このプロジェクトに機器とスペースを提供してくれたスタンフォード大学医学部の神経科学イメージングサービスに感謝します。この研究は、スタンフォードがん研究所とスタンフォード婦人科腫瘍学部門の学内資金、およびハンガリー国立研究開発イノベーションオフィスのGINOP-2.3.2-15-2016-00026、GINOP-2.3.3-15-2016-00030、NN129371、ANN135107によってサポートされました。

1. プラスミド構築
<ol><li>eGFP-mCherry1融合プローブの作製には、制限部位AgeIおよびBsrGIを用いてmCherry110を挿入したN1哺乳類細胞発現ベクター(材料の表を参照)を使用します。</li>
	<li>以下のオリゴヌクレオチドを使用して、終止コドンなしでeGFP11 を SalI-BamHI フラグメントとして増幅します:N末端プライマー5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG G...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

提示されたプロトコルは、共焦点顕微鏡によるアクセプターの感作放出の検出およびドナー分子の消光を使用してFRETを定量するための遺伝的に結合された1対1の蛍光タンパク質較正プローブの使用を詳述している。この方法は、異なる細胞内区画における生細胞の生理学的状況におけるタンパク質相互作用を評価するために適用することができる。空間分解能は、提示されたアルゴリズムを?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の顕微鏡ベースの分析により、生細胞内のタンパク質間の相互作用の評価が可能になります。これは、細胞内のどこで、どの細胞内コンパートメントで相互作用が起こるか、そしてこの相互作用が時間とともに変化するかどうかに関する情報を含む、空間的および時間的情報を提供する。
テオドール・フェルスターは1948年にFRETの理論的基礎を築きました1。FRETは、励起ドナーからアクセプター分子への無放射エネルギー伝達であり、分子の距離と遷移双極子の相対配向、およびドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルの重なりに依存します。エネルギー伝達率は、ドナー - アクセプター距離の6乗に反比例する。したがって、FRETは、1〜10nmの範囲の分子近接を測定するために使用することができる。
FRETは、ドナー分子の他の脱励起プロセスと競合し、アクセプターのいわゆるドナー消光および感作放出をもたらす。ドナー消光は放出されたドナー光子の数の減少であり、増感放出は放出された受容体光子の増加である。多くの顕微鏡FRET分析では、アクセプター光退色2、ドナー光退色2、またはアクセプター3のFRET増感光退色などの蛍光強度測定が使用されます。
ここでは、レシオメトリックFRETと呼ばれることが多いドナークエンチングおよびアクセプター感作発光4,5を使用してFRETを定量化するための段階的な実験プロトコルおよび数学的アルゴリズムが提示される。増感発光を近似する方法に関する多くのプロトコルが公開されているが、絶対FRET効率を定量化したものはほとんどない6、7、8、9。生細胞におけるFRET効率の定量化には、(i)蛍光タンパク質のクロストーク(スペクトルスピルオーバー、またはブリードスルー)と、(ii)顕微鏡セットアップの検出効率を決定する必要があります。クロストークは、蛍光色素の1つだけを発現する細胞をイメージングすることによって評価することができますが、ドナーおよびアクセプター蛍光の相対的な検出効率の評価はより複雑です。測定されたシグナルを生じさせるドナー分子とアクセプター分子の数の少なくとも比の知識が必要です。しかし、生細胞で発現する蛍光色素の数は細胞ごとに異なり、不明です。いわゆるα因子は、単一の励起ドナーおよびアクセプター分子からの相対的なシグナル強度を特徴付ける。この因子の知識は、蛍光タンパク質を用いた生細胞イメージング中に遭遇するような、受容体とドナーの分子比が変化するサンプルにおける定量的レシオメトリックFRET測定の前提条件です。1対1のドナー-アクセプター融合タンパク質をキャリブレーションプローブとして使用することで、α因子の測定が可能になり、ポジティブコントロールとしても機能します。この遺伝的に結合されたプローブは、未知の総量で細胞によって発現されるが、1対1の固定された既知の相対量で発現される。次のプロトコルは、1-to-1プローブの構築方法と、FRET効率の定量化に使用する方法を示しています。すべての数式を含むスプレッドシートは補足にあり、以下に概説するように、読者がそれぞれの列に独自の測定値を入力するために使用できます。
プロトコルはGFP-Cherryドナー/アクセプターペアを使用しますが、提示されたアプローチは他の任意のFRETペアで実行できます。 補足ファイル1 は、シアンとイエローのペアの詳細を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、励起ドナーからアクセプター分子へのエネルギーの無放射移動であり、分子の距離と配向、およびドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルの重なりの程度に依存します。FRETは、生細胞内のタンパク質の相互作用を経時的におよび異なる細胞内コンパートメントで研究することを可能にする。顕微鏡を使用してFRETを測定するためのさまざまな強度ベースのアルゴリズムが文献に記載されています。ここでは、アクセプターの感作放出およびドナー分子の消光の両方を測定することに基づいてFRET効率を定量化するためのプロトコルおよびアルゴリズムが提供される。生細胞中のレシオメトリックFRETの定量には、蛍光タンパク質のクロストーク(スペクトルスピルオーバー、またはブリードスルー)の決定だけでなく、顕微鏡セットアップの検出効率も必要です。ここで提供されるプロトコルは、これらの重要なパラメータを評価する方法を詳述しています。

図1は、ドナーチャネル、チャネル1(488、505〜530nm)、転送チャネル、チャネル2(488、>585nm)、およびアクセプターチャネル、チャネル3(561、>585nm)で得られた画像をそれぞれ示す。GFPのみ、チェリーのみ、GFPとチェリーを共発現し、GFP-Cherry融合タンパク質を発現する細胞の代表的な画像。GFP-Cherry融合タンパク質を発現するNRK細胞(陽性対照、図2A)およ?...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

2つの蛍光色素分子間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用の研究に使用できます。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してアクセプターの感作放出およびドナー分子の消光を検出することによって、生細胞中のFRETを測定する方法に関するプロトコルが提供される。

FRET感作発光を伴う生細胞におけるタンパク質相互作用の評価(英語)

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

このプロトコルは、ドナー消光およびアクセプター感作放出を使用してFRETを定量化するための段階的な実験プロセスおよび数学的アルゴリズムを記述する。生細胞におけるFRET効率を定量するには、蛍光タンパク質のクロストークと、顕微鏡セットアップにおける蛍光色素の相対発光および検出効率を決定する必要があります。クロストークは、1つの蛍光色素のみを発現する細胞をイメージングすることによって評価できます。ドナーまたはアクセプター分子の検出効率の評価には、測定シグナルを生じさせるドナー分子とアクセプター分子の数の比率に関する知識が必要です。生細胞で発現する蛍光色素の数は細胞ごとに異なり、不明です。この方法で使用される較正プローブは、1対1のドナー・アクセプター融合タンパク質であり、ドナーおよびアクセプター分子の相対的な検出効率を決定することを可能にする。まず、EGFP mCherry 1融合プローブを生成するために、mCherry 1を含むN1哺乳動物細胞発現ベクターを使用します。終止コドンを持たないEGFPを細胞1つのBAM h1フラグメントとして増幅するオリゴヌクレオチドを設計する。緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の間の5つのアミノ酸リンカーは、GFPチェリードナー-アクセプターペアの平均FRET欠損を0.25〜0.3に生じるはずです。フェノールレッドを含まない細胞株と培地を使用して、バックグラウンド蛍光を低減します。細胞が80%コンフルエントになったら、1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAでそれらを剥離し、5ミリリットルの細胞懸濁液から3滴を加えて、約10, 000個の細胞を8ウェルプレートの各ウェルに播種します。プレーティングの24時間後、適切なトランスフェクション培地を用いて細胞をトランスフェクトします。生細胞イメージングの前に細胞を20時間インキュベートして、適切な蛍光タンパク質の発現、折り畳み、成熟を可能にします。共焦点走査型顕微鏡を用いて、摂氏37度で加湿および加熱された環境チャンバー内の細胞を画像化します。生理的pHで細胞培地を緩衝するには、20ミリモルのHEPESを添加して、細胞培地を二酸化炭素に依存しないようにします。次に、スライドを顕微鏡に取り付けます。アルゴンイオンレーザーの488ナノメートルラインを使用してGFPを励起し、561ナノメートルのダイオードレーザーを使用してチェリーを励起します。チャネル1から505〜530ナノメートルの発光帯を介して励起用に488ナノメートルのレーザーをセットアップし、585ナノメートルを超えるロングパスフィルターを使用してチャネル2に励起します。585ナノメートルを超えるロングパスフィルターを備えたチャネル3での励起には、561ナノメートルのレーザーを使用します。2つのレーザーを順番に励起し、各ラインの後にイメージングモードを切り替えて、各ラインの後に512 x 512ピクセルの画像の励起が交互になるように設定します。3つの画像のミニ時系列を設定して、著しい光退色が発生するかどうかを検出し、必要に応じてレーザー出力を減らします。まず、GFPチェリー融合構築物を発現する細胞を画像化する。共焦点画像のピクセルあたりの時間積分レーザー強度を定義するパラメーターを設定します。63倍のオイル対物レンズを使用し、3倍に設定したズームを使用して、十分な倍率と解像度でセル全体を画像化します。70〜80ナノメートルのピクセルサイズを目指します。ピクセル滞留時間を2〜4マイクロ秒に設定し、488ナノメートルおよび561ナノメートルレーザーのAOTF伝送により、画像が漂白や蛍光強度の飽和を示すピクセルなしで良好な信号対雑音比を示すようにします。チャンネル1とチャンネル3の信号レベルが等しくなるように、488と561のレーザー出力を調整します。写真乗数ゲインを600〜800に設定します。画像15〜20は、GFPを発現する細胞、サクランボ融合タンパク質を発現する細胞、サクランボ、GFPおよびチェリー、および非トランスセクテッド細胞である。次に、GFPおよびチェリーにそれぞれ結合した目的のタンパク質を共発現する細胞を画像化する。FRETを計算するには、チャネル1、488ナノメートルの励起と505〜530ナノメートルの発光バンドを持つドナーチャネルのドナー信号を測定します。次に、チャネル3のアクセプターシグナル、561ナノメートル以上の励起および585ナノメートルでの発光を伴うアクセプターチャネルを測定します。最後に、チャネル2、つまり488ナノメートルの励起と585ナノメートル以上での発光を伴う転送チャネルのFRET信号を測定します。チャネル2の信号は、4つの異なる成分の合計です:消光されたドナー信号からクロストーク係数S1による585を超える検出チャネルへのスペクトルスピルオーバー、クロストーク係数S2による488ナノメートルの光による直接励起からのアクセプター信号、励起されたドナー分子からのFRETによるアクセプターの感作放出、 とバックグラウンド信号。得られた画像は、ドナーチャネル、トランスファーチャネル、およびアクセプターチャネルにおいて得られた、GFPのみを発現する細胞、チェリーのみ、GFPおよびチェリーを共発現する細胞、ならびにGFPチェリー融合タンパク質が示されている。GFPチェリー融合タンパク質を発現するNRK細胞およびGFPチェリーを共発現するNRK細胞で計算された平均細胞FRET効率を、各細胞における受容体対ドナー比強度比または分子比に対してプロットします。GFPチェリー融合タンパク質を発現し、ネガティブコントロールとしてGFPとチェリーを共発現し、アシュウェル・モレル受容体の受容体サブユニットを発現する細胞のピクセルごとの正規化されたFRET画像をここに示す。ラット肝レクチンのRHL1および2は、原形質膜の細胞質側にGFPおよびチェリーで標識された。GFP RHL1およびチェリーRHL2およびGFP RHL1デルタストックおよびチェリーRHL2を発現する細胞の平均細胞FRET効率を、受容体対ドナー分子比に対してプロットした。提示された定量的FRETアプローチは、以下を可能にする。生細胞の生理学的状況におけるタンパク質相互作用の検出。時間の経過に伴うタンパク質相互作用の変化。共焦点画像のピクセルレベルまでの細胞内コンパートメントでの相互作用の違い。検出されたFRETシグナルの生細胞で発現した分子受容体対ドナー比への依存性を示す。