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Resumen

Describimos un protocolo para la conjugación química del antígeno modelo ovoalbúmina a un anticuerpo específico del receptor de endocitosis para la orientación in vivo de células dendríticas. El protocolo incluye la purificación del anticuerpo, la conjugación química del antígeno, así como la purificación del conjugado y la verificación de una conjugación eficiente.

Resumen

La administración dirigida de antígenos a células dendríticas (CC) de presentación cruzada in vivo induce de manera eficiente las respuestas de las células efectoras T y muestra un enfoque valioso en el diseño de vacunas. El antígeno se administra a DC a través de anticuerpos específicos para los receptores de endocitosis como DEC-205 que inducen la absorción, el procesamiento y la presentación de MHC de clase I y II.

La conjugación eficiente y confiable del antígeno deseado a un anticuerpo adecuado es un paso crítico en la orientación de CC y, entre otros factores, depende del formato del antígeno. La conjugación química de proteína de longitud completa a anticuerpos purificados es una posible estrategia. En el pasado, hemos establecido con éxito la reticulación del antígeno modelo de ovoalbúmina (OVA) y un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) para estudios de orientación de CC in vivo en ratones. El primer paso del protocolo es la purificación del anticuerpo del sobrenadante del hibridoma NLDC (células dendríticas no linfoides)-145 por cromatografía de afinidad. El anticuerpo purificado se activa para la conjugación química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) mientras que al mismo tiempo los grupos sulfhidrilo de la proteína OVA se exponen a través de la incubación con TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina tris (2-carboxietilo)). El exceso de TCEP-HCl y sulfo-SMCC se eliminan y el antígeno se mezcla con el anticuerpo activado para el acoplamiento nocturno. El conjugado αDEC-205/OVA resultante se concentra y se libera del OVA no unido. La conjugación exitosa de OVA a αDEC-205 se verifica mediante el análisis de Western Blot y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Hemos utilizado con éxito αDEC-205/OVA reticulados químicamente para inducir respuestas citotóxicas de células T en el hígado y para comparar diferentes adyuvantes por su potencial en la inducción de inmunidad humoral y celular después de la orientación in vivo de DEC-205+ DC. Más allá de eso, tales conjugados anticuerpo/antígeno acoplados químicamente ofrecen herramientas valiosas para la inducción eficiente de las respuestas de la vacuna a los antígenos tumorales y se ha demostrado que son superiores a los enfoques clásicos de inmunización con respecto a la prevención y el tratamiento de varios tipos de tumores.

Introducción

Las células dendríticas (DC) son actores centrales del sistema inmunitario. Son un grupo diverso de células especializadas en la presentación de antígenos y su función principal es tender puentes entre la inmunidad innata y adaptativa1,2. Es importante destacar que los DC no solo desempeñan un papel importante en respuestas eficientes y específicas dirigidas a patógenos, sino que también están involucrados en muchos aspectos de la inmunidad antitumoral1,3.

Debido a su papel exclusivo en la inmunidad del huésped, la DC se centró como células diana para la vacunación4. Un enfoque es dirigir antígenos a DC in vivo para inducir respuestas inmunes específicas de antígenos y en los últimos años, un gran número de estudios se han dedicado a definir receptores adecuados y estrategias de orientación1,4. Un ejemplo es el receptor de lectina de tipo C DEC-205, que puede ser dirigido por anticuerpos específicos de DEC-205 para inducir endocitosis. Es importante destacar que se ha demostrado que la orientación DEC-205 en combinación con adyuvantes adecuados induce de manera eficiente células T CD4+ y CD8+ de larga vida y protectoras, así como respuestas de anticuerpos, también contra antígenos tumorales3,5,6,7,8,9.

Hay una serie de estudios que muestran que los antígenos conjugados dirigidos a DC son superiores al antígeno libre no conjugado3,5,10,11,12. Esto hace que la conjugación del antígeno con la respectiva fracción de orientación de CC sea un paso central en los enfoques de orientación de CC. En el caso de la orientación de DC a través de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los antígenos pueden estar unidos química o genéticamente y cualquiera de las estrategias proporciona sus propias (des)ventajas1. Por un lado, en las construcciones de anticuerpos-antígenos genéticamente modificados existe un control sobre la dosis de antígenos, así como la ubicación que proporciona una comparabilidad superior entre los lotes1. Al mismo tiempo, sin embargo, la conjugación química necesita menos preparación y proporciona más flexibilidad, especialmente cuando se intenta probar y comparar diferentes antígenos y / o estrategias de vacunación en modelos experimentales y preclínicos.

Aquí, presentamos un protocolo para la conjugación química eficiente y confiable de la ovoalbúmina (OVA) como antígeno proteico modelo a un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) adecuado para la orientación de CC in vivo en ratones. En primer lugar, αDEC-205 se purifica a partir de células de hibridoma NLDC-14513. Para la conjugación química, se utiliza el reticulador heterobifuncional sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contiene éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y grupos maleimida, lo que permite la conjugación covalente de moléculas que contienen amina y sulfhidrilo. Específicamente, las aminas primarias del anticuerpo reaccionan inicialmente con sulfo-SMCC y la αDEC-205 activada por maleimida resultante y luego reaccionan con la proteína OVA que contiene sulfhidrilo reducida a través de TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina Tris(2-carboxietilo)). El producto final es αDEC-205/OVA conjugado químicamente (Figura 1). Más allá de la conjugación química en sí, nuestro protocolo describe la eliminación del exceso de OVA del conjugado, así como la verificación de la conjugación exitosa a través del análisis de Western Blot y un ensayo específico de inmunoabsorción ligado a enzimas. Hemos empleado con éxito este enfoque en el pasado para conjugar químicamente OVA y otras proteínas o péptidos inmunogénicos a αDEC-205. Demostramos la unión eficiente a células CD11c+ in vitro así como la inducción eficiente de inmunidad celular y humoral in vivo.

Ciertamente, hay inconvenientes en este método, como en la comparabilidad de lote a lote y en la dosificación exacta del antígeno dentro del conjugado final. Sin embargo, la conjugación química proporciona flexibilidad experimental en la elección del anticuerpo y el antígeno proteico en comparación con las construcciones genéticamente modificadas. Por lo tanto, creemos que este enfoque es especialmente valioso en la evaluación de diferentes antígenos por su eficiencia en la orientación de CC en modelos preclínicos de ratón, lo que es importante también en el contexto de respuestas inmunes antitumorales específicas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por la agencia del gobierno local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; número de expediente 33.12-42502-04-10/0108) y se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales.

1. Producción de αDEC-205 a partir de la línea celular de hibridoma NLDC-145

  1. Para la producción de anticuerpos, descongele las células NLDC-145 criopreservadas que producen αDEC-205 a 37 °C en un baño de agua. Expandir las células a 37 °C y 5% de CO2. Dos 75 cm2 se necesitarán botellas para proceder a la producción de anticuerpos. Los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de seguridad para garantizar condiciones de trabajo seguras y evitar la contaminación de los cultivos.
    1. Resuspend 1 mL de células descongeladas (1 x10 6 - 5 x10 6 células/mL) en 9 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) en un matraz de cultivo celular (25 cm2). Coloque el matraz horizontalmente en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, 5% CO2.
    2. Cultivo de las células a 37 °C y 5% de CO2,hasta un 70% de confluencia. Esto normalmente debe lograrse después de 24 - 48 h.
    3. Una vez que las células sean 70% confluentes, transfiera la suspensión completa de células NLDC-145 (10 mL) a un tubo de centrífuga cónica de 15 mL utilizando un controlador de pipeta con una pipeta en un rango de volumen de 1-10 mL. Pellet las células por centrifugación a 250 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Precaliente ISF-1 medio a 37 °C en un baño de agua y resuspenda el pellet en 12 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%. Transferir la suspensión celular resuspendida a un matraz de cultivo celular fresco (75 cm2).
    5. Cultivar y expandir las células en medio ISF-1 suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2,hasta un 70% de confluente y un 99% viable. Esto normalmente debe lograrse después de 48 - 72 h.
    6. Divida las células en dos matraces de 75 cm2. Para hacer esto, primero enjuague el fondo del matraz de cultivo celular / superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células NLDC-145 de la superficie. Transfiera 6 ml de la suspensión celular NLDC-145 cada una en una de las dos botellas frescas de 75 cm2 y agregue un medio ISF-1 precalentado suplementado con penicilina / estreptomicina al 1% hasta 12 ml.
      NOTA: No renueve el medio de cultivo celular ya que las células NLDC-145 habrán condicionado el medio. Transfiera las células junto con su medio y llene el cultivo hasta el volumen deseado con medio fresco. Esto es crucial para la viabilidad y la producción máxima de anticuerpos por parte de las células NLDC-145.
    7. Ampliar los cultivos celulares a 37 °C y 5% de CO2,hasta aproximadamente un 70% de confluencia que generalmente se logra después de 48 - 72 h.
    8. Una vez que las células sean 70% confluentes, transfiera 10 ml de la suspensión de células NLDC-145 expandida de cada una de las botellas de 75 cm2 a una botella de rodillo petG (tereftalato glicol de polietileno) (1.050 cm2). Para esto, enjuague el fondo del matraz de cultivo celular / superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células de la superficie utilizando un controlador de pipeta y una pipeta de 10 ml.
    9. Agregue 140 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) directamente de la botella mediana a cada una de las botellas de rodillos nlDC-145 que las llenen hasta la marca de 150 ml.
      NOTA: Consulte la nota en el paso 1.1.6.
    10. Cultive las botellas de rodillos a 37 °C, 5% CO2 y 25 rondas/min durante tres días.
    11. Añadir 150 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada una de las botellas de rodillos nldc-145 que contengan llenándolas hasta la marca de 300 ml.
    12. Cultive las botellas de rodillos que ahora contienen 300 ml de cultivo cada una a 37 ° C, 5% de CO2 y 25 rondas / min durante otros tres días.
    13. Añadir otros 100 ml de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada una de las botellas de rodillos que contienen NLDC-145, llenándolas así hasta la marca de 400 ml.
    14. Cultive las botellas de rodillos que ahora contienen 400 ml de cultivo cada una a 37 ° C, 5% de CO2 y 25 rondas / min durante otros siete días.
      NOTA: Durante esta semana, el cultivo se vuelve muy denso (hasta un 95% de densidad) y la viabilidad disminuye (hasta tan solo el 50%), lo que permite la máxima liberación de anticuerpos.
  2. Para la purificación de αDEC-205 del sobrenadante de cultivo, vierta la suspensión celular NLDC-145 (de ambas botellas de rodillos) directamente a botellas de centrifugación en autoclave de 500 ml.
    NOTA: Se debe recolectar un volumen total de 800 ml de cultivo.
    1. Centrifugar el cultivo durante 30 min a 8.600 x g y 4 °C para eliminar células y escombros.
    2. Recoger los sobrenadantes, desechar los pellets y agrupar los sobrenadantes en un frasco de reactivo estéril.
      NOTA: La purificación de αDEC-205 puede iniciarse inmediatamente (paso 2.) o el sobrenadante se puede almacenar a corto plazo a 4 °C.

2. Purificación del anticuerpo αDEC-205 del sobrenadante celular NLDC-145

NOTA: A partir del sobrenadante celular NLDC-145, la αDEC-205 se purifica utilizando una columna de proteína G Sepharose (reutilizable). Las dimensiones de la columna son de 15 mm x 74 mm y 5 ml de proteína G Sepharose se empaquetan por columna.

  1. Para la preparación y el lavado de la columna de proteína G Sepharose, coloque un tapón de goma hermético en la abertura superior de la columna de proteína G Sepharose. Pinche el tapón de goma con dos cánulas estériles (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
    1. Conecte una jeringa de 10 ml a una de las dos cánulas y un tubo de silicio flexible (aproximadamente 100 cm de largo, 2,5 - 3 mm de diámetro) con un conector de tubo a la segunda cánula.
      NOTA: La construcción de la jeringa / tapón de goma es reutilizable y proporciona un vacío que resulta en un flujo continuo del gran volumen de cultivo sobrenadante a la columna de proteína G Sepharose. Con este fin, tire ligeramente hacia atrás del émbolo de la jeringa para garantizar un flujo continuo de líquido en los siguientes pasos.
    2. Lave la columna con 50 ml de ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) para eliminar el anticuerpo potencialmente restante de cualquier purificación de anticuerpos anterior. Coloque el extremo del tubo de silicio en la botella de reactivo llena de ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M. Como resultado del vacío inducido, 50 ml del ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M corren a través de la columna de proteína G Sepharose.
      NOTA: 0,1 M de ácido acético glacial (pH 2) debe almacenarse en una botella de reactivo o recién llenado en un vaso de precipitados.
    3. Lave la columna con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 100-200 ml. Coloque el extremo del tubo de silicio en una botella de reactivo o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 100-200 ml de PBS corran gota a gota a través de la columna de proteína G Sepharose.
  2. Para la purificación de anticuerpos del sobrenadante NLDC-145, cargue 800 ml del sobrenadante NLDC-145 (obtenido del paso 1.2.2.) sobre la columna. Coloque el extremo del tubo de silicio en la botella de reactivo llena de sobrenadante NLDC-145. Deje que el sobrenadante NLDC-145 de 800 ml corra en sentido directo a través de la columna.
    1. Lavar la columna con 500 mL de PBS. Coloque el extremo del tubo de silicio en una botella de reactivo o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 500 mL PBS se ejecuten gota a gota a través de la columna.
    2. Para la elución, utilice 20 tubos de 1,5 ml y pipetee 100 μL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) en cada tubo de 1,5 ml. Retire el tapón de goma de la columna y pipete 1 ml de glicina 0.1 M (pH 3) a la cámara superior de la columna de proteína G Sepharose para eluir el anticuerpo de la columna. Recoja el flujo directamente como eluido en uno de los tubos preparados de 1,5 ml.
    3. Repita el paso de elución (2.2.2.) para los 20 tubos (1,5 ml).
    4. Determine la densidad óptica de todas las fracciones de elución a 280 nm (OD280)utilizando un espectrofotómetro para identificar las fracciones que contienen anticuerpos.
      NOTA: Utilice la primera fracción de elución como espacio en blanco.
    5. Agrupar todas las fracciones con un OD280 superior a 0,5 (aproximadamente 10 fracciones).
    6. Almacene la columna de proteína G Sepharose llena de etanol al 20% a 4 °C.
  3. Dializar las eluciones agrupadas contra PBS de 1000 ml (en un vaso de precipitados de 2000 ml) a 4 °C durante la noche utilizando tubos de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa.
    1. Cortar el tubo de diálisis en trozos de 20 cm. Hervir el tubo de diálisis en 500-800 ml de 10 mM EDTA (pH 7.5) durante 30 minutos en un vaso de precipitados utilizando una placa caliente para eliminar la contaminación. Deseche la solución de EDTA de 10 mM (pH 7.5) y hierva el tubo de diálisis en agua desionizada durante 10 min.
      NOTA: El tubo de diálisis se puede usar directamente o almacenar en solución de azida de sodio al 0,01% (NaN3)/H2O a 4 °C hasta el próximo uso.
    2. Cierre la parte inferior del tubo de diálisis con un cierre de tubo de diálisis apropiado / abrazadera con bisagras de una sola pieza y pipetee cuidadosamente la elución de anticuerpos en el tubo de diálisis. Cierre la parte superior del tubo de diálisis con una segunda abrazadera.
    3. Fije la abrazadera superior del tubo de diálisis a un soporte flotante, colóquela con una barra de agitación magnética en el vaso de precipitados lleno de PBS y coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético.
    4. Dializar durante la noche revolviendo a 4 °C.
  4. Para aumentar la concentración de αDEC-205, cargue el dializado completo en un concentrador centrífugo con 10 kDa MWCO. Abra una abrazadera del tubo y pipetee cuidadosamente el dializado completo del tubo de diálisis en el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
    NOTA: No toque la parte inferior del concentrador con la punta de la pipeta.
    1. Centrífuga durante 30 min a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C.
    2. Cargue el concentrador centrífugo con 10 ml de PBS y centrífuga a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C hasta que el volumen final de solución de anticuerpos restante sea de 1-1,5 ml.
      NOTA: Si es necesario, repita la etapa de centrifugación de 2.4.1. para ajustarse a la cantidad deseada.
    3. Utilizando un espectrofotómetro, determinar la densidad óptica de la solución concentrada de αDEC-205 a 280 nm (OD280). Utilice PBS como espacio en blanco.
    4. Calcule la concentración de αDEC-205 utilizando la siguiente fórmula:
      concentración [mg/mL] = OD280/1.4.
    5. Filtrar la solución αDEC-205 utilizando una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
      NOTA: La purificación de αDEC-205 del sobrenadante de células de hibridoma NLDC-145 también se puede lograr mediante FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas). La αDEC-205 purificada se puede almacenar a 4 °C o a -18 °C para su almacenamiento a largo plazo.

3. Conjugación química de OVA a αDEC-205

NOTA: Se requiere una proporción de 0,5 mg de proteína OVA a 2,5 mg de αDEC-205 (1:5) para una conjugación química óptima. Sin embargo, esta proporción puede variar para otras proteínas y anticuerpos y debe optimizarse para conjugados alternativos. La reducción de los enlaces disulfuro de la proteína OVA se realiza mediante incubación con 30 mM TCEP-HCl, que expone los grupos sulfhidrilo para la conjugación química a αDEC-205 y se necesitan 240 μl de TCEP-HCl en el paso 3.2. Ambos pasos, la reducción inducida por TCEP de OVA (paso 3.1.) y la activación sulfo-SMCC de αDEC-205 (paso 3.2.), deben realizarse preferiblemente en paralelo.

  1. Prepare recién una solución de TCEP-HCl de 125 mM (pH 7.0). Pesar la cantidad deseada de TCEP-HCl y disolver el TCEP-HCl en 0,9 M de base Tris (pH 8,8). Utilice tiras indicadoras de pH para probar el pH de la solución de TCEP-HCl de 125 mM (que debe ser neutra) y ajuste el pH con la base Tris (pH 8.8).
    1. Pipetear 200 μL de solución de proteína OVA (que contiene 0,5 mg de OVA) en un tubo estéril de 1,5 ml. Añadir 240 μl 125 mM de TCEP-HCl y 560 μL de agua ultrapura estéril a la proteína OVA utilizando una pipeta a una concentración final de 0,5 mg/mL de proteína OVA y 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg de OVA endogrado (liofilizado) se disuelve en 1 ml de PBS, lo que resulta en una solución de OVA de 2,5 mg/ ml.
    2. Incubar el OVA/TCEP-HCl resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h.
      NOTA: No extienda esta etapa de incubación.
  2. Para activar la αDEC-205 para la conjugación, disolver 2 mg de sulfo-SMCC en 100 μL de agua ultrapura.
    NOTA: Sulfo-SMCC es susceptible a la hidrólisis. Por lo tanto, se deben manipular rápidamente cantidades mayores de sulfo-SMCC no disuelto o se deben usar alícuotas de 2 mg disponibles.
    1. Diluir αDEC-205 en PBS para que 2,5 mg estén contenidos en 900 μL.
    2. Mezclar 2,5 mg de αDEC-205 (volumen de 900 μL; obtenido a partir del paso 3.2.1.) y 100 μL de sulfo-SMCC (obtenido a partir del paso 3.2.) en un tubo de 1,5 ml, lo que da como resultado un volumen total de 1 ml.
    3. Incubar la solución αDEC-205/sulfo-SMCC durante 30 min a 37 °C y 550 rpm en un bloque calefactor.
  3. Después de estas incubaciones, el exceso de sulfo-SMCC y TCEP-HCl se eliminan inmediatamente de las soluciones utilizando columnas de desalinización (MWCO 7 kDa; volumen de columna de 5 ml).
    1. Gire el cierre inferior de las columnas (MWCO 7 kDa), afloje la tapa y coloque la columna en un tubo cónico de 15 ml.
    2. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente para retirar el líquido.
    3. Coloque la columna en un tubo nuevo y retire la tapa. Cargue lentamente el anticuerpo/sulfo-SMCC y el OVA/TCEP-HCl, respectivamente, en el centro del lecho compacto de resina de una columna cada uno.
    4. Centrífuga durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Deseche las columnas después de su uso. Las soluciones que contienen anticuerpos y OVA preparadas para la conjugación están en los tubos.
    6. Mezclar inmediatamente ambas soluciones mediante pipeteo para la conjugación de αDEC-205 y OVA.
    7. Incubar la mezcla resultante de αDEC-205 y OVA durante la noche a 4°C.
  4. Después de la conjugación, el exceso de OVA no unido se elimina de la solución y el αDEC-205/OVA acoplado se concentra utilizando un concentrador de proteína centrífugo (MWCO 150 kDa).
    1. Enjuague previamente el concentrador centrífugo de proteínas (MWCO 150 kDa) mediante pipeteo de 12 ml de PBS en la columna y centrifugado durante 2 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
      NOTA: Si es necesario, repita el paso de centrifugación (3.4.1.) hasta que un volumen de aproximadamente 5 ml haya pasado a través de la columna.
    2. Antes de cargar la αDEC-205/OVA en el concentrador centrífugo de proteínas, guarde una muestra de 20 μL de la αDEC-205/OVA no concentrada para el análisis de western blot. Conservar esta alícuota a 4 °C hasta su análisis.
    3. Cargue la αDEC-205/OVA en el concentrador centrífugo de proteínas mediante pipeteo.
      NOTA: Evite cualquier contacto con el lecho de la cámara superior del concentrador centrífugo.
    4. Llene el concentrador a 15 ml con PBS y centrífique el concentrador durante 5 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Guarde una muestra del flujo a través (flujo a través de I) para el análisis de western blot y descarte el flujo restante.
    6. Llene el concentrador a 10 ml con PBS y centrifugue el concentrador durante al menos 8 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
    7. Guarde una muestra para el segundo flujo a través (flujo a través II) para el análisis de western blot y descarte el flujo restante.
    8. Una vez que se logra el enriquecimiento deseado (alrededor de 1,5 ml de la solución αDEC-205/OVA debe dejarse en la cámara superior), aspire suavemente la muestra concentrada.
      NOTA: Si queda demasiado líquido en la cámara superior, la centrifugación se puede repetir, pero debe mantenerse lo más corta posible.
  5. Determinar la concentración de proteínas de la αDEC-205/OVA resultante utilizando un espectrofotómetro de microvolumen. Utilice PBS como espacio en blanco.
  6. Filtre la αDEC-205/OVA utilizando una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
    NOTA: Para análisis posteriores y experimentos in vivo, αDEC-205/OVA se puede almacenar a 4 °C o -18 °C.

4. Verificación de la conjugación química por western blot

NOTA: Para la verificación de la conjugación química exitosa, se realiza un análisis de western blot que detecta OVA (4.2) o αDEC-205 (4.10). La detección de OVA (4.2.) o αDEC-205 (4.10.) debe realizarse en paralelo. Se debe utilizar preferiblemente un agitador de plataforma orbital para todas las etapas de incubación de las membranas de western blot para permitir una distribución uniforme de las respectivas soluciones.

  1. Preparar geles estándar de SDS al 10% (dodecil sulfato de sodio) para SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio).
  2. Prepare las muestras para SDS-PAGE para detectar OVA conjugados y no conjugados y ejecutar electroforesis en gel.
    1. Diluir diferentes cantidades de αDEC-205/OVA acoplado (por ejemplo, 200, 100 y 50 ng), de OVA puro (por ejemplo, 80, 70, 60, 50, 40 y 30 ng), una alícuota de αDEC-205 no conjugado (por ejemplo, 100 y 50 ng), una muestra de conjugado αDEC-205/OVA no concentrado del paso 3.4.2. (por ejemplo, 125 ng) y una alícuota de flujo a través de I y II (pasos 3.4.5. y 3.4.7., respectivamente; opcional) en 4 x tampón de muestra SDS no reductor.
      NOTA: Se cargan diferentes concentraciones de conjugado y proteína para garantizar que tanto el OVA libre como el conjugado se puedan detectar en la misma mancha.
    2. Desnaturalizar las muestras a 65 °C durante 10 min y 550 rpm en un bloque calefactor.
  3. Cargue las muestras y un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute SDS-PAGE.
  4. Realice la eliminación estándar de las proteínas del gel SDS a una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno) activada por metanol (75 min, 125 mA).
  5. Después de la secadura, coloque la membrana en un plato apropiado y bloquee la membrana pipeteando 25 ml de polvo de batido de reemplazo de comida al 4% / TBS-T (solución salina tamponada tris / 0.1% Tween 20) bloqueando el tampón en el plato que contiene la membrana.
    1. Incubar la membrana en la solución de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
  6. Deseche la solución de bloqueo y manche la membrana con el anticuerpo primario αOVA de conejo en polvo de batido de reemplazo de comida al 2% / tampón de anticuerpos TBS-T (dilución 1: 3,000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos primarios a la membrana en el plato.
    1. Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (use el agitador de plataforma).
  7. Deseche la solución de anticuerpos y lave la membrana en el plato (use el agitador de plataforma).
    1. Añadir 25 ml de TBS-T a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
    2. Añadir 25 ml de TBS-T/0,5 M de NaCl a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
    3. Añadir 25 ml de TBS-T/0,5% Triton X-100 a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
    4. Añadir 25 ml de TBS-T a la membrana e incubar durante 5 min. Deseche la solución.
  8. Teñir la membrana con el anticuerpo secundario de cabra αrabbit-IgG-HRPO (peroxidasa de rábano picante) en polvo de batido de reemplazo de comida al 2% / tampón de anticuerpos TBS-T (dilución 1: 2,000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos secundaria a la membrana en el plato.
    1. Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (en el agitador de plataforma).
  9. Lave la membrana de nuevo como se describe en el paso 4.7.1.- 4.7.4. utilizando el agitador de plataforma. Para esta membrana, continúe con el paso 4.16. (los siguientes pasos 4.10.- 4.15. (detección de αDEC-205) se puede realizar en paralelo a los pasos 4.2.- 4.9.).
  10. Prepare las muestras para la detección de αDEC-205 para SDS-PAGE y ejecute la electroforesis en gel.
    1. Diluir diferentes cantidades de αDEC-205/OVA (por ejemplo, 200, 100 y 50 ng), de la αDEC-205 no conjugada (por ejemplo, 250, 125, 62,5 ng), de OVA pura (por ejemplo, 80 y 70 ng), una muestra de αDEC-205/OVA no concentrada a partir de la etapa 3.4.2. (por ejemplo, 125 ng) y una alícuota de flujo a través de I y II (pasos 3.4.5. y 3.4.7., respectivamente; opcional) en 4 x tampón de muestra SDS no reductor.
    2. Desnaturalizar las muestras a 65 °C durante 10 min y 550 rpm en un bloque calefactor.
  11. Cargue las muestras y un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute la electroforesis en gel.
  12. Realice la eliminación estándar de las proteínas desde el gel SDS hasta una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno) activada con metanol (75 min, 125 mA).
  13. Después de la secadura, coloque la membrana en un plato apropiado y bloquee la membrana pipeteando 25 ml de tampón de bloqueo del 10% (leche en polvo / TBS-T) en el plato que contiene la membrana.
    NOTA: Las soluciones de bloqueo difieren entre la detección αDEC-205 y OVA (paso 4.5.).
    1. Incubar la membrana en la solución de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (utilizando el agitador de plataforma).
  14. Deseche la solución bloqueadora y manche la membrana con el anticuerpo αrat-IgG(H+L)-HRPO de cabra en un tampón de anticuerpos de leche en polvo al 5% /TBS-T (dilución 1:5.000) pipeteando 15 ml de solución de anticuerpos a la membrana del plato.
    NOTA: Los tampones de anticuerpos difieren entre la detección de αDEC-205 y la detección de OVA (pasos 4.6. / 4.8.).
    1. Incubar la membrana durante 45 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (utilizando el agitador de plataforma).
  15. Lave bien la membrana en el plato como se describe en los pasos 4.7.1.- 4.7.4. (use el agitador de plataforma).
  16. Utilice un reactivo de detección apropiado para desarrollar la señal HRP y detectar la quimioluminiscencia en una habitación oscura utilizando una película de rayos X o a través de un sistema de imágenes.

5. Verificación de la conjugación química por ELISA

  1. Realice ELISA para una mayor verificación de la conjugación química exitosa que resulta en αDEC-205 / OVA.
  2. Cubra una placa ELISA apropiada de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de anticuerpo αOVA de conejo 3 ng/μL en tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO3) pH 9,6 diluido en H2O).
    1. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
  3. Después del recubrimiento, lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, usando una lavadora ELISA.
  4. Bloquee la placa pipeteando 200 μL de tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) en cada pocillo de la placa e incube la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Diluir en serie αDEC-205/OVA (obtenido a partir del paso 3.6.) 1:2 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) para obtener diluciones que van desde 6 μg/mL hasta 93.8 ng/mL αDEC-205/OVA y agregar 100 μL/pocillo de estas cantidades decrecientes de αDEC-205/OVA a los pozos.
    1. Incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
  6. Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, usando una lavadora ELISA.
  7. Añadir 100 μL del anticuerpo de cabra αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (diluido a 1:2.000 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS)) a cada pocillo de la placa.
    1. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  8. Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, con una lavadora ELISA.
  9. Añadir 50 μL de sustrato HRPO a los pozos. Cuando observe una reacción de color claro, detenga la reacción mediante la adición de una solución de detención de 150 μl(1MH 2 SO4) por pozo.
  10. Después de 5 min, lectura de absorción a 450 nm utilizando un lector ELISA.

Resultados

La conjugación química de αDEC-205 a la proteína OVA utilizando este protocolo normalmente permitirá la generación eficiente de αDEC-205/OVA para enfoques de orientación de CC in vivo. Existen diferentes estrategias para verificar la técnica en sí y probar la funcionalidad del conjugado producido. El análisis de Western blot y ELISA se utilizan para verificar la conjugación exitosa y al mismo tiempo detectar OVA potencialmente libre(Figura 2).

Discusión

La conjugación química de un anticuerpo específico del receptor de endocitosis y un antígeno proteico proporciona un enfoque eficiente y, lo que es más importante, también flexible para la orientación in vivo de DC en modelos preclínicos de ratón. Con nuestro protocolo proporcionamos un enfoque eficiente para la conjugación exitosa del modelo de antígeno OVA a un anticuerpo IgG específico de DEC-205.

En nuestro protocolo, αDEC-205 se purifica a partir de una línea celula...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a S. Prettin la asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación Alemanes (HGF) que se proporcionó como parte de la Alianza Helmholtz "Inmunoterapia de Cánceres" (HCC_WP2b).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody buffer 2 %2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25Greiner Bio-One690175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75Greiner Bio-One658175we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175Greiner Bio-One661175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlThermo Fisher Scientific88532Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottlesNalgene525-2314PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)Roche/Merck12 015 200 01Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDaSERVA Electrophoresis44110Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plateThermo Fisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serumPAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1 mediumBiochrom/bioswisstecF 9061-01
milk powderCarl RothT145.2powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridomaATCCHB-290if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbuminHyglos (via BioVendor)321000EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottlesNunc In Vitro734-2394standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator stripsMerck109535pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 112-035-062obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)Jackson ImmunoResearch 112-035-068obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 111-035-045 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)Abcamab181688used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)OriGeneR1101used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose columnMerck/MilliporeP32965 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standardThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membraneMerck/MilliporeIPVH00010immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plugOmnilab5230217DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tubeOmnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fastwe have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)1M H2SO4
sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm Merck/MilliporeSLGV033RSMillex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 mlOmnilabDisposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulasB. BraunSterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-TTris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
tubing connectorOmnilabKleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

Referencias

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