FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

요약

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

초록

Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 여기된 기증자에서 수용체 분자로 에너지를 방사선 없이 전달하는 것이며 분자의 거리와 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침 정도에 따라 달라집니다. FRET를 사용하면 시간이 지남에 따라 살아있는 세포와 다른 세포 내 구획에서 단백질의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 현미경을 사용하여 FRET를 측정하는 다양한 강도 기반 알고리즘이 문헌에 설명되어 있습니다. 여기서, 수용체의 감작된 방출과 공여체 분자의 담금질 모두를 측정하여 FRET 효율을 정량화하기 위한 프로토콜과 알고리즘이 제공됩니다. 살아있는 세포에서 비율계량 FRET의 정량화는 형광 단백질의 누화(스펙트럼 유출 또는 블리드 스루)의 측정뿐만 아니라 현미경 설정의 검출 효율도 필요로 합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 이러한 중요한 매개 변수를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

서문

Förster 공명 에너지 전달(FRET)의 현미경 기반 분석을 통해 살아있는 세포에서 단백질 간의 상호 작용을 평가할 수 있습니다. 그것은 세포 내 어디에 있고 어떤 세포 내 구획에서 상호 작용이 일어나는지, 그리고 이 상호 작용이 시간이 지남에 따라 변하는지에 대한 정보를 포함하여 공간 및 시간 정보를 제공합니다.

Theodor Förster는 1948년 FRET의 이론적 토대를 마련했습니다¹. FRET는 여기 된 기증자에서 수용체 분자로의 무방사선 에너지 전달이며 분자의 거리와 전이 쌍극자의 상대적 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침에 따라 달라집니다. 에너지 전달 속도는 도너-수용체 거리의 6승에 반비례합니다. 따라서 FRET는 1-10nm 범위의 분자 근접성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

FRET는 기증자 분자의 다른 여기 제거 과정과 경쟁하여 수용체의 소위 기증자 담금질 및 감작 방출을 초래합니다. 도너 담금질은 방출된 도너 광자의 수를 감소시키는 반면, 감응 방출은 방출된 수용체 광자의 증가입니다. 많은 현미경 FRET 분석은 수용체 광표백², 기증자 광표백

프로토콜

1. 플라스미드 구성

1. eGFP-mCherry1 융합 프로브를 생성하기 위해, 제한 부위 AgeI 및 BsrGI를 사용하여 mCherry1¹⁰이 삽입된 N1 포유동물 세포 발현 벡터(재료 표 참조)를 사용합니다.
2. 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 정지 코돈 없이 eGFP¹¹ 을 SalI-BamHI 단편으로 증폭합니다: N-말단 프라이머 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G G 3' 및 C-말단 프라이머 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
3. 이 SalI-BamHI 절편을 N1 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 녹색 형광 단백질과 적색 형광 단백질 사이에 RNPPV 링커(5개의 아미노산) 링커를 도입한다.
   참고: 이 링커는 약 0.25 -0.3의 GFP-Cherry 기증자-수용체 쌍에 대한 평균 FRET 효율을 산출합니다(그림 1A). 측정된 FRET 효율을 측정하기 위해 다양한 길이의 뻣뻣한

결과

도 1은 공여 채널, 채널 1 (488, 505-530 nm), 전달 채널 2 (488, >585 nm) 및 수용체 채널 채널 3 (561, >585 nm)에서 각각 획득된 이미지를 보여준다. GFP만 발현하는 세포, Cherry만 발현하는 세포, GFP와 Cherry를 동시에 발현하는 세포, GFP-Cherry 융합 단백질을 발현하는 세포의 대표 이미지. GFP-Cherry 융합 단백질을 발현하는 NRK 세포(양성 대조군, 그림 2A

토론

제시된 프로토콜은 수용체의 민감 방출 검출 및 공초점 현미경에 의한 기증자 분자의 소멸을 사용하여 FRET를 정량화하기 위한 유전적으로 결합된 일대일 형광 단백질 보정 프로브의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 서로 다른 세포 내 구획에 있는 살아있는 세포의 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다. 공간 해상도는 제시된 알고리즘을 적용하여 이미.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081