Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением

Резюме

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между двумя молекулами флуорофора может быть использован для изучения белковых взаимодействий в живой клетке. Здесь представлен протокол о том, как измерять FRET в живых клетках путем обнаружения сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Аннотация

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.

Введение

Анализ резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе микроскопии позволяет оценить взаимодействия между белками в живых клетках. Он предоставляет пространственную и временную информацию, включая информацию о том, где в клетке и в каком субклеточном компартменте происходит взаимодействие, и изменяется ли это взаимодействие с течением времени.

Теодор Фёрстер заложил теоретическую основу FRET в 1948 году¹. FRET представляет собой безрадиационную передачу энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния между молекулами и относительной ориентации их переходных диполей, а также от перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. Скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния донор-акцептор. Таким образом, FRET можно использовать для измерения молекулярной близости в диапазоне 1-10 нм.

FRET конкурирует с другими процессами девозбуждения молекулы-донора и приводит к так называемому донор-гашению и сенсибилизированному излучению акцептора. Донорное гашение — это уменьшение количества испускаемых фотонов-доноров, в то время как сенсибилизированное излучение — увеличение испускаемых акцепторных фотонов. Во многих микроскопических анализах FRET используются измерения интенсивности флуоресценции, включая акцепторное фотообесцвечивание 2, донорское фотообесцвечивание² или FRET-сенсибилизированное фотообесцвечивание акцептора³.

Здесь представлен пошаговый экспериментальный протокол и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорного гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения^4,5, метода^, часто называемого ратиометрическим FRET. Было опубликовано много протоколов о том, как аппроксимировать сенсибилизированное излучение, лишь немногие количественно определили абсолютную эффективность FRET 6,7,8,9. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения (i) перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, а также (ii) эффективности обнаружения микроскопической установки. В то время как перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один из флуорофоров, оценка относительной эффективности обнаружения донорской и акцепторной флуоресценции является более сложной. Это требует знания, по крайней мере, соотношения числа молекул-доноров и акцепторов, порождающих измеряемые сигналы. Однако количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Так называемый фактор α характеризует относительную силу сигнала от одной возбужденной молекулы-донора и акцептора. Знание фактора является необходимым условием для количественных измерений коэффициентометрического FRET в образцах с переменным отношением акцепторных и донорных молекул, как это происходит во время визуализации живых клеток флуоресцентными белками. Использование белка слияния донора-акцептора 1 к 1 в качестве калибровочного зонда позволяет определить фактор α, а также служит положительным контролем. Этот генетически связанный зонд экспрессируется клетками в неизвестных общих количествах, но в фиксированном и известном относительном количестве один к одному. В следующем протоколе изложено, как построить зонд 1-к-1 и как использовать его для количественной оценки эффективности FRET. Электронная таблица, включающая все формулы, может быть найдена в приложении и может использоваться читателями для ввода своих собственных измерений в соответствующие столбцы, как указано ниже.

В то время как протокол использует пару донор/акцептор GFP-Cherry, представленный подход может быть выполнен с любой другой парой FRET. Дополнительный файл 1 содержит подробную информацию о голубо-желтых парах.

протокол

1. Плазмидная конструкция

1. Для генерации зонда слияния eGFP-mCherry1 используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 (см. Таблицу материалов) со вставленным mCherry1¹⁰ с использованием сайтов рестрикции AgeI и BsrGI.
2. Используйте следующие олигонуклеотиды для амплификации eGFP¹¹ без стоп-кодона в виде фрагмента SalI-BamHI : N-концевой праймер 5'-AAT, TAA, CAG, TCG, ACG, ATG, GTG, AGC, AGC, AGC, GAG G, 3' и C-концевой праймер 5'-AAT, ATA, TGG, ATC, CCG, CTT, GTA, CGT, CTC, CAT, GC 3'.
3. Вставьте этот фрагмент SalI-BamHI в сайт множественного клонирования вектора N1, чтобы ввести линкер RNPPV (пять аминокислот) линкер между зеленым и красным флуоресцентным белком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот линкер дает среднюю эффективность FRET для пары донор-акцептор GFP-Cherry около 0,25-0,3 (рис. 1A). Выбор жестких¹² и спиральных¹³ линкеров различной длины для масштабирования измеренной эффективности FRET обсуждался в другом месте, но не требуется для нашей цели слияния белка. Для простоты мы будем называть флуоресцентные белки «GFP» и «Cherry».

2. Культивирование клеток и трансфекция

1. Используйте любую клеточную линию, например, клетки NRK, для экспериментов FRET в средах, например, модифицированных средах Дульбекко Игла (DMEM), без фенольного красного, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. По этой же причине рекомендуется использовать свободный трипсин фенола.
2. После того, как клетки слились на 80%, отделите клетки с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, подсчитайте количество клеток в суспензии с помощью камеры Нойбауэра и засейте около 10 000 клеток в лунку 8-луночного покровного стекла; в качестве альтернативы, из сливной клеточной культуры, выращенной в колбе Т25, используют 1 каплю клеточной суспензии из пипетки объемом 2 мл или 3 капли из суспензии клеток объемом 5 мл из сливной культуры, выращенной в колбе для культуры Т25.
3. Выращивайте клетки в 8-луночных камерах (0,8 см 2 / лунка) с покровным стеклом #1,0 для флуоресцентной микроскопии живых клеток в стандартных условиях культивирования клеток (37 ° C и 5% CO²).
4. Через 24 часа после нанесения покрытия трансфицируют клетки, используя соответствующую коммерчески доступную среду для трансфекции (см. Таблицу материалов) смесью GFP, Cherry, GFP/Cherry (смесь 1:1, т.е. 0,8 мкг и 0,8 мкг GFP и плазмидной ДНК вишни) и химерой GFP-Cherry.
   1. Для трансфекции используют 5 мкл реагента для трансфекции в 45 мкл DMEM и 1,6 мкг плазмидной ДНК. Перемешайте, осторожно щелкнув пробирку микроцентрифуги.
   2. После 15-минутной инкубации смеси при комнатной температуре добавляют по 1-2 мкл смеси трансфекционных реагентов в каждую лунку 8-луночного предметного стекла. Верните камерное покровное стекло в инкубатор.
5. Пусть пройдет 20 ч после трансфекции перед визуализацией живых клеток, чтобы обеспечить надлежащую экспрессию, сворачивание и созревание флуоресцентного белка, особенно красного флуорофора.

3. Визуализация FRET

1. Изображение трансфицированных клеток в увлажненной и нагретой камере окружающей среды при 37 ° C. Чтобы буферизовать клеточную среду при физиологическом pH, используйте газ CO₂, установленный на поток 5%, или добавьте 20 мМ HEPES, чтобы сделать клеточную среду CO 2-независимой.
2. Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Установите возбуждение и излучение следующим образом, чтобы оптимизировать сигнал и свести к минимуму перекрестные помехи.
   1. Используйте линейку аргоново-ионного лазера с длиной волны 488 нм для возбуждения GFP и твердотельный лазер с диодной накачкой 561 нм (или гелий-неоновый лазер с длиной волны 543 нм, в зависимости от доступных лазерных линий), чтобы возбудить Cherry.
   2. Установите следующее в программном обеспечении коммерческого конфокального микроскопа. Установите Dichroic зеркало на 488/561 нажатием кнопки с помощью выпадающего меню. Собирают флуоресценцию с помощью лазерного излучения с длиной волны 488 нм для возбуждения в канале 1 через полосу излучения 505 - 530 нм (или 505 - 550 нм) и в канале 2 с фильтром длинных частот >585 нм и используют лазерный свет 561 нм для возбуждения в канале 3 с фильтром длинных частот > 585 нм (тип по длинам волн). Также могут использоваться полосовые фильтры, например, 590 - 650 нм или аналогичные, которые имеют то преимущество, что исключают рамановское рассеяние.
3. Возбуждайте двумя лазерами последовательно и установите режим визуализации на Switch после каждой строки , чтобы возбуждение изображения размером 512 x 512 пикселей чередовалось после каждой строки (а не после каждого кадра, что свело бы на нет возможность обнаружения FRET из-за диффузии меченых белков при записи изображений с различными возбуждениями; нажатие кнопки).
4. Настройте мини-временную серию из трех изображений нажатием кнопки, чтобы определить, происходит ли значительное фотообесцвечивание, и потенциально уменьшить мощность лазера. Фотообесцвечивание менее 1% является оптимальным. Высокая интенсивность лазера также может привести к насыщению поглощения, снижая кажущуюся эффективность FRET¹⁴. Мощность лазера до 10-20 мкВт, измеренная на линзе объектива, безопасна в использовании.
5. Во-первых, ячейки изображения, экспрессирующие конструкцию слияния GFP-Cherry. Установите параметры, определяющие интегрированную по времени интенсивность лазера на пиксель в конфокальном изображении, т. е. время выдержки пикселя в микросекундах, пропускание акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF) в процентах и зум.
   1. Ячейки изображения с использованием 63-кратного масляного объектива и 3-кратного увеличения . Это обеспечивает достаточное увеличение и разрешение для изображения ячеек целиком. Стремитесь к размеру пикселя 70-80 нм.
   2. Установите время выдержки пикселя на 2-4 мкс и передачу AOTF для лазера с длиной волны 488 нм и 561 нм, чтобы изображения имели хорошее соотношение сигнал/шум без обесцвечивания и без пикселей, показывающих насыщенность интенсивностью флуоресценции. Выгодно отрегулировать мощность лазера 488 и 561 таким образом, чтобы уровни сигнала в канале 1 и канале 3 были одинаковыми.
   3. Установите коэффициент усиления фотоумножителя (режим усреднения) на 600-800.
6. Изображение с этими настройками 15-20 клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry. 15-20 ячеек обеспечивают хорошую статистику, сохраняя при этом общее время сеанса измерения FRET ограниченным несколькими часами, чтобы обеспечить стабильность микроскопической установки.
7. Изображение с одинаковыми настройками ячеек, выражающих GFP, Cherry, GFP и Cherry и нетрансфицированных ячеек. Поиск экспрессирующих ячеек в зеленом или красном канале соответственно.
8. Затем сфотографируйте 15-20 клеток, совместно экспрессирующих интересующие белки, связанные с GFP и Cherry соответственно. При поиске экспрессирующих клеток избегайте длительного воздействия на клетки, чтобы не обесцвечивать флуоресцентные белки. Вишня имеет более низкую фотостабильность, чем GFP, и отбеливание вишни, акцептор ставит под угрозу анализ FRET.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спектры поглощения и излучения GFP и Cherry показаны на дополнительном рисунке 1. После измерения в течение 5-6 часов рекомендуется повторить визуализацию нескольких клеток, экспрессирующих химеру GFP-Cherry в конце сеанса визуализации, чтобы документально подтвердить, что установка оставалась стабильной и обнаруженная эффективность FRET слитого белка GFP-Cherry существенно не изменилась в ходе сеанса визуализации.

4. Анализ изображений для определения абсолютной эффективности FRET с использованием донорского гашения и сенсибилизированного излучения

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приведено практическое пошаговое руководство о том, как определить эффективность FRET с помощью прилагаемой электронной таблицы (Дополнительный файл 2). С теорией и выводом представленных уравнений можно подробно ознакомиться в предыдущих публикациях 4,15,16,17. При описанных настройках собираются следующие интенсивности флуоресценции.

1. Измерьте донорный сигнал I 1 в канале ₁, донорском канале, с возбуждением 488 нм и полосой излучения 505-530 нм.
   
   где _{I D} - непогашенный донорский сигнал в канале 1, который был бы измерен в отсутствие акцептора, - средняя эффективность FRET, а B 1 - средний фоновый сигнал в канале ₁.
2. Измерьте акцепторный сигнал I 3 в канале ₃, канале акцептора, с возбуждением и излучением 561 нм на длине волны >585 нм.
   
   где _{I A} — акцепторный сигнал, а B 3 — фон в канале ₃.
3. Измерьте сигнал FRET в канале 2, канале передачи, с возбуждением и излучением 488 нм на длине волны >585 нм.
   
   Где, сигнал в канале 2 представляет собой сумму четырех различных компонентов: (i) I_D(1 - E)S 1 - спектральный перетек из погашенного сигнала-донора в канал детектирования >585 (с коэффициентом перекрестных помех S ₁), (ii) _{I A} S 2 является акцепторным сигналом от прямого возбуждения светом с длиной волны 488 нм (с коэффициентом перекрестных помех S₂), (iii) _{I D Eα} представляет собой сенсибилизированное излучение акцептора FRET от возбужденной молекулы-донора (α будет подробно описано в 4.8 - 4.10.), и (iv) B₂ - фоновый сигнал.
4. Измерение средней интенсивности фона в каналах 1, 2, 3 в нетрансфицированных или имитационных трансфицированных клетках; И то, и другое нормально с незначительной разницей. Для всех измерений клеток используйте инструмент «свободная рука», чтобы очертить интересующие области и избежать перинуклеарных везикул с повышенной автофлуоресценцией. Важно избегать значительной аутофлуоресценции от этих перинуклеарных везикул.
   1. Введите измерения в столбцы X, Y и Z предоставленной электронной таблицы. Средняя интенсивность фона в 3 каналах вводится в A2, B2 и C2 электронной таблицы Excel (дополнительный файл 2).
5. Измерьте среднюю интенсивность в каналах 1, 2, 3 клеток, экспрессирующих только GFP или Cherry, и введите измерения в столбцы C, D, E и N, O, P. Соответствующие фоновые интенсивности вычитаются (в F, G, H и Q, R, S).
6. Чтобы рассчитать E, эффективность FRET, определите коэффициенты перекрестных помех S ₁ и S₂. Спектральный коэффициент перекрестных помех S₁ рассчитывается из клеток, экспрессирующих только GFP
   
   в столбце I. Введите среднее значение для S₁ в ячейку D2 электронной таблицы Excel.
7. Рассчитайте спектральный коэффициент перекрестных помех S₂ из ячеек, экспрессирующих только Cherry
   
   в столбце T. Введите среднее значение для S₂ в ячейку E2 электронной таблицы Excel.
8. Убедитесь, что коэффициент α связывает сигнал от любого заданного числа возбужденных молекул GFP в канале 1 с сигналом равного числа возбужденных молекул Cherry в канале 2 и определяется формулой
      
   где Q _A и Q_D - квантовые выходы флуоресценции вишни и GFP; η_A и _{η D} эффективность детектирования акцепторной и донорной флуоресценции в каналах 2 и 1 соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фактор α может быть определен по двум образцам, экспрессирующим известные абсолютные количества GFP и вишни. Однако невозможно узнать точное количество GFP и вишни, экспрессируемых в клетке. Поэтому мы рассчитали фактор с помощью клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry. Здесь, хотя абсолютное количество до сих пор неизвестно, известно, что соотношение молекул-доноров и акцепторов равно единице.
9. Измерьте среднюю интенсивность в каналах 1, 2, 3 клеток, экспрессирующих слитый белок GFP-Cherry, и введите измерения в столбцы AE, AF, AG. Интенсивность фона вычитается (в AH, AI, AJ).
10. Рассчитайте коэффициент α (столбец AJ) по интенсивности флуоресценции в каналах 1, 2 и 3 белка слияния GFP-Cherry следующим образом:
    
11. Интенсивности с поправкой на фон, измеренные в каналах 1 (I 1 - B ₁), 2 (I 2 - B ₂) и 3 (I 3 - B₃), соответственно, измеряются с использованием химеры GFP-Cherry. Фактор спектральных перекрестных помех S₁ определяли с использованием клеток, экспрессирующих только GFP (см. 4.7.). ε^D и ε ^A являются коэффициентами экстинкции GFP, донора, и вишни, акцептора, при 488 нм и могут быть определены из литературы (ε ^GFP = 53 000 М-1 см-1)¹⁸ и кривой поглощения вишни (ε^Cherry ≈ 5560 ^{M-1см 1}). Соотношение было введено в ячейку G2 электронной таблицы Excel. Введите среднее значение множителя α в J2.
12. Для расчета КПД FRET, E, используйте определенный коэффициент α следующим образом (колонка AK):
    
13. В качестве альтернативы определите эффективность FRET, E, для отрицательного контроля, т. е. коэкспрессии GFP и Cherry и экспрессии только GFP, добавив измерения каналов 1, 2 и 3 на листе Excel в столбцах AD, AE и AF под измерениями слитого белка GFP-Cherry. Определите эффективность FRET между интересующими белками GFP и Cherry.
14. Определить интенсивность неугасимого донора, I _D как (I 1 - B 1)/(₁ - E), а акцепторную интенсивность как I _A = I 3 - B₃; Эти значения пропорциональны уровням экспрессии меченых белков.
15. Определите скорректированное отношение интенсивности акцептора к донору (Q) слитого белка GFP-Cherry следующим образом (столбец AL):
    
16. Для других котрансфицированных клеток рассчитайте молекулярное отношение акцептора к донору N_A /_{N D} следующим образом:
    
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование для определения соотношения N A/N D и построения графика средней клеточной эффективности FRET E по сравнению с N _A / N _D заключается в том, что одна молекула-донор может передавать энергию нескольким акцепторам, в то время как молекула-акцептор может получать энергию только от одного донора в данный момент времени. Даже если только один акцептор может взаимодействовать с донором из-за стехиометрии взаимодействия, ожидается, что увеличение концентрации акцептора увеличит долю доноров в комплексе с акцептором из-за закона действия масс. Таким образом, для фиксированной (или узкого диапазона) донорской экспрессии эффективность FRET должна возрастать с увеличением N _A/N_D. Однако при построении графика эффективности FRET E по сравнению с N A/N D для совместной экспрессии GFP и Cherry, т.е. отрицательного зонда, увеличение N_A/_{N D} не должно приводить к увеличению эффективности FRET (по крайней мере, при достаточно низких концентрациях акцепторов, когда случайный FRET из-за близости акцепторных красителей к донорным красителям не возникает).

Результаты

На рисунке 1 показаны изображения, полученные в донорном канале, канале 1 (488, 505-530 нм), канале передачи, канале 2 (488, >585 нм) и акцепторном канале, канале 3 (561, >585 нм) соответственно. Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих только GFP, только вишню, ...

Обсуждение

В представленном протоколе подробно описано использование генетически связанного взаимно-однозначного калибровочного зонда флуоресцентного белка для количественной оценки FRET с использованием детектирования сенсибилизированного излучения акцептора и гашения донорной молекулы ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081