Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

Résumé

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) entre deux molécules de fluorophore peut être utilisé pour étudier les interactions protéiques dans la cellule vivante. Ici, un protocole est fourni sur la façon de mesurer FRET dans les cellules vivantes en détectant l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Résumé

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est le transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance et de l’orientation des molécules ainsi que de l’étendue du chevauchement entre les spectres d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur. FRET permet d’étudier l’interaction des protéines dans la cellule vivante au fil du temps et dans différents compartiments subcellulaires. Différents algorithmes basés sur l’intensité pour mesurer FRET à l’aide de la microscopie ont été décrits dans la littérature. Ici, un protocole et un algorithme sont fournis pour quantifier l’efficacité FRET basée sur la mesure à la fois de l’émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe de la molécule donneuse. La quantification du FRET ratiométrique dans la cellule vivante nécessite non seulement la détermination de la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes, mais aussi l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Le protocole fourni ici détaille comment évaluer ces paramètres critiques.

Introduction

L’analyse par microscopie du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) permet d’évaluer les interactions entre les protéines dans les cellules vivantes. Il fournit des informations spatiales et temporelles, y compris des informations sur l’endroit de la cellule et dans quel compartiment subcellulaire l’interaction a lieu et si cette interaction change au fil du temps.

Theodor Förster a posé les bases théoriques du FRET en 1948¹. FRET est un transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance des molécules et de l’orientation relative de leurs dipôles d....

Protocole

1. Construction plasmidique

1. Pour générer la sonde de fusion eGFP-mCherry1, utiliser un vecteur d’expression cellulaire de mammifère N1 (voir le tableau des matériaux) avec mCherry1¹⁰ inséré à l’aide des sites de restriction AgeI et BsrGI.
2. Utiliser les oligonucléotides suivants pour amplifier eGFP¹¹ sans codon stop comme fragment SalI-BamHI : amorce N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' et amorce C-terminale 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
3. Insérez ce fragment SalI-BamHI dans le site de clonage....

Résultats

La figure 1 montre les images obtenues respectivement dans le canal donneur, canal 1 (488, 505-530 nm), le canal de transfert, canal 2 (488, >585 nm) et le canal accepteur, canal 3 (561, >585 nm). Images représentatives de cellules exprimant uniquement la GFP, la cerise uniquement, co-exprimant la GFP et la cerise, et exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry. Les efficacités cellulaires moyennes du FRET calculées dans les cellules NRK exprimant la prot?.......

Discussion

Le protocole présenté détaille l’utilisation de la sonde d’étalonnage de protéines fluorescentes un à un génétiquement couplé pour quantifier FRET en utilisant la détection de l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer les interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante dans différents compartiments subcellulaires. La résolution spatiale peut être encore amé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081