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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Mit simultaner Video-EEG-Oximetrie-Kapnographie entwickelten wir eine Methodik zur Bewertung der Anfälligkeit von Kaninchenmodellen für die Entwicklung provozierter Arrhythmien und Krampfanfälle. Dieses neuartige Aufzeichnungssystem schafft eine Plattform, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Therapeutika zu testen und kann die komplexe Kaskade von Multisystemereignissen erfassen, die in einem plötzlichen Tod gipfeln.

Zusammenfassung

Patienten mit Ionenkanalopathien haben ein hohes Risiko, Anfälle und tödliche Herzrhythmusstörungen zu entwickeln. Es gibt eine höhere Prävalenz von Herzerkrankungen und Arrhythmien bei Menschen mit Epilepsie (dh epileptischem Herz). Darüber hinaus wurden Herz- und autonome Störungen im Zusammenhang mit Anfällen berichtet. 1:1.000 Epilepsiepatienten/Jahr sterben an plötzlichem unerwartetem Tod bei Epilepsie (SUDEP). Die Mechanismen für SUDEP bleiben unvollständig verstanden. Elektroenzephalogramme (EEG) und Elektrokardiogramme (EKG) sind zwei Techniken, die routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt werden, um die Substrate / Auslöser für Anfälle und Arrhythmien zu erkennen und zu untersuchen. Während viele Studien und Beschreibungen dieser Methodik bei Nagetieren sind, unterscheidet sich ihre elektrische Herzaktivität signifikant von der des Menschen. Dieser Artikel besteht eine nicht-invasive Methode zur Aufzeichnung der simultanen Video-EEG-EKG-Oximetrie-Kapnographie bei bewussten Kaninchen. Da die elektrische Herzfunktion bei Kaninchen und Menschen ähnlich ist, bieten Kaninchen ein hervorragendes Modell für translationale diagnostische und therapeutische Studien. Neben der Methodik zur Datenerfassung diskutieren wir die analytischen Ansätze zur Untersuchung der neuroherzialen elektrischen Funktion und Pathologie bei Kaninchen. Dazu gehören die Arrhythmieerkennung, die Spektralanalyse des EEG und eine Anfallsskala, die für zurückhaltende Kaninchen entwickelt wurde.

Einleitung

Die Elektrokardiographie (EKG) wird routinemäßig im klinischen Umfeld eingesetzt, um die Dynamik der elektrischen Herzleitung und den elektrischen Aktivierungs- und Genesungsprozess zu beurteilen. EKG ist wichtig für die Erkennung, Lokalisierung und Bewertung des Risikos von Arrhythmien, Ischämie und Infarkten. Typischerweise werden Elektroden an Brust, Armen und Beinen des Patienten befestigt, um eine dreidimensionale Sicht auf das Herz zu ermöglichen. Eine positive Ablenkung wird erzeugt, wenn die Richtung der Myokarddepolarisation in Richtung der Elektrode gerichtet ist, und eine negative Ablenkung wird erzeugt, wenn die Richtung der Myokarddepolarisation von der Elektrode entfernt ist. Zu den elektriographischen Komponenten des Herzzyklus gehören die vorhofliche Depolarisation (P-Welle), die vorhofventrikuläre Leitung (P-R-Intervall), die ventrikuläre Erregung (QRS-Komplex) und die ventrikuläre Repolarisation (T-Welle). Es gibt große Ähnlichkeiten in EKG- und Aktionspotenzialmessungen bei vielen Säugetieren, einschließlich Menschen, Kaninchen, Hunden, Meerschweinchen, Schweinen, Ziegen und Pferden1,2,3.

Kaninchen sind ein ideales Modell für die kardiale translationale Forschung. Das Kaninchenherz ähnelt dem menschlichen Herzen in Bezug auf die Ionenkanalzusammensetzung und die Aktionspotentialeigenschaften2,4,5. Kaninchen wurden für die Erzeugung von genetischen, erworbenen und medikamenteninduzierten Modellen von Herzerkrankungen verwendet2,4,6,7,8. Es gibt große Ähnlichkeiten im Herz-EKG und Aktionspotential-Reaktion auf Medikamente bei Menschen und Kaninchen7,10,11.

Die Herzfrequenz und der kardiale elektrische Aktivierungs- und Erholungsprozess unterscheiden sich bei Nagetieren sehr von Kaninchen, Menschen und anderen größeren Säugetieren12,13,14. Das Nagetierherz schlägt ~10 mal so schnell wie der Mensch. Im Gegensatz zum isoelektrischen ST-Segment in Menschen- und Kaninchen-EKGs gibt es bei Nagetieren14 , 15,16kein ST-Segment . Außerdem haben Nagetiere eine QRS-r' Wellenform mit einer invertierten T-Welle14,15,16. Die Messungen des QT-Intervalls sind bei Nagetieren sehr unterschiedlich im Vergleich zu Menschen und Kaninchen14,15,16. Darüber hinaus sind normale EKG-Werte beim Menschen sehr unterschiedlich gegenüber Nagetieren12,15,16. Diese Unterschiede in den EKG-Wellenformen können auf Unterschiede in der Morphologie des Aktionspotentials und den Ionenkanälen zurückgeführt werden, die die kardiale Repolarisationantreiben 9,14. Während der transiente nach außen gerichtete Kaliumstrom bei Nagetieren der wichtigste repolarisierende Strom in der kurzen (nicht dome) kardialen Wirkungspotentialmorphologie ist, gibt es bei Menschen und Kaninchen eine große Phase-2-Kuppel auf dem Aktionspotential, und die verzögerten Gleichrichter-Kaliumströme (IKr und IKs)sind die wichtigsten repolarisierenden Ströme bei Menschen und Kaninchen4,9,13,17. Wichtig ist, dass die Expression von IKr und IKs bei Nagetieren fehlt / minimal ist und aufgrund der zeitlichen Aktivierungskinetik von IKr und I Ks keine Rolle in der Morphologie des Herzaktionspotentialsspielt 9, 13. Somit bieten Kaninchen ein translationaleres Modell zur Beurteilung der Mechanismen für medikamenteninduzierte, erworbene und vererbte EKG-Anomalien und Arrhythmien4,7,13. Da zahlreiche Studien das Vorhandensein von neuronalen und kardialen elektrischen Anomalien bei primären kardialen (Long QT-Syndrom18,19,20) oder neuronalen Erkrankungen (Epilepsie21,22,23,24) gezeigt haben, ist eswichtig,die zugrunde liegenden Mechanismen in einem Tiermodell zu untersuchen, das die menschliche Physiologie genau reproduziert. Während Nagetiere ausreichen können, um das menschliche Gehirn zu modellieren, sind Nagetiere kein ideales Modell der menschlichen Herzphysiologie7.

Die Elektroenzephalographie (EEG) verwendet Elektroden, die normalerweise auf der Kopfhaut oder intrakraniell platziert werden, um die kortikale elektrische Funktion aufzuzeichnen. Diese Elektroden können Veränderungen der Feuerrate und Synchronizität von Gruppen nahegelegener pyramidaler Neuronen in der Großhirnrindeerkennen 25. Diese Informationen können verwendet werden, um die Gehirnfunktion und den Wach- / Schlafzustand zu beurteilen. EEGs sind auch nützlich, um die epileptiforme Aktivität zu lokalisieren und epileptische Anfälle von nicht-epileptischen Ereignissen (z. B. psychogene nicht-epileptiforme Aktivität und kardiogene Ereignisse) zu unterscheiden. Um den Epilepsietyp, provozierende Faktoren und den Ursprung des Anfalls zu diagnostizieren, werden Epilepsiepatienten verschiedenen Manövern unterzogen, die zu einem Anfall führen können. Verschiedene Methoden umfassen Hyperventilation, photische Stimulation und Schlafentzug. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von photischer Stimulation zur Induktion von EEG-Aberrationen und Anfällen bei Kaninchen26,27,28,29.

Simultane Video-EEG-EKG-Aufzeichnungen wurden bei Menschen und Nagetieren ausgiebig verwendet, um die Verhaltens-, neuronale und kardiale Aktivität während der prä-italen, iktalen und post-italen Zustände zu beurteilen30. Während mehrere Studien EEG- und EKG-Aufzeichnungen getrennt bei Kaninchen4,31,32,33durchgeführthaben,ist ein System zur Erfassung und Analyse simultaner Video-EEG-EKG beim bewussten zurückgehaltenen Kaninchen nicht gut etabliert34. Dieser Artikel beschreibt das Design und die Implementierung eines Protokolls, das simultane Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetriedaten bei bewussten Kaninchen aufzeichnen kann, um die neuro-kardiale elektrische und respiratorische Funktion zu beurteilen. Die ergebnisse dieser Methode können die Anfälligkeit, Auslöser, Dynamik und Konkordanz zwischen Arrhythmien, Krampfanfällen, Atemstörungen und körperlichen Manifestationen anzeigen. Ein Vorteil unseres experimentellen Systems ist, dass wir bewusste Aufnahmen ohne Beruhigungsmittel erwerben. Die Kaninchen bleiben ≥5 h in den Rückhaltemitteln, mit minimaler Bewegung. Da Anästhetika die neuronale, kardiale, respiratorische und autonome Funktion stört, liefern Aufzeichnungen während des Bewusstseinszustands die physiologischsten Daten.

Dieses Aufzeichnungssystem kann letztendlich detaillierte Einblicke liefern, um das Verständnis der neurologischen, kardialen und respiratorischen Mechanismen für den plötzlichen unerwarteten Tod bei Epilepsie (SUDEP) zu verbessern. Zusätzlich zur neurologischen und kardialen Überwachung haben jüngste Erkenntnisse auch die Rolle von Atemversagen als potenziellen Beitrag zum plötzlichen Tod nach einem Anfall unterstützt35,36. Um den Atemstatus der Kaninchen zu überwachen, wurden Oximetrie und Kapnographie implementiert, um den Status des Atmungssystems vor, während und nach einem Anfall zu bewerten. Das hier vorgestellte Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, die Schwelle für pharmakologisch und photisch-stimulierende Kaninchenanfälle zu bewerten. Dieses Protokoll kann subtile EEG- und EKG-Anomalien erkennen, die möglicherweise nicht zu körperlichen Manifestationen führen. Darüber hinaus kann diese Methode für die kardiale Sicherheit und die antiarrhythmische Wirksamkeitsprüfung neuartiger Medikamente und Geräte eingesetzt werden.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Upstate Medical University durchgeführt. Darüber hinaus finden Sie in Abbildung 1eine Übersicht über dieses Protokoll.

1. Vorbereitung des Kontrollgeräts

  1. Schließen Sie den Computer an einen Verstärker mit einem 64-poligen Kopfkasten an.
    HINWEIS: Jedes Tier hat vier gerade subdermale Kopfhautstiftelektroden (7 oder 13 mm) für EEGs aus den 4 Quadranten des Kopfes, 3 gebogene subdermale Bruststiftelektroden (13 mm, 35° Winkel) für EKG (Einthovens Dreieck), 1 gebogene subdermale Stifter-Bodenelektrode am rechten Bein und 1 gerade subdermale Kopfhautstiftelektrode in der Mitte des Kopfes dient als Referenz.
  2. Um jeden8. Pin am Ausgang zu einer Referenz zu machen, aktualisieren Sie die Einstellungen der Erfassungssoftware, Registerkarte Erfassung, so dass die Referenzelektrode "Unabhängig" ist (dh Forschungsmodus).
    HINWEIS: Dies ermöglicht Aufnahmen von bis zu 7 Tieren gleichzeitig, jeweils mit 7 Elektroden plus einer dedizierten Referenzelektrode und einer Masseelektrode, alles über einen Verstärker, Digitizer und Computer. Alle Elektroden werden als unipolare Kanäle erfasst und mit der Referenz (Kopfzentrum) verglichen. Zusätzliche bipolare und erweiterte Lead-Konfigurationen/Montagen können während oder nach der Aufnahme eingerichtet werden. Da das Setup in der Lage ist, von mehreren Tieren gleichzeitig aufzunehmen, wird eine Masseelektrode von jedem Tier parallel zum Masseeingang des Verstärkers angeschlossen (Abbildung 2).
  3. Entfernen Sie Kaninchen aus ihrem Käfig und wiegen Sie sie, um die geeignete Medikamentendosis für jedes Tier zu berechnen. Legen Sie die Kaninchen in einen Transportträger und bringen Sie sie in einen separaten Raum, um den Stress für Nichtversuchstiere zu minimieren. In dieser Studie wurden männliche und weibliche neuseeländische weiße Kaninchen und ihre nachfolgenden Nachkommen verwendet. Experimente wurden an Kaninchen durchgeführt, die > 1 Monat alt waren. Zum Zeitpunkt des Experiments wogen diese Kaninchen zwischen 0,47 und 5,00 kg.
    HINWEIS: Da sich die Kaninchen im selben Raum und im Blick auf die Kamera befinden müssen, isolieren Sie die Kaninchen nicht vollständig. Es besteht das Potenzial für visuelle und auditive Manifestationen von einem Kaninchen, das ein anderes Kaninchen stresst. Daher ist es ideal, ein Kaninchen gleichzeitig im Raum zu haben, was für die photischen Stimulationsexperimente getan wird. Bei allen anderen Experimenten werden die Kaninchen so weit wie möglich verteilt, während sie alle in Sichtweite der Videokamera bleiben. Idealerweise werden Barrieren verwendet oder nur ein Tier gleichzeitig untersucht. Dies war kein großer Störfaktoren, da dieHerzfrequenz der Kaninchen während der Experimente ziemlich stabil blieb und häufig Schlafspindeln vorhanden waren. Aufzeichnungen von mehreren Tieren gleichzeitig stellen sicher, dass sowohl Kontroll- als auch Versuchsdaten unter den gleichen Umgebungsbedingungen erfasst werden.

2. Implantation von EEG-EKG-Elektroden und Anbringung von Atemschutzmasken

  1. Entfernen Sie ein Kaninchen aus dem Transportträger und legen Sie es in den Schoß eines sitzend sitzenden Ermittlers.
  2. Halten Sie das Kaninchen vertikal und halten Sie es nahe am KörperdesErmittlers.
  3. Senken Sie das Kaninchen in Rückenlage, wobei der KopfdesKaninchens auf den KniendesErmittlers und der KopfdesKaninchens niedriger ist als der Rest seines Körpers.
    HINWEIS: Dieses Manöver entspannt das Tier und minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass es versucht, sich zu bewegen oder zu entkommen, während es die Elektroden platziert.
  4. Jetzt, da das Kaninchen in Rückenlage gesichert ist, bitten Sie einen zweiten Ermittler, das Fell zu verteilen, bis die Haut identifiziert und aus dem darunter liegenden Gewebe isoliert werden kann.
  5. Setzen Sie35° gebogene Elektroden subdermal in jede Achselhöhle ein (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Die Elektroden sollten so durchgedrückt werden, dass sie sicher in die Haut eingehakt sind, aber nicht in tiefere Strukturen eindringen. Wenn die Elektrode in die Haut ein- und ausgeht (durch und durch), verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Leitungen beim Einlegen des Kaninchens in den Rückhaltearm oder wenn es sich während des Experiments bewegt (Abbildung 3B). Alle Elektroden werden vor der Platzierung mit 70% Ethanol sterilizaiert.
  6. Legen Sie die Leitungen auf der Brust nach vorne zu den rechten und linken Vordergliedmaßen und auf dem Bauch vor der linken Hintergliedmaße. Legen Sie eine massereiche Stiftelektrode anterior an der rechten Hintergliedmaße auf den Bauch (Abbildung 4A).
  7. Sobald alle EKG-Leitungen richtig platziert sind, bringen Sie das Kaninchen in eine Bauchlage zurück, wobei die Leitungen eine Seite des Kaninchenbauchs hinauflaufen, und übertragen Sie das Kaninchen in einen entsprechend großen Rückhaltebereich (z. B. 6 "x 18" x 6").  Wenn Sie das Kaninchen in den Rückhalteer legen, ziehen Sie den losen Draht nach oben, um zu minimieren, dass das Kaninchen die Elektroden mit seinen Beinen herauszieht. Kleben Sie die Drähte an die Seite des Rückhaltebandes, damit sie sich während des Experiments nicht unter dem Kaninchen verfangen (Abbildung 4B).
  8. Befestigen Sie das Kaninchen im Rückhaltesystem, indem Sie die Rückhalteeinrichtung um den Hals senken und an Ort und Stelle verriegeln. Bewegen Sie zusätzlich die Hinterbeine unter dem Tier nach oben und sichern Sie die hintere Zurückhaltung.
    HINWEIS: Man sollte in der Lage sein, 1-2 Finger in den Raum unter dem Hals zu passen, um sicherzustellen, dass es nicht zu eng ist. Insbesondere bei Experimenten, bei denen es zu motorischen Bewegungen kommt, ist es wichtig, die Rückhalteeinrichtung zu straffen, um Bewegungen, mögliche Wirbelsäulenverletzungen, Gliedmaßenluxationen und die Fähigkeit, die hintere Zurückhaltung herauszutreten, zu minimieren (Abbildung 4B). Kaninchen wurden für ~ 5 h im Rückhalteer gehalten, ohne Probleme im Zusammenhang mit erhöhter Bewegung oder Anzeichen von Dehydrierung.
    1. Bei kleinen Kaninchen (z. B. weniger als 2 Monate) legen Sie ein Gummi-Booster-Pad unter das Tier, um das Kaninchen aufzuziehen, wodurch verhindert wird, dass das Kaninchen seinen Hals auf der Unterseite der Kopfstütze absticht (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Ein plötzlicher Abfall der Atem- und Herzfrequenz kann sekundär zum Nackenimperement sein. Wenn dies auftritt, lösen Sie den Nackenfessel und heben Sie den KopfdesKaninchens an, um eine Nackenkompression zu lindern.
    2. Wenn die hintere Rückhalteeinrichtung den Rücken / die Wirbelsäule des Kaninchens nicht genau verfolgt, legen Sie einen PVC-Abstandhalter an, um jede Bewegung zu verhindern, die Wirbelsäulenverletzungen verursachen könnte.
      HINWEIS: Zum Beispiel kann ~ 14 cm langes x 4 "Innendurchmesser PVC-Rohr, mit dem unteren 25-33% entfernt, mit Schaum über das Kaninchen gelegt werden, um eine angemessene Zurückhaltung zu bieten (Abbildung 4C).
  9. Nachdem das Kaninchen nun sicher in den Rückhalteer eingesetzt ist, führen Sie die 7-13 mm subdermalen geraden Stiftelektroden in die Kopfhaut ein (Abbildung 3A). Führen Sie die Drähte mit einem Eintrittswinkel von 45° zwischen den Ohren nach oben und binden Sie die Drähte lose an den Rückhaltegurt hinter dem Kopf, um die Bleiplatzierung aufrechtzuerhalten. Platz 5 EEG führt in folgenden Positionen: rechts anterior, links anterior, rechts occipital, links occipital und eine zentrale Referenz (Cz) führen an der Stelle zwischen den anderen 4 Leitungen (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Elektroden werden richtig platziert, wenn sie im Unterhautgewebe gegen den Schädel positioniert werden. Diese Platzierung minimiert Artefakte aus Nase, Ohren und anderen umgebenden Muskeln. Einige Artefakte aus rhythmischen Nasenbewegungen sind unvermeidlich. Die vorderen EEG-Leitungen sollten medial zu den AugendesKaninchens platziert werden und nach vorne zeigen. Die Okzipitalleitungen sollten vor den Ohren platziert werden und zeigen in die mediale Richtung. Cz wird in der Mitte der Oberseite des Kopfes an einem Punkt platziert, der sich zwischen allen 4 Elektroden befindet (auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma, entlang der Nahtlinie). Der Stift der Cz-Elektrode zeigt nach vorne.
    1. Führen Sie die EEG-Drähte zwischen den Ohren nach oben, um zu vermeiden, dass das Kaninchen versucht, die Drähte zu beißen.
  10. Befestigen Sie den Pulsoximeter-Plethysmographen über der Randohrvene des Kaninchens am Ohr.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, überschüssiges Haar vom Ohr zu rasieren, um das Signal zu verbessern, oder etwas Gaze zu verwenden, um den Sensor an Ort und Stelle zu halten.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz auf der Plethysmographie mit der Herzfrequenz aus dem EKG korreliert und dass die Sauerstoffsättigung angezeigt wird (Abbildung 5C).
  11. Legen Sie die Gesichtsmaske vorsichtig mit Kapnographieschlauch über Mund und Nase des Kaninchens (Abbildung 4H). Befestigen Sie die Gesichtsmaske mit einer Schnur, die um die Maske gewickelt ist, und befestigen Sie beide Enden der Schnur am Rückhaltericht. Befestigen Sie das andere Ende des Kapnographieschlauchs am Vitalparametermonitor.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu verhindern, dass die Schnur während des Experiments über die Augen des Kaninchens legt. Kleben Sie dazu die Schnur in die Mitte des Rückhaltemittels zwischen den Ohren des Kaninchens. Um das Kapnographiesignal zu verbessern, erstellen Sie ein Einwegventil mit Klebeband und einem dünnen Stück Nitril, das Sauerstoff in das T-Stück eindringen lässt und ausgeatmetes CO2 in den Kapnographieschlauch leitet (Abbildung 4I).

3. Aufzeichnung des Video-EEG-EKGs

  1. Führen Sie Video-EEG-EKG-Aufzeichnungen mit einer handelsüblichen EEG-Software durch.
    HINWEIS: Die biopotentialen Leitungen und das Video sind zeitlich gesperrt, um später die elektrischen und Videosignale zu korrelieren (z. B. EEG-Spitze mit einem myoklonischen Ruck).
  2. Bestätigen Sie die optimale Konnektivität ohne Baseline-Drift, ohne elektrisches Rauschen von 60 Hz und mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Stellen Sie insbesondere sicher, dass jede Phase der Herzwellenform im EKG visualisiert werden kann und dass die Delta-, Theta- und Alphawellen nicht visuell durch hochfrequentes Rauschen am EEG verdeckt werden.
    1. Wenn alle Elektroden übermäßige Rauschmengen erzeugen, stellen Sie die zentrale Referenzleitung ein. Wenn nur eine Elektrode übermäßig laut ist, drücken Sie diese Elektrode tiefer in die Haut oder positionieren Sie sie neu, bis kein Metall mehr freiliegt.
  3. Passen Sie das Video so an, dass alle Kaninchen gleichzeitig gesehen werden können, was die Korrelation der motorischen Aktivität mit EEG-Befunden ermöglicht (Abbildung 5A).
    HINWEIS: Das System unterstützt gleichzeitige EEG/EKG/Oximetrie-/Kapnographieaufnahmen von bis zu 7 Kaninchen.
  4. Starten Sie die Baseline-Aufnahme von jedem Tier für mindestens 10-20 minuten oder bis sich die Herzfrequenz in einen ruhigen, entspannten Zustand (200-250 bpm) stabilisiert und die Kaninchen mindestens 5 min lang keine großen Bewegungen zeigen. Erfassen Sie elektrographische Daten mit voller Bandbreite ohne Filter. Um Die Daten besser sichtbar zu machen, setzen Sie den Niederfrequenzfilter (=Hochpassfilter) bei 1 Hz und den Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) bei 59 Hz ein.
    HINWEIS: Ein weiteres Zeichen dafür, dass das Kaninchen entspannt ist, ist das Einsetzen von EEG-Schlafspindeln (später besprochen).
  5. Fügen Sie während des Experiments in Echtzeit zeitgebundene Notizen hinzu, um den Zeitpunkt von Interventionen (z. B. Medikamentenabgabe) und neuroherzialen Ereignissen (z. B. EEG-Spitze, motorische Anfälle, ektopischer Beat und Arrhythmien) sowie motorische / Forscherartefakte anzuzeigen.
    HINWEIS: Aufgrund der Häufigkeit, mit der der Prüfer eine Intervention durchführen muss (z. B. photische Stimulation, Medikamentenabgabe), um den Stress eines Prüfers zu minimieren, der den Raum betritt und verlässt und die Tür öffnet / schließt, bleibt der Prüfer während des gesamten Experiments auf der gegenüberliegenden Seite des Raumes. Der Ermittler sitzt so weit wie möglich vom Tier entfernt und bleibt still und ruhig, um eine mögliche Störung der Tiere zu minimieren.

4. Experimentelle Protokolle

HINWEIS: Jedes der folgenden Experimente wird an verschiedenen Tagen durchgeführt, wenn sie an demselben Tier durchgeführt werden. Es gibt eine 2-wöchige Verzögerung zwischen den oralen Tests compound Drug Studien und der akuten terminalen Pro-Convulsant-Medikamentenstudie. Bei Bedarf wird das photische Stimulationsexperiment durchgeführt, gefolgt von einer 30-minütigen Wartezeit und dann der PTZ-Medikamentenstudie.

  1. Damit sich die Kaninchen in den Rückhaltemitteln akklimatisieren können und der Prüfer die Stabilisierung der kardiorespiratorischen Raten objektiv bestätigen kann, instrumentieren Sie alle Kaninchen mit den kardiorespiratorischen und neuronalen Sensoren und führen Sie eine kontinuierliche Videoüberwachung für > 1 Stunde, 1 - 3 Mal pro Tier durch.
  2. Photisches Stimulationsexperiment
    1. Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Verfahren eine Lichtquelle mit einem kreisförmigen Reflektor 30 cm vor dem Kaninchen auf Augenhöhe platzieren, wobei die Blitzintensität auf das Maximum (16 Candela)29eingestellt ist. Die Lichtquelle wird in Abbildung 4Edurch einen weißen Punkt angezeigt.
      HINWEIS: Ein schwach beleuchteter Raum sollte verwendet werden, um die lichtempfindliche Reaktionhervorzurufen 37.
    2. Da sich die AugendesKaninchens auf der Seite des Kopfes und nicht auf der Vorderseite seines Kopfes befinden (wie beim Menschen), platzieren Sie 2 Spiegel auf beiden Seiten des Kaninchens und 1 hinter dem Kaninchen, damit das Licht in die AugendesKaninchens eindringt.
      HINWEIS: Ein flacher Spiegel, der ≥ 20 cm hoch ist, von ≥ 120 cm lang, bildet ein dreieckiges Gehege um das Kaninchen, um sicherzustellen, dass das blinkende Licht in die AugendesKaninchens eindringt, wie in Abbildung 4Ezu sehen.
    3. Schließen Sie die Lichtquelle an einen Controller an, der über eine einstellbare Rate, Intensität und Dauer verfügt.
    4. Nehmen Sie Videos mit einer Kamera mit Rotlicht- und Infrarotaufzeichnungsfunktionen auf.
    5. Setzen Sie die Kaninchen 30 s lang mit offenen Augen jeder Frequenz aus und dann weitere 30 s mit einer chirurgischen Maske, die ihr Gesicht bedeckt, um bei jeder Frequenz einen Augenverschluss zu simulieren oder zu verursachen.
      HINWEIS: Frühere Studien haben gezeigt, dass der Augenverschluss das provokativste Manöver ist, um Lichtempfindlichkeit gegen Anfälle hervorzulocken29. Darüber hinaus zeigen 10% der lichtempfindlichen Patienten nur elektroenzephalographische Anzeichen, während ihre Augen geschlossen sind29. Ein Anfall kann klinisch identifiziert werden, indem das Vorhandensein von myoklonischen Kopf- und Ganzkörperruckeln, Klonus oder einem tonischen Zustand beobachtet wird. Die EEG-Aufzeichnung wird gründlicher auf elektroenzephalographische Korrelation (z. B. Spikes, Poly-Spikes und rhythmische Entladungen) mit motorischen Manifestationen analysiert, um eine definitive Diagnose der Anfallsaktivität zu erhalten. Bewegungen, bei denen das EEG durch Muskelartefakte oder Wellen unbestimmter Epileptogenität verdeckt wird, sollten von einem Epileptologen zur Bestätigung überprüft werden.
    6. Erhöhen Sie die photische Stimulatorfrequenz von 1 Hz auf 25 Hz in 2 Hz-Schritten. Führen Sie dann das gleiche Photostimulationsprotokoll durch, aber dieses Mal verringern Sie die Frequenz von 60 Hz auf 25 Hz in 5-Hz-Schritten.
      HINWEIS: Wenn ein Kaninchen einen Anfall hat, sollte das Experiment abgebrochen werden. Überwachen Sie das Kaninchen weiterhin für 30 Minuten. Dann bringen Sie das Kaninchen in das Haltungszimmer zurück und überwachen Sie alle 1 h für 3 h für die vollständige Genesung. Wenn die photische Stimulation jedoch eine photoparoxysmale Reaktion induziert, werden die restlichen aufsteigenden Frequenzen übersprungen und die Serie wird erneut gestartet, indem von 60 Hz abgestiegen wird, bis eine andere photoparoxysmale Reaktion auftritt. Dies ermöglicht die Bestimmung der oberen und unteren photischen Stimulationsschwellen. Es ist keine Verzögerung erforderlich, da die photoparoxysmale Reaktion nach Absetzen der photischen Stimulation aufhört. Wenn unklar ist, ob eine photoparoxysmale Reaktion aufgetreten ist, wird die Frequenz nach einer Verzögerung von 10 s wiederholt38.
    7. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie EEG- und EKG-Leitungen vom Kaninchen und bringen Sie es zur routinemäßigen Pflege durch das Haltungspersonal in seinen Heimkäfig zurück.
  3. Orale Verabreichung von Medikamenten
    1. Da viele Medikamente oral eingenommen werden, bereiten Sie orale Verbindungen vor, indem Sie mit apfelmus in Lebensmittelqualität mischen. Mischen Sie 0,3 mg/kg E-4031 in 3 ml Apfelmus und laden Sie sie ohne Nadel in eine 3 ml Mund-/Bewässerungsspritze.
      HINWEIS: Mehrere Medikamente können auf diese Weise verabreicht werden, darunter Testverbindungen, Medikamente, von denen bekannt ist, dass sie die QT-Dauer verändern (Moxifloxacin oder E-4031) und eine Negativkontrolle oder ein Negativvehikel. Einige Medikamente sind nicht in einer intravenösen Formulierung erhältlich. Darüber hinaus werden viele Medikamente in einer oralen Formulierung verschrieben und daher kann eine intravenöse Verabreichung eine geringere klinische Relevanz haben.
    2. Heben Sie die Oberlippen an und schieben Sie dieSpitze der Spritze zum Einnehmen in die Seite des Kaninchenmauls, die von denZähnendes Kaninchens ungehindert wird, und injizieren Sie alle Medikamente und Apfelmus in den MunddesKaninchens.
    3. Setzen Sie die Video-EEG-EKG-Aufzeichnung für 2 h fort und bringen Sie das Tier dann zur routinen Pflege in seinen Heimkäfig zurück.
    4. Verbinden Sie das Kaninchen am experimentellen Tag 2 und 3 mit dem Video-EEG-EKG, zeichnen Sie 10-20 Minuten des Ausgangswerts auf, injizieren Sie dann das gleiche Medikament und zeichnen Sie für 2 h auf.
    5. Führen Sie nach 1 Woche Auswaschung 10-20 Minuten des Ausgangswerts durch und geben Sie dann jedem Kaninchen eine Einzeldosis Placebo für 3 aufeinanderfolgende Tage und zeichnen Sie für 2 Stunden auf.
      HINWEIS: Die Verabreichung von oralen Medikamenten kann als Crossover-Studie konzipiert werden, in der das Placebo in Woche 1 und das Medikament in Woche 2 verabreicht wird.
  4. Intravenöses Medikationsexperiment (Pentylenetetrazol, PTZ)
    1. Um die marginale Ohrvene zu visualisieren, rasieren Sie die hintere Oberfläche desKaninchenohrs. Verwenden Sie ein 70% ige Ethanoltuch, um die Stelle zu desinfizieren und die marginale Ohrvene zu erweitern. Dies wird durch das schwarz gestrichelte Oval in Abbildung 4Fangezeigt.
    2. Lassen Sie an dieser Stelle einen Experimentator das GesichtdesKaninchens mit der Hand bedecken, um den Stress des Verfahrens für das Kaninchen zu verringern. Ein zweiter Experimentator kanuliert vorsichtig die marginale Ohrvene mit einem sterilen 25-G-Angiokatheter.
    3. Sobald sich der Katheter in der Vene befindet, legen Sie einen sterilen Injektionsstopfen an das Ende des Katheters, damit eine Nadel Medikamente intravenös einführen kann. Die Position des Injektionssteckers wird durch einen blauen Kreis in Abbildung 4Gangezeigt.
    4. Machen Sie eine Schiene, indem Sie 4 x 4 Zoll Gaze mit Klebeband umwickeln, so dass sie eine Röhrenform bildet und sie in das OhrdesKaninchens legt. Dann kleben Sie die Schiene an das Ohr, so dass der Katheter an Ort und Stelle gesichert ist und aufrecht bleibt, ähnlich wie beim nicht katheterisierten Ohr.
    5. Injizieren Sie 1 ml 10 USP-Einheiten pro ml heparinisierte Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Der Katheter und das Gefäß sollten sichtbar von Luft befreit werden und patentiert bleiben. Wenn sich der Katheter nicht im Gefäß befindet, drückt die Spritze nicht leicht und es kommt zu einer Ansammlung von Kochsalzlösung im Unterhautgewebe.
    6. Geben Sie Kaninchen inkrementelle Dosen von PTZ intravenös von 1 mg/kg bis 10 mg/kg in Schritten von 1 mg/kg alle 10 Minuten. Notieren Sie sich zu Beginn jeder Dosis, um anzugeben, welches Tier injiziert wird und die Konzentration des Medikaments.
      HINWEIS: Dies ermöglicht die Beurteilung der akuten und additiven Wirkungen der PTZ-Verabreichung. Alternativ, um die chronischen Wirkungen von niedrig dosierter PTZ weiter zu beurteilen, erhält das Kaninchen wiederholte Dosen bei jeder niedrigen Dosiskonzentration, 7 Dosen bei 2 mg/ kg, 3 Dosen bei 5 mg / kg, dann 3 Dosen bei 10 mg / kg, jede Dosis wird durch 10 min getrennt.
    7. Überwachen Sie nach jeder Dosis sorgfältig die Video-EEG-EKG-Kapnographie-Oximetrie auf neuroherziale elektrische und respiratorische Anomalien und visuelle Hinweise auf epileptiforme Aktivität. Notieren Sie sich diese Änderungen in Echtzeit und während der Nachanalyse.
      HINWEIS: Die Anfallsaktivität beginnt oft innerhalb von 60 Jahren nach der Verabreichung von PTZ.

5. Abschluss von Nicht-Überlebensexperimenten.

  1. Wenn das Kaninchen im Laufe des PTZ-Experiments keinen plötzlichen Tod hatte, verabreichen Sie 1 ml 390 mg / ml Natriumpentobarbital pro 4,54 kg Körpergewicht (oder 1,5 ml für alle Kaninchen), gefolgt von einer 1 ml Spülung normaler Kochsalzlösung. Überwachen Sie das EKG, um sicherzustellen, dass das Kaninchen einen Herzstillstand erfährt.
  2. Sobald das Kaninchen einen Herzstillstand erfährt, führen Sie schnell eine Nekropsie durch, um verschiedene Organe frisch zu isolieren, einschließlich Herz, Lunge, Leber, Gehirn, Skelettmuskulatur und anderes Gewebe, das für nachfolgende molekulare / biochemische Analysen erforderlich ist.
  3. Entsorgen Sie das Kaninchen gemäß den institutionellen Richtlinien.

6. Analyse des EKG

  1. Verwenden Sie handelsübliche EKG-Analysesoftware, um das EKG visuell zu untersuchen und Perioden von Tachykardie, Bradykardie, ektopischen Schlägen und anderen Arrhythmien zu identifizieren (Abbildung 6). Um die zu überprüfende Datenmenge zu reduzieren, erstellen Sie ein Tachogramm, das die Leichtigkeit erhöht, mit der Perioden von Tachykardie, Bradykardie oder Unregelmäßigkeiten des RR-Intervalls identifiziert werden können.
    HINWEIS: EKG-Anomalien (z. B.QT-c-Verlängerung) und Arrhythmien werden manuell identifiziert, indem das EKG auf Anomalien in der Rate (z. B. Brady-/Tachy-Arrhythmien), Rhythmus (z. B. vorzeitige vorgezogene / ventrikuläre Komplexe), Leitung (z. B. atrio-ventrikulärer Block) und Wellenform (z. B. nicht-sinus-atrielle / ventrikuläre Tachykardie und Fibrillation) überprüft wird. Arrhythmien können erkannt werden, indem das Tachogramm auf Unregelmäßigkeiten im RR-Intervall überprüft wird. Tachykardie kann durch Abschnitte des Tachogramms identifiziert werden, in denen die Herzfrequenz über 300 Schlägen pro Minute liegt. Bradykardie wird identifiziert, wenn die Herzfrequenz weniger als 120 Schläge pro Minute auf dem Tachogramm beträgt.
  2. Führen Sie mit handelsüblich erhältlicher EKG-Analysesoftware Standard-EKG-Messungen (Herzfrequenz, Herzzyklusintervalle) zu Studienbeginn und bei Provokation durch (z. B. Manipulation des Tieres durch den Prüfer, Verabreichung von Testmitteln und anfallsinduzierte EKG-Veränderungen).

7. Analyse des Video-EEG

  1. Visueller Bildlauf durch das Video und die EEG-Ablaufverfolgung mit handelsüblich erhältlicher Software, um das Basissignal (Abbildung 7) und das Vorhandensein erwarteter EEG-Entladungen wie Schlafspindeln (Abbildung 8) und Scheitelpunktwellen (Abbildung 9) zu identifizieren.
    HINWEIS: Obwohl elektrographische Daten mit voller Bandbreite ohne Filter erfasst werden, sollten die Daten mit dem Niederfrequenzfilter (d. h. Hochpassfilter) auf 1 Hz eingestellt werden, und basierend auf dem SatzvonNyquist wird der Hochfrequenzfilter (dh Tiefpassfilter) auf 120 Hz eingestellt, um zu vermeiden, dass ein Signal fehlt. Die Filter können angepasst werden, um eine bessere Visualisierung und Rauschunterdrückung (z. B. 1-59 Hz) bei der Überprüfung der EEG-Aktivität mit niedrigerer Frequenz (<25 Hz) zu ermöglichen.
  2. Zusätzlich zu Kapnographie-Wellenformen, verwenden Sie Nasenbewegungsartefakt auf dem EEG, um das Vorhandensein und Fehlen von Atmung zu bestimmen. Dies kann auch mit Nasenbewegungen korreliert werden, die auf der Videoaufnahme zu sehen sind.
  3. Visuelles Scrollen Sie mit handelsüblicher Software durch das Video und die EEG-Verfolgung, um epileptische und nicht-epileptische (z. B. bewusste) Bewegungen für mindestens 1 Minute nach jeder PTZ-Dosis zu unterscheiden (Abbildung 10). Scannen Sie nach interiktalen epileptischen Entladungen und nach EEG-Veränderungen vor, während und nach Anfällen. Ein Anfall kann klinisch identifiziert werden, indem das Vorhandensein von myoklonischen Reflexen des Kopfes und des ganzen Körpers, Clonus oder einem tonischen Zustand mit einem EEG beobachtet wird. Die EEG-Änderungen können EEG-Spikes, Poly-Spikes und rhythmische Entladungen umfassen.
    HINWEIS: Bewegungen, bei denen das EEG durch Muskelartefakte oder Wellen unbestimmter Epileptogenität verdeckt wird, sollten von einem Neurologen zur Bestätigung überprüft werden. Es kann vorteilhaft sein, das Video auf ein Kaninchen zu fokussieren, um sein Verhalten sowie seine EEG- und EKG-Aufzeichnungen genauer zu betrachten (Abbildung 5B).
  4. Bewerten Sie das Video-EEG für Anfälle basierend auf der Art und Schwere der motorischen Manifestationen, die typischerweise innerhalb von 1 Minute nach der PTZ-Injektion auftreten (Tabelle 1).
  5. Analysieren Sie nach einem photischen Stimulationsexperiment die okzipitalen Leitungen des EEG auf das Vorhandensein und Fehlen des okzipitalen Antriebsrhythmus, indem Sie ein Spektralanalysediagramm in kommerziell erhältlicher EEG-Analysesoftware erstellen. Der okzipitale Fahrrhythmus erzeugt einen Peak in der Spektralanalyse, der der Frequenz des photischen Stimulators entspricht (Abbildung 11).
    HINWEIS: Die photische Stimulation kann zusätzlich zum Höhepunkt der Grundfrequenz harmonische Frequenzspitzen erzeugen.

7. Analyse der Atmungsfunktion

  1. Überprüfen Sie die Ausgabe des Vitalparametermonitors (Abbildung 4I) und exportieren Sie das Signal zur weiteren Analyse.
  2. Beachten Sie die Veränderung des Atemmusters während eines Anfalls und nach einem Anfall, insbesondere den Zeitpunkt, zu dem die Apnoe beginnt.

Ergebnisse

Die oben beschriebene Methode ist in der Lage, Anomalien im elektrischen Leitungssystem des Gehirns und des Herzens sowie Atemstörungen zu erkennen. Eine Datenerfassungssoftware wird verwendet, um die EKG-Morphologie zu beurteilen und abnormale Herzfrequenzen, Leitungsstörungen oder EKG-Rhythmen (vorhofe / ventrikuläre ektopische Schläge und Brady- / Tachy-Arrhythmien) zu erkennen (Abbildung 6). Zusätzlich zur Visualisierung der EKG-Morphologie werden di...

Diskussion

Dieser Versuchsaufbau ermöglicht detaillierte simultane Video-EEG-EKG-Oximetrie-Kapnographie-Aufzeichnungen und Analysen bei Kaninchen, insbesondere in Modellen von Herz- und/oder neuronalen Erkrankungen. Die Ergebnisse dieses Artikels zeigen, dass diese Methode in der Lage ist, Anfälle und Arrhythmien zu erkennen und sie von elekrographischen Artefakten zu unterscheiden. Erwartete Ergebnisse wurden erzielt, wenn Kaninchen ein Prokonvulsivum gegeben wurde, das Anfälle induzierte. Die aus den Video-EEG-Aufzeichnungen g...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren bestätigen, dass diese Studie durch Zuschüsse der American Heart Association, der American Epilepsy Society und der SUNY Upstate Department of Pharmacology unterstützt wurde.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible ContainerPFIZER (HOSPIRA)7983-09Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" NeedleSur-VetSS-10L2025Used as a flush after drug injection
4x4 gauze spongesFisher Scientific22-415-469Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple SauceKirkland897971Vehicle for oral medications
ComputerDellOptiplex 5040Acquisition computer
E-4031Tocris1808Agent known to prolong the QT interval
ECG ElectrodeRhythmLinkRLSND116-2.513mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG ElectrodeRhythmLinkRLSP5135-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)Swartz Center for Computational NeuroscienceOpen AccessCan perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapterLinksysUSB3G16Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III SolutionMed-PharmexANADA 200-280Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam paddingGenericN/AReduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock FlushMedlineEMZ50051240To maintain patency of angiocatheter
IR LightBoschEX12LED-3BD-8WFacilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)ADInstrumentsN/AECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gaugeSmiths Medical3060Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)MathWorksN/ARequired to run EEGLAB
MicrophoneSony StereoECM-D570PRecording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White3M1530-1Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorksNatusLC101-8Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)Sigma-Aldrich88580Dilutions prepared in saline
Photic StimulatorGrassPS22Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler12Vwire.comLM-12-100-BLKBundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic StimulatorGrass InstrumentsBZA641035Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipeGenericN/APrevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum AmplifierNatus13926Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox AmplifierNatus2213464-pin breakout box
Rabbit RestrainerPlas-Labs501-TCVarious size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)GenericN/ARaises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clipNONIN61000PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapterNONIN13931XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI OutputSonySRG-X120Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular LuerSur-Vet13882Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer LockSur-VetSRIP2VInjection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-plyCovidien5110To prepare ear vein before catheterization

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