502 laboratuvarı üyelerine makaleyle ilgili teknik destekleri ve yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Pekin Belediyesi Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden elde edildi ve genetik olarak tdTomato etiketli hücre hattına göre tasarlandı.
1. İnsan RO'larının üretimi
<ol><li>hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyin.<ol><li>6 delikli bir plakanın bir oluğunu, üreticinin talimatlarını izleyerek en az yarım saat boyunca 37 ° C'de 1 mL 0.1 mg / mL rea...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

Retinal organoid farklılaşması, bol fonksiyonel retina hücrelerinin oluşumu için arzu edilen bir yöntemdir. RO, pluripotent kök hücreler tarafından nöral retinaya doğru üretilen gangliyon hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler gibi farklı retinal hücrelerin bir bileşimidir 4,5,8,9. Akıcı RO'lar hasat edilebilse de, uzun kültürleme süreleri (180 güne kadar) gerek...

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), kendilerini yenilemeleri ve her türlü somatik hücreye farklılaşma yetenekleri ile karakterize edilir. Böylece, PSC'lerden türetilen organoidler, rejeneratif tıp araştırmalarında önemli bir kaynak haline gelmiştir. Retina dejenerasyonu, fotoreseptörlerin (çubuklar ve koniler) ve retinal pigment epitelinin kaybı ile karakterizedir. Retinal hücre replasmanı bu hastalık için cesaret verici bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, hastalık araştırması ve tedavisi için insan retinası elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, çok katmanlı doğal retina hücrelerini etkili ve başarılı bir şekilde özetleyen PSC'lerden türetilen retinal organoidler (RO'lar), temel ve translasyonel araştırmalar için faydalıdır 1,2,3. Araştırmamız, retinal dejenerasyonu incelemek için yeterli ve kaliteli hücreler sağlamak için RO farklılaşmasına odaklanmaktadır4.
RO'ları farklılaştırma yöntemleri, 2012 yılında Sasai laboratuvarı tarafından öncülük edilen üç boyutlu (3D) süspansiyon farklılaşması ile sürekli olarak ortaya çıkmaktadır5. Fotoreseptör öncü hücrelerini özel olarak izlemek için insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) CRX-tdDomates etiketini tanıttık ve Wnt, TGF-β ve BMP yollarının6 çok işlevli bir antagonisti olan COCO'nun eklenmesiyle yöntemi değiştirdik. COCO'nun fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma verimliliğini etkili bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir 6,7.
Toplamda, klasik farklılaşma yöntemini değiştirerek, laboratuvar araştırmaları yoluyla fotoreseptörlerle ilişkili retina hastalığını analiz etmek ve daha ileri klinik uygulama / transplantasyon için insan RO'larından bol miktarda fotoreseptör öncülleri ve konileri toplamak için erişilebilir bir protokol geliştirdik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

Retina hücre transplantasyonu, retina mimarisini geri yükleyebilen ve dejenere olmuş retinanın görsel yeteneklerini stabilize edebilen veya hatta geliştirebilen umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Bununla birlikte, hücre replasman tedavisindeki ilerleme, şu anda yüksek kaliteli ve standartlaştırılmış insan retinalarının hazır bir kaynağına ihtiyaç duymanın zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu nedenle, deneyler için kolay ve kararlı bir protokole ihtiyaç vardır. Burada, eksojen moleküllerin ve reaktif A'nın yanı sıra üç boyutlu insan retina organoidlerini (RO) üretmek için manuel eksizyonun kullanıldığı kendi kendini organize eden bir yönteme dayanan optimize edilmiş bir protokol geliştiriyoruz. İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (PSC'ler) kaynaklı RO, fotoreseptörler için spesifik belirteçleri ifade eder. Çok fonksiyonlu bir antagonist olan COCO'nun eklenmesiyle, fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma etkinliği önemli ölçüde artar. Hücre hatlarının ve birincil hücrelerin faydalarına sahip olan ve ikincisiyle ilişkili kaynak sorunları olmadan bu sistemin verimli kullanımı, özellikle fotoreseptörler olmak üzere akan retinal hücreler üretebilir. Bu nedenle, PSC'lerin RO'ya farklılaşması, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre nakli için optimal ve biyoilgili bir platform sağlar.

Şematik çizim, COCO ile öncü hücreleri geliştirmek için farklılaşma protokolünü göstermektedir (Şekil 1). PSC'den RO'lara kadar çok sayıda ayrıntı sonuç farklılıklarına neden olabilir. Tüm prosedürü izlemek için her adımın ve hatta her ortamın katalog numarasının ve lot numarasının kaydedilmesi önerilir.
Burada, 6, 12, 18 ve 45. günler için parlak alan görüntüleri sağlıyoruz (Şekil 2). 6. günd...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Bu retina hastalığı için bir modeldir ve in vivo retinayı taklit eder. Bir dereceye kadar, hayvan deneylerinin yerini alabilir. Protokol, retinal organoidlerdeki fotoreseptör öncüllerinin kalitesi ve miktarı için optimize edilmiştir ve fotoreseptör, birkaç geri dönüşümsüz körlük koşulunun anahtarıdır.İnsan embriyotik kök hücrelerini veya hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyerek başlayın. Bunu yapmak için, altı delikli bir plakanın bir kuyuğunu mililitre reaktif A başına bir mililitre 100 mikrogram ile kaplayın ve plakayı en az yarım saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir milyon hESC'lik bir aliquot'u çözün ve beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın.Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri önceden kaplanmış plakaya, iki mililitre reaktif B. ile birlikte tohumlayın.Yaklaşık dört günde yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra hücreleri geçirin. Akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre taze hazırlanmış reaktife aktarın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 3,5 dakika inkübe edin.Plakanın yan ve alt kısımlarını birkaç saniye hareket ettirerek hücreleri ayırın ve 500 mikrolitre hazırlanmış orta olanı ekleyin. Ayrılan hücreleri 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre sayımı için, 900 mikrolitre DPBS'ye 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Kalan hücre süspansiyonunun 900 mikrolitresini, mililitre başına dokuz kez 10 ila dördüncü güç hücresi elde etmek için Petri kabındaki orta bir mikrolitre ile seyreltin. Yapışmayan, V tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca düşük hızlı bir çalkalayıcıda hafifçe döndürün ve ikinci güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.İkinci günde, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 20 mikrolitre% 1 reaktif A ekleyin ve ölü hücreleri dağıtmak için merkezde iki kez pipet ekleyin. Plakanın dibini altıncı güne kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce temizleyin. Altıncı günde, ortamın 58 mikrolitresini 60 mikrolitre taze ortamla değiştirin ve inkübasyona devam edin.12. günde, hücre peletlerini 96 kuyucuklu plakadan 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peletlerin oda sıcaklığında beş dakika boyunca doğal olarak yerleşmesine izin verin. Peletler çöktüğünde, organoidleri rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve hücre agregalarını, reaktif A ile 18 mililitre orta iki içeren 10 santimetrelik bir süspansiyon kabına aktarın. 18. günde, çanakta yarı saydam bir optik vezikülün oluşumunu onaylayın ve üretilen organoidleri mikrocerrahi bir bıçak kullanarak kesin.Tüm kesilmiş peletleri kabın ortasına toplayın. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik konik bir Falcon tüpüne toplayın. Hücreler yerleştiğinde, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peletleri, her tabak için üç tane olmak üzere 18 mililitre orta ile iki adet 10 santimetrelik Petri kabında yeniden askıya alın.Hücre kümelenmesini önlemek için bulaşıkları yavaşça inkübatöre aktarın. Hücreleri kültürlemeye devam edin, ortamı haftalık olarak değiştirin. CRX ifadesini 45. günden 120. güne kadar analiz edin.Bu temsili analizde, insan retina üretiminin çeşitli aşamaları görüntülenir. Altıncı günde, organoidler yaklaşık 600 mikrometre çapında parlak bir jant içinde yoğun bağlantıların bir toplamı olarak ortaya çıktı. 12. günde, optik vezikül benzeri yapıların ilk nesli gerçekleşti.Uygun vezikül benzeri mimariye sahip olmayan organoidler, 18. günde bir Petri kabında kültürlenmeden önce atıldı. Kültürün 30. gününde, vezikül benzeri mimari daha belirgindi ve daha düşük RO'lar kolayca ayırt edilebilir ve çıkarılabilirdi. 45. günden başlayarak, organoidler CRX, RCVRN ve OTX2 gibi fotoreseptör öncüllerinin çeşitli belirteçlerini ifade ettiler.Üstün retinal organoidleri parçalayarak, farklılaşma verimliliği önemli ölçüde artar ve 96 plakadan 100'den fazla üstün organoid toplanabilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Abstract