

L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Abstract

Gli steroidi sessuali, prodotti dalle gonidi, svolgono un ruolo essenziale nella plasticità del cervello e del tessuto ipofisario e nel controllo neuroendocrino della riproduzione in tutti i vertebrati fornendo feedback al cervello e all'ipofisi. I pesci teleostei possiedono un più alto grado di plasticità tissutale e variazione nelle strategie riproduttive rispetto ai mammiferi e sembrano essere modelli utili per indagare il ruolo degli steroidi sessuali e i meccanismi con cui agiscono. La rimozione della principale fonte di produzione di steroidi sessuali utilizzando la gonadectomia insieme al prelievo di sangue per misurare i livelli di steroidi è stata ben consolidata e abbastanza fattibile nei pesci più grandi ed è una tecnica potente per indagare il ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali. Tuttavia, queste tecniche sollevano sfide se implementate in modelli di teleostei di piccole dimensioni. Qui, descriviamo le procedure passo-passo della gonadectomia sia nei maschi che nelle femmine di medaka giapponese seguite da prelievo di sangue. Questi protocolli si sono dimostrati altamente fattibili in medaka indicato da un alto tasso di sopravvivenza, sicurezza per la durata della vita e fenotipo del pesce e riproducibilità in termini di clearance degli steroidi sessuali. L'uso di queste procedure combinato con gli altri vantaggi dell'utilizzo di questo piccolo modello di teleosteo migliorerà notevolmente la comprensione dei meccanismi di feedback nel controllo neuroendocrino della riproduzione e della plasticità tissutale fornita dagli steroidi sessuali nei vertebrati.

Introduzione

Nei vertebrati, gli steroidi sessuali, che sono prodotti principalmente dalle gonadi, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'asse cervello-ipofisi-gonadi (BPG) attraverso vari meccanismi di feedback^1,2,3,4,5. Inoltre, gli steroidi sessuali influenzano la proliferazione e l'attività dei neuroni nel cervello^6,7^,8 e le cellule endocrine, compresi i gonadotropi, nell'ipofisi^9,10e quindi svolgono ruoli cruciali nel cervello e nella plasticità ipofisaria. Nonostante le conoscenze relativamente buone nei mammiferi, il meccanismo di regolazione dell'asse BPG mediato dagli steroidi sessuali è ben lungi dall'essere compreso nelle specie non mammifere, portando a una scarsa comprensione dei principi evolutivi conservati¹¹. C'è ancora un numero limitato di studi che documentano il ruolo degli steroidi sessuali sul cervello e sulla plasticità ipofisaria, aumentando così la necessità di ulteriori indagini sul ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali su diverse specie di vertebrati.

Tra i vertebrati, i teleostei sono diventati potenti animali modello nell'affrontare numerose domande biologiche e fisiologiche, tra cui la risposta allo stress^{12,13,la crescita 14,15,}la fisiologia nutrizionale^16,17 e la riproduzione^2. I teleostei, in cui gli steroidi sessuali sono per lo più rappresentati da estradiolo (E2) nelle femmine e 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi^18,19, sono stati a lungo modelli sperimentali affidabili per indagare il principio generale della riproduzione tra le specie. I teleostei mostrano unicità nella loro connessione ipotalamo-ipofisaria^20,21 e distinte cellule gonadotrope²², che a volte sono convenienti per la delucidazione dei meccanismi di regolazione. Inoltre, grazie alla loro suscettibilità sia agli esperimenti di laboratorio che a quello sul campo, i teleostei offrono molti vantaggi rispetto ad altri organismi. Sono relativamente poco costosi da acquistare e mantenere^23,24. In particolare, piccoli modelli di teleostei come il pesce zebra (Danio rerio) e il giapponese medaka (Oryzias latipes), sono specie con una fecondità molto elevata e un ciclo di vita relativamente breve che consente una rapida analisi della funzione genica e dei meccanismi di malattia²³, fornendo così vantaggi ancora maggiori nell'affrontare una pletora di questioni biologiche e fisiologiche, considerando i numerosi protocolli ben sviluppati e toolkit genetici disponibili per queste specie²⁵.

In numerosi studi, la rimozione delle gonidi (gonadectomia) insieme alle tecniche di prelievo del sangue sono state utilizzate come metodo per indagare molte questioni fisiologiche, incluso il suo impatto nella fisiologia riproduttiva dei vertebrati nei mammiferi^26,27,28,uccelli²⁹ e anfibi^30. Sebbene l'effetto della gonadectomia sulla fisiologia riproduttiva possa essere alternativamente imitato da antagonisti degli steroidi sessuali, come il tamoxifene e il clomifene, l'effetto dei farmaci sembra essere incoerente a causa degli effetti bimodali^31,32. L'esposizione cronica a un antagonista steroideo sessuale può portare all'allargamento^ovarico33^,34, che può disabilitare l'osservazione dei suoi effetti a lungo termine a causa di un fenotipo malsano. Inoltre, è impossibile eseguire un esperimento di recupero dopo il trattamento con antagonisti degli steroidi sessuali, per garantire l'effetto specifico di alcuni steroidi sessuali. Insieme a questi punti di cui sopra, altri compromessi dell'uso di antagonisti di steroidi sessuali sono stati ampiamente rivisti^31,32. Pertanto, la gonadectomia appare ancora oggi come una potente tecnica per indagare il ruolo degli steroidi sessuali.

Mentre la gonadectomia e le tecniche di prelievo del sangue sono relativamente facili da eseguire in specie più grandi, come il branzino europeo (Dicentrarchus labrax)³⁵, il labbro blu (Thalassoma bifasciatum)³⁶, il pesce cane (Scyliorhinus canicula)³⁷ e il pesce gatto (Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)^38,39, sollevano sfide quando applicati in piccoli pesci come medaka. Ad esempio, l'uso del Fish Anesthesia Delivery System (FADS)⁴⁰ è meno fattibile e sembra essere soggetto a danni fisici eccessivi per i piccoli pesci. Inoltre, una procedura di gonadectomia comunemente usata per i pesci più grandi⁴⁰ non è adatta per i pesci piccoli che richiedono un'elevata precisione per evitare danni eccessivi. Infine, il prelievo di sangue è impegnativo a causa dell'accesso limitato ai vasi sanguigni e della piccola quantità di sangue in quegli animali. Pertanto, un protocollo chiaro che dimostri ogni fase della gonadectomia e del prelievo di sangue in un piccolo teleosteo è importante.

Questo protocollo dimostra le procedure passo-passo della gonadectomia seguite dal prelievo di sangue nel medaka giapponese, un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia orientale. I medaka giapponesi hanno un genoma sequenziato, diversi strumenti molecolari e genetici disponibili²⁵e un sistema di determinazione genetica del sesso che consente di esaminare le differenze sessuali prima che le caratteristiche sessuali secondarie o le gonde siano ben sviluppate⁴¹. È interessante notare che i medaka giapponesi possiedono gondi fuse contrariamente a molte altre specie di teleostei⁴². Queste due tecniche combinate richiedono solo 8 minuti in totale e completeranno l'elenco dei protocolli video già esistenti per questa specie che includeva l'etichettatura dei vasi sanguigni⁴³, patch-clamp sulle sezioni ipofisarie⁴⁴ e neuroni cerebrali⁴⁵e la coltura cellulare primaria⁴⁶. Queste tecniche consentiranno alla comunità di ricerca di indagare e comprendere meglio i ruoli degli steroidi sessuali nei meccanismi di feedback, nonché la plasticità cerebrale e ipofisaria in futuro.

Protocollo

Tutte le sperimentazioni e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l'Università norvegese di scienze della vita. Gli esperimenti con gonadectomia sono stati approvati dall'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (FOTS ID 24305).

NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando medaka giapponesi maschi e femmine adulti (6-7 mesi, peso circa 0,35 g, lunghezza circa 2,7 cm). Il sesso è stato determinato distinguendo le caratteristiche sessuali secondarie, come la dimensione e la forma della pinna dorsale e anale, come descritto in^42,47.

1. Preparazione di strumenti e soluzioni

1. Preparare la soluzione stock anestetica (0,6% di tricaina).
   1. Diluire 0,6 g di tricaina (MS-222) in 100 mL di 10x soluzione salina tampone fosfato (PBS).
   2. Distribuire 1 mL della soluzione stock di Tricaina in diversi tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 °C fino all'uso.
2. Preparare l'acqua di recupero (soluzione di NaCl 0,9%) aggiungendo 18 g di NaCl in 2 L di acqua dell'acquario. Conservare la soluzione a temperatura ambiente fino all'uso.
3. Preparare gli strumenti di incisione rompendo un rasoio in diagonale per ottenere un punto acuto (Figura 1A).
4. Preparare una soluzione anticoagulante nel sangue (0,05 U/μL di eparina sodica) diluendo 25 μL di eparina sodica in 500 μL di 1x PBS. Conservare la soluzione anticoagulante a 4 °C fino all'uso.
5. Preparare due aghi di vetro da un capillare di vetro lungo 90 mm tirando un capillare di vetro con un estrattore di aghi (Figura 1B) seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: il diametro esterno dell'ago di vetro è di 1 mm, mentre il diametro interno è di 0,6 mm.
6. Preparare un coperchio del tubo di plastica da 1,5 ml tagliando il coperchio e praticare un foro che si adatti al diametro esterno dell'ago (Figura 1C). Per fare il foro, riscaldare un'estremità del capillare di vetro da 9 mm e pugnalare il capillare di vetro riscaldato attraverso il coperchio. In alternativa, utilizzare un ago per pugnalare il coperchio fino a quando il diametro del foro si adatta al capillare di vetro da 9 mm.

2. Procedura di gonadectomia

1. Preparare lo 0,02% di soluzione anestetica diluendo un tubo di brodo di tricaina (0,6%) in 30 ml di acqua dell'acquario.
2. Preparare strumenti di dissezione tra cui una pinza ultra-fine e due sottili (una con punta relativamente larga), piccole forbici, filo di nylon e rasoio come descritto al punto 1.3.
3. Anestetizzare il pesce mettendolo nella soluzione anestetica allo 0,02% per 30-60 secondi.
   NOTA: La durata dell'anestesia dipende dalle dimensioni e dal peso del pesce e deve essere adattata. Per garantire che il pesce sia completamente anestetizzato, il corpo del pesce può essere pizzicato delicatamente usando una pinza. Se il pesce non reagisce, la gonadectomia può essere avviata.
4. Esponi il pesce dalla soluzione anestetica e posiziona il pesce orizzontalmente su un lato, fuori dall'acqua sotto un microscopio di dissezione.
5. Ovariectomia (OVX) nelle femmine
   1. Rimuovere le uova ovopositate (uova appese all'esterno del corpo femminile) se presenti e raschiare le squame nell'area dell'incisione (Figura 2A).
   2. Fare delicatamente un'incisione lunga circa 2-2,5 mm tra le costole, tra le pinne pelvica e anale (Figura 2A), usando la lama del rasoio. Quindi, pizzicare delicatamente l'addome del pesce mentre si esano le ovaie a poco a poco usando una pinna fine con punta larga.
   3. Tagliare l'estremità delle ovaie usando una pinna fine e mettere da parte le ovaie (Figura 2B).
      NOTA: Fare attenzione a non rompere il sacco ovarico, se possibile. Se il sacco ovarico è rotto, rimuovere eventuali tracce di gonne il più completamente possibile senza lasciare nemmeno uova non ovulate.
6. Orchidectomia nei maschi
   1. Fare delicatamente un'incisione tra le costole sopra l'ano (Figura 2A) e aprire lentamente l'incisione usando una pinica fine.
   2. Afferrare delicatamente i testicoli usando la pincitta fine e lentamente togliere i testicoli. Successivamente, tagliare l'estremità dei testicoli per rimuovere completamente i testicoli (Figura 2B). Per l'orchidectomia maschile, tutti i preparati sono simili alle femmine fino alla parte di incisione. Quando si afferrano i testicoli, a volte si ottiene il grasso simile ai testicoli. Tuttavia, dopo aver ripristinato il grasso, è possibile provare a trovare nuovamente i testicoli (Figura 2B).
      NOTA: Sia per i maschi che per le femmine, è importante ridurre al minimo la dimensione dell'incisione nell'addome per prevenire danni eccessivi che possono portare alla mortalità. A volte l'intestino può anche apparire attraverso l'incisione insieme alle gondi, quindi assicurati che siano correttamente restituite all'interno dell'incisione prima della chiusura. È essenziale una conoscenza preliminare della posizione delle ovaie e dei testicoli nell'addome medaka.
7. Suturare l'incisione in modo simile nei maschi e nelle femmine (Figura 3).
   1. Posizionare il filo di nylon accanto all'area dell'incisione e pugnalare la pelle dal lato destro dell'incisione attraverso la cavità interna del corpo usando una pinza ultra-fine per inserire il filo con una pinza fine (Figura 3; 1-2).
   2. Pugnalare la pelle dal lato sinistro dell'incisione attraverso la cavità esterna del corpo per eliminare il filo ( Figura 3; 3-4).
   3. Chiudere l'apertura dell'incisione e fare due nodi e tagliare il filo in eccesso (Figura 3; 4-6).
      NOTA: la sutura deve essere adeguatamente stretta e il filo rimanente sul pesce deve essere abbastanza lungo da impedire l'allentamento della sutura. L'intera procedura dall'anestesia fino alla sutura richiede comunemente fino a 6 minuti. Un tempo più lungo può portare alla mortalità.
   4. Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario.
      NOTA: i pesci gonadectomizzati di solito mostrano un comportamento normale dopo 1-2 ore nell'acqua di recupero. Pertanto, a seconda dello scopo dell'esperimento, è possibile campionare il pesce dopo questo intervallo di tempo.

3. Procedura di prelievo del sangue

1. Preparare gli strumenti: un ago di vetro, un capillare in silicone, un tubo di plastica con un foro, un tubo di plastica vuoto da 1,5 ml, un minicentrifuga e nastro.
2. Anestetizzare il pesce con una soluzione anestetica allo 0,02% come descritto nel passaggio 2.1 e posizionare il pesce sotto un microscopio di dissezione in posizione verticale (Figura 4A). Posizionare il pesce su una superficie luminosa per facilitare la visualizzazione della vena caudale di puntura.
3. Installare il cassetto del sangue attaccando un ago di vetro al capillare in silicone (Figura 4B). Rompere la punta dell'ago con una pinna a punta larga e rivestire l'interno dell'ago con una soluzione anticoagulante aspirando e soffiando.
   NOTA: L'uso di una ventosa e di un capillare in silicone con almeno 50 cm di lunghezza sono raccomandati per le misure di sicurezza per evitare qualsiasi contatto diretto del sangue durante l'aspirazione. Inoltre, assicurarsi che l'apertura della punta dell'ago sia sufficientemente grande da consentire il prelievo del sangue.
4. Dirigere l'ago verso l'area del peduncolo del pesce, mirare alla vena del peduncolo caudale (Figura 5A) e prelevare il sangue usando la bocca fino a riempire almeno un quarto del volume totale dell'ago (Figura 5B).
   NOTA: È importante interrompere l'aspirazione prima di rimuovere l'ago dal corpo del pesce.
5. Rilasciare l'ago e mettere un pezzo di nastro in prossimità del lato affilato dell'ago. Posizionare il coperchio con un foro su un tubo di raccolta e mettere l'ago all'interno del tubo attraverso il foro con la punta dell'ago all'esterno (Figura 5C).
6. Metti il pesce nell'acqua di recupero e lasciali per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario.
   NOTA: Per eseguire un secondo prelievo di sangue dallo stesso pesce, campionare il sangue una settimana dopo il primo prelievo di sangue.
7. Flash spin down il sangue raccolto per 1-2 secondi con 1.000 x g a temperatura ambiente per raccogliere il sangue nel tubo.
8. Procedere direttamente alle applicazioni a valle o conservare il sangue a -20 °C fino all'uso.
   NOTA: Fare riferimento allo studio precedente per l'estrazione di steroidi sessuali dal sangue intero⁴⁸.

Risultati

Questo protocollo descrive ogni fase per l'esecuzione della gonadectomia e del prelievo di sangue in un teleosteo modello di piccole dimensioni, il medaka giapponese. Il tasso di sopravvivenza del pesce dopo ovariectomia (OVX) nelle femmine è del 100% (10 su 10 pesci) mentre il 94% (17 su 18 pesci) dei maschi è sopravvissuto dopo orchidectomia. Nel frattempo, dopo che è stata eseguita la procedura di prelievo del sangue, tutti i pesci (38 pesci) sono sopravvissuti.

Discussione

Come riportato nella letteratura precedente, la gonadectomia e il prelievo di sangue sono stati a lungo utilizzati in altre specie modello per indagare domande relative al ruolo degli steroidi sessuali nella regolazione dell'asse BPG. Tuttavia, queste tecniche sembrano essere suscettibili solo per gli animali più grandi. Considerando le piccole dimensioni del modello di teleosteo comunemente usato, il medaka giapponese, forniamo un protocollo dettagliato per la gonadectomia e il prelievo di sangue che è fattibile per q...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry