Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Resumo

O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.

Resumo

A interrupção do filtro glomerular composto pelo endotélio glomerular, membrana glomerular do porão e podocitos, resulta em albuminúria. Os processos do pé podocyte contêm feixes de actina que se ligam a proteínas adaptadoras citoesquelletal, como a podocina. Essas proteínas adaptadoras, como a podocina, ligam a espinha dorsal do diafragma de fenda glomerular, como a nefrina, ao citoesqueleto de actina. Estudar a localização e função dessas e outras proteínas podocíticas é essencial para a compreensão do papel do filtro glomerular na saúde e na doença. O protocolo apresentado permite que o usuário visualize actina, podocina e nefrina em células com imagens de super resolução em um microscópio convencional. Primeiro, as células são manchadas com uma técnica convencional de imunofluorescência. Todas as proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas a um hidrogel inchado. Através da digestão com proteinase K, as proteínas estruturais são cortadas permitindo o inchaço isotropical do gel na última etapa. A diálise da amostra na água resulta em uma expansão de 4-4,5 vezes da amostra e a amostra pode ser imageda através de um microscópio de fluorescência convencional, tornando uma resolução potencial de 70 nm.

Introdução

Albuminúria é um parâmetro substituto de risco cardiovascular e resulta da interrupção do filtro glomerular¹. O filtro glomerular é composto do endotélio fenestrado, da membrana glomerular do porão e do diafragma cortado formado por podocitos. Processos primários e secundários de pés de podocitos envolvem a parede capilar do glomerulum². A estrutura delicada dos processos dos pés é mantida por feixes de actina cortical que também servem como âncoras para proteínas de diafragma de fenda múltipla e outras proteínas^{adaptadoras 2}. A proteína backbone do diafragma é chamada de nefrina e interage de forma homofílica com moléculas de nefetos de podocitos opostos. Através de diversas proteínas adaptadoras, a nefrina está ligada ao citoesqueleto de actina^2,3. Mutações no gene de codificação de nefrina NPHS1 levam à síndrome nefrótica do finlandês tipo⁴.

Uma das proteínas interativas de nefrina é a podocina, uma proteína semelhante ao grampo de cabelo da família estomatina³. Podocin recruta nefrina para jangadas lipídicas e a liga ao citoesqueleto de actina⁵. Podocina é codificado pelo gene NPHS2. Mutações no NPHS2 levam à síndrome nefrótica resistente a esteroides⁶.

Para visualizar e co-localizar proteínas adaptadoras de actina, podem ser utilizadas técnicas de imunofluorescência. Infelizmente, a barreira de difração da luz limita a resolução de microscópios convencionais de fluorescência para 200-350 nm⁷. Novas técnicas de microscopia, por exemplo, estimuladas pelo esgotamento das emissões (STED)^8,microscopia de localização ativada por foto (PALM)^9,microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM ou dSTORM) ou microscopia de exclusão de estado terrestre seguida pelo retorno individual da molécula (GSDIM)^9,10,11, permitem uma resolução de aproximadamente 10 nm. No entanto, essas técnicas de super resolução exigem microscópios altamente caros, pessoal bem treinado e, portanto, não estão disponíveis em muitos laboratórios.

A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica nova e simples que permite imagens de super resolução com microscópios convencionais e está potencialmente disponível para uma grande comunidade de pesquisa¹². Na microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM), a amostra de interesse (células ou tecidos) é fixa e manchada com fluoroforos¹³. As proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas por uma pequena molécula (6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl, AcX) em um hidrogel inchado¹³. Através da digestão enzimática com proteinase K (ProK), proteínas e fluoroforos mantêm sua posição relativa dentro do gel após a expansão¹³. Após o inchaço do gel, a amostra expande-se até 4,5 vezes (expansão volutiva de 90 vezes) levando a uma resolução lateral eficaz de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4.5). Modificações desta técnica podem até permitir uma expansão de 10 vezes (expansão volutiva de 1.000 vezes), tornando uma resolução de 20-30 nm nos microscópios convencionais^14,15,16.

Estruturas glomerulares de camundongos e rins humanos foram visualizadas via ExM¹⁷. Dentro deste artigo, apresentamos um protocolo proExM detalhado para visualizar imagens de super resolução de F-actin e podocina de proteína actina dentro das células usando um microscópio de fluorescência convencional.

Protocolo

1. Divisão e semeadura de células

1. Aqueça o Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco, incluindo soro de bezerro fetal de 10%, soro tamponado fosfato estéril (PBS) e trippsina estéril a 37 °C. Ative o banco limpo.
2. Prepare uma placa de 6 poços adicionando um deslizamento de tampa de vidro estéril (10 mm) a cada poço usando fórceps estéreis.
3. Coloque um prato de cultura celular de 10 cm com células Cos7 sob o banco limpo. Sob o banco limpo, aspire o meio das células usando um dispositivo de vácuo.
4. Segure o prato de cultura celular angulado em uma mão e adicione 10 mL de PBS estéril ao lado do prato de cultura celular para evitar enxaguar as células. Coloque o prato de cultura celular para baixo para que PBS enxague o prato de cultura celular completa.
5. Retire o PBS e adicione 1 mL de trippsina no meio do prato de cultura celular e incubar por 5 min a 37 °C.
6. Pare a reação de trippsinização adicionando 10 mL de DMEM incluindo 10% DE FCS e pipeta a solução celular para cima e para baixo com um pipettor para separar manualmente as células.
7. Analise o número do celular por mililitro usando uma câmara de contagem.
8. Sementes 68.000 células em 2 mL médio por poço sobre a tampa de vidro desliza na placa de 6 poços. Distribua as células dentro da placa de 6 poços agitando cautelosamente a placa horizontal e verticalmente.
   NOTA: As células devem estar espalhadas.
9. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂.

2. Transfecção de células

1. Prepare dois tubos estéreis de 1,5 mL (um para DNA diluído (A) e outro para reagente diluído para transfecção lipídica cônica (B)). Pipeta 0,75 μg de nefrina e 0,75 μg de expressão de podocina cDNA plasmid por poço em um tubo de 1,5 mL e diluí-lo em 100 μL de meio soro reduzido por poço. Adicione 3 μL de reagente de transfecção lipídica cationic por poço ao segundo tubo de 1,5 mL e diluir com 100 μL de meio soro reduzido. Incubar ambas as reações por 5 minutos à temperatura ambiente.
2. Combine ambas as reações (A e B) a um complexo de DNA-lipíde, e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Adicione cautelosamente 200 μL do complexo DNA-lipíde, a cada poço.
3. Incubar as células transfeinadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 h sem alterar o meio.

3. Imunolabelamento de estruturas celulares

1. Prepare uma solução de fixação (4% (w/v) paraformaldeído em PBS, 1 mL/well), a solução de permeabilização (0,5% (w/v) Triton X-100 em PBS, 1 mL/bem), e uma solução de bloqueio (5% (v/v) albumina de soro bovino na PBS, 1 mL/well).
2. Remova o meio com um dispositivo de vácuo. Adicione 2 mL de PBS a cada poço para remover o meio extra. Aspire completamente a PBS.
   NOTA: Para evitar lavar as células com PBS, certifique-se de pipetar PBS não na tampa do vidro escorregar diretamente.
3. Fixar células com paraformaldeído (FPF) de 4% (c/v) dissolvido em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Alternativamente, fixar células em 3% (v/v) glyoxal-etanol¹⁸.
4. Descarte pfa e lave células duas vezes em PBS (2 mL cada) evitando tubos diretos nos deslizamentos de tampa de vidro. Permeabilize as células fixas com Triton X-100 0,5% (w/v) em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
5. Remova a solução de permeabilização e lave duas vezes com PBS conforme indicado na etapa 3.2.
6. Bloqueie as células adicionando 1 mL de 5% (v/v) BSA no PBS por 1 h à temperatura ambiente. Incubar as células com 200 μL do anticorpo primário (anticorpo anti-podocina 1:200 em 1% (v/v) BSA em PBS) durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Alternativamente, incubar o anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.
7. Remova o anticorpo primário e lave três vezes com PBS como na etapa 3.2. Adicione o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra Alexa 488 1:1000 em 1% (v/v) BSA na PBS) por 1h à temperatura ambiente. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.
8. Descarte o anticorpo secundário e lave com PBS três vezes.
9. Remova o PBS e incuba as células com 200 μL de anticorpo anti-nefrina 1:100 em 1% (v/v) BSA em PBS por 1 h à temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.
10. Remova a PBS e incubar com o anticorpo secundário anti-cobaia 633, 1:200, por 1h em temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.

4. Microscopia de expansão

1. preparação
   1. Para formar os espaçadores para a câmara de gelação, corte a tampa de vidro desliza #1,0 e #1,5 em listras de 5 mm (quatro por lâmina de vidro) usando uma faca de diamante. Posicione as faixas de deslizamento de cobertura de #1,5 mm para que elas formem um quadrado de 2,5 cm de comprimento em um escorregador de vidro e coloque-as em uma câmara de coloração(Figura 2A1-C1). Pipeta uma gota de ddH₂O nos cantos da praça para aderir as faixas de deslizamento de tampa de vidro entre si e ao escorregador de vidro(Figura 2A2-C2).
      NOTA: Evite a secagem completa do ddH₂O, pois a força de adesão se perderá. Se necessário, aplique mais gotículas de ddH₂O. Aguarde aproximadamente 20 min para que os deslizamentos de cobertura de #1,5 mm sejam fixados com faca antes de começar com a etapa 4.1.2.
   2. Coloque quatro tiras de deslizamento de tampa de vidro #1.0 por deslizamento de tampa nos deslizamentos de cobertura de #1,5 mm. Adere as listras ao pipetar uma gotícula em cada faixa de deslizamento de cobertura de #1,5 mm(Figura 2A3-C3).
      NOTA: A espessura do gel deve ser de pelo menos 0,15 mm para facilitar o manuseio no andamento do protocolo. No entanto, para evitar o excesso de gel em cima das células, mantenha a altura dos espaçadores perto do substrato celular. Usando #1,5 e #1.0 como espaçadores, a altura dos espaçadores será de aproximadamente 0,3 mm. As células aderem ao vidro de cobertura (altura de 0,12 mm). Portanto, o gel será espesso o suficiente para manusear, mas o gel excessivo em cima das células é evitado usando #1,0 e #1,5 tampam listras de vidro como espaçadores.
   3. Para a tampa da câmara de gelação, enrole um copo de tampa (#1,5) com filme de parafina. Evite dobras ou sujeira no filme de parafina(Figura 2A5-C5).
2. Ancoragem e polimerização (gelação)
   1. Prepare o tampão de ancoragem (ver Tabela 1). Para tratamento de ancoragem, substitua o PBS por 250 μL de tampão de ancoragem por poço diretamente no deslizamento da tampa de vidro e incubar por 3h à temperatura ambiente. Mantenha o substrato no escuro usando uma caixa.
      NOTA: Alternativamente, incubar durante a noite à temperatura ambiente. Prepare um novo tampão de ancoragem para cada experimento e espere por 10-15 min até que seja dissolvido corretamente. 6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl (AcX) deve ser substituído a cada 4-5 meses para garantir a ancoragem adequada.
   2. Remova o tampão de ancoragem e lave uma vez com 1,5 mL PBS por poço.
   3. Para colorir as fibras de actina, descongele uma solução de fhalloidina compatível exM e incubar a faloidina (5 μL de phalloidin diluída em 195 μL de 1% (v/v) BSA em PBS/well) por 45 min à temperatura ambiente. Mantenha amostras no escuro usando uma caixa.
   4. Enquanto isso, dissolva o acrilato de sódio em ddH₂O usando um dispositivo de agitação. No gelo, prepare a solução monômero (ver Tabela 1).
      NOTA: O acrilato de sódio dissolvido deve ser uma solução clara e incolor. Se a solução for amarela, substitua-se por novo acrilato de sódio.
   5. Prepare a solução de gelagem no gelo (ver Tabela 1). Pipeta ammoniumperoxidsulfate (APS) na solução de gelagem logo antes da solução de gelagem ser aplicada na câmara de gelação.
   6. Remova a falooidina das células e lave com 1,5 mL de PBS duas vezes à temperatura ambiente. Deixe 1,5 mL PBS dentro do poço para facilitar a remoção da amostra no deslizamento da tampa do vidro.
   7. Coloque as células no vidro de cobertura na câmara de gelagem usando fórceps e uma cânula para levantar o deslizamento de vidro de cobertura da placa de 6 poços.
      NOTA: As células devem estar na parte superior do deslizamento da tampa do vidro. O deslizamento da tampa de vidro não deve tocar os espaçadores.
   8. Adicione APS à solução de gelagem e vórtice em breve. Pipeta 200 μL de solução de gelagem na amostra (Figura 2A4-C4). Feche cautelosamente a câmara de gelação evitando bolhas de ar dentro do gel (Figura 2A5-C5).
   9. Incubar a câmara de gelagem por pelo menos 1 h a 37 °C para polimerizar o gel na câmara de coloração molhada.
3. Homogeneização (digestão)
   1. Tire a câmara de coloração da incubadora. Para abrir a tampa da câmara de gelação, introduza uma lâmina de barbear entre a tampa e o espaçador. Remova a tampa com cautela. Remova os espaçadores com a lâmina de barbear e elimine todo o gel extra cortando-o com a lâmina de barbear.
   2. Coloque o slide com o gel e cubra o vidro em um prato cheio de PBS. Tremendo suavemente, remova o vidro de cobertura separado do gel. Para remover o gel do prato facilmente, coloque o slide abaixo do gel para fixar o gel ao slide.
   3. Com o gel no slide, divida o gel em pequenos pedaços (quarto do gel é dividido em duas a três peças) usando a lâmina de barbear. Empurre suavemente um pedaço de gel em um poço de uma placa de 6 poços com fundo de vidro e enfold-lo por um pincel. Mantenha o gel hidratado com um pouco de PBS usando o pincel para evitar a desidratação do gel.
      NOTA: As células enfrentam para baixo.
   4. Usando um microscópio invertido, faça imagens de visão geral com baixa abertura numérica para determinar o fator de expansão após a expansão.
   5. Prepare o tampão de digestão (ver Tabela 1). Diluir Proteinase K a 4 U/mL no tampão de digestão para receber a solução de digestão.
      NOTA: O tampão de digestão sem Proteinase K pode ser armazenado a 4 °C por 1-2 semanas.
   6. Adicione 500 μL da solução de digestão a cada poço e mergulhe o gel dentro da solução. Deixe digerir durante a noite à temperatura ambiente e feche a tampa mantendo as amostras no escuro.
      NOTA: Alternativamente, deixe digerir a 37 °C por 1h.
4. expansão
   1. Remova a solução de digestão com uma pipeta e descarte-a. Adicione 1 mL de ddH₂O. Incubar o gel imerso por 10 minutos à temperatura ambiente.
   2. Retire a água e adicione 1 mL de ddH_{fresco 2}O. Aguarde 10 min e continue trocando água a cada 10 minutos até que um platô de expansão seja atingido.
      NOTA: A expansão da amostra até 4,5 vezes é alcançável. O gel fica opticamente claro.
5. imagiologia
   1. Remova a água do gel e inicie diretamente a microscopia. Utilizando um microscópio invertido, utilize principalmente um objetivo de ar (baixa ampliação) para encontrar células imagens no estado de pré-expansão (etapa 4.3.4).
   2. Mude para um objetivo de 40x (óleo/água) e 63x para uma melhor resolução. Excite-se com o comprimento de onda de interesse e leve a imagem através da câmera.
6. validação
   1. Faça uma visão geral da amostra. Encontre e combine as mesmas estruturas dentro da amostra que foram imagens na etapa 4.3.4. Use o canal com a melhor relação sinal-ruído para validação(Figura 3 A-B).
      NOTA: Ajuste os parâmetros de imagem para obter brilho semelhante à da imagem adquirida no estado não expandido (etapa 4.3.4).
   2. Sobreposição de imagens pré e pós-expansão girando e mudando-as com ImageJ. Use a ferramenta de medição de distância no ImageJ para medir as distâncias entre estruturas claramente identificáveis. Meça pelo menos 10 estruturas diferentes.
      NOTA: Alternativamente, use um script Python para medir distâncias descritas em¹⁴.
   3. Calcule o fator de expansão dividindo as medições pós/pré-expansão.
   4. Para determinar distorções, tire imagens com maior abertura numérica(Figura 4A-B). Sobreponha essas imagens e analise-as com ImageJ ou conforme descrito em¹⁵.
      NOTA: A determinação de distorções deve ser realizada rotineiramente, mas não necessariamente em todas as amostras.

Resultados

O conceito e o tempo deste protocolo proExM são retratados na Figura 1. No dia 5, as células transfeinadas são fixas e manchadas com anticorpos fluorescentes voltados para a proteína de interesse (Figura 1A,B). No dia 6, o tratamento com AcX leva à formação de grupos de amina em todas as proteínas (incluindo fluoroforos) (Figura 1A,B)¹²

Discussão

O método apresentado permite ao pesquisador visualizar proteínas celulares, por exemplo, podocina, nefrina e componentes citoesqueletal, por exemplo, F-actin. Dentro deste protocolo, as células cos7 transfectadas são usadas como modelo para estudar a interação de proteínas de diafragma cortadas com F-actin. Infelizmente, as linhas celulares podocyte imortalizadas não expressam quantidades endógenas suficientes de proteínas de diafragma cortadas¹⁹.

Com este mé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available