İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Özet

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

Özet

Retina hücre transplantasyonu, retina mimarisini geri yükleyebilen ve dejenere olmuş retinanın görsel yeteneklerini stabilize edebilen veya hatta geliştirebilen umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Bununla birlikte, hücre replasman tedavisindeki ilerleme, şu anda yüksek kaliteli ve standartlaştırılmış insan retinalarının hazır bir kaynağına ihtiyaç duymanın zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu nedenle, deneyler için kolay ve kararlı bir protokole ihtiyaç vardır. Burada, eksojen moleküllerin ve reaktif A'nın yanı sıra üç boyutlu insan retina organoidlerini (RO) üretmek için manuel eksizyonun kullanıldığı kendi kendini organize eden bir yönteme dayanan optimize edilmiş bir protokol geliştiriyoruz. İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (PSC'ler) kaynaklı RO, fotoreseptörler için spesifik belirteçleri ifade eder. Çok fonksiyonlu bir antagonist olan COCO'nun eklenmesiyle, fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma etkinliği önemli ölçüde artar. Hücre hatlarının ve birincil hücrelerin faydalarına sahip olan ve ikincisiyle ilişkili kaynak sorunları olmadan bu sistemin verimli kullanımı, özellikle fotoreseptörler olmak üzere akan retinal hücreler üretebilir. Bu nedenle, PSC'lerin RO'ya farklılaşması, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre nakli için optimal ve biyoilgili bir platform sağlar.

Giriş

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), kendilerini yenilemeleri ve her türlü somatik hücreye farklılaşma yetenekleri ile karakterize edilir. Böylece, PSC'lerden türetilen organoidler, rejeneratif tıp araştırmalarında önemli bir kaynak haline gelmiştir. Retina dejenerasyonu, fotoreseptörlerin (çubuklar ve koniler) ve retinal pigment epitelinin kaybı ile karakterizedir. Retinal hücre replasmanı bu hastalık için cesaret verici bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, hastalık araştırması ve tedavisi için insan retinası elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, çok katmanlı doğal retina hücrelerini etkili ve başarılı bir şekilde özetleyen PSC'lerden türetilen retinal organoidler (RO'lar), temel ve translasyonel araştırmalar için faydalıdır ^1,2,3. Araştırmamız, retinal dejenerasyonu incelemek için yeterli ve kaliteli hücreler sağlamak için RO farklılaşmasına odaklanmaktadır⁴.

RO'ları farklılaştırma yöntemleri, 2012 yılında Sasai laboratuvarı tarafından öncülük edilen üç boyutlu (3D) süspansiyon farklılaşması ile sürekli olarak ortaya çıkmaktadır⁵. Fotoreseptör öncü hücrelerini özel olarak izlemek için insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) CRX-tdDomates etiketini tanıttık ve Wnt, TGF-β ve BMP yollarının⁶ çok işlevli bir antagonisti olan COCO'nun eklenmesiyle yöntemi değiştirdik. COCO'nun fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma verimliliğini etkili bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir ^6,7.

Toplamda, klasik farklılaşma yöntemini değiştirerek, laboratuvar araştırmaları yoluyla fotoreseptörlerle ilişkili retina hastalığını analiz etmek ve daha ileri klinik uygulama / transplantasyon için insan RO'larından bol miktarda fotoreseptör öncülleri ve konileri toplamak için erişilebilir bir protokol geliştirdik.

Protokol

Bu çalışma Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden elde edildi ve genetik olarak tdTomato etiketli hücre hattına göre tasarlandı.

1. İnsan RO'larının üretimi

1. hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyin.
   1. 6 delikli bir plakanın bir oluğunu, üreticinin talimatlarını izleyerek en az yarım saat boyunca 37 ° C'de 1 mL 0.1 mg / mL reaktif A (Malzeme Tablosu) ile kaplayın. 1x10⁶ hESC'lik bir aliquot'u çözün.
      NOT: 3 mL önceden ısıtılmış reaktif B (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve kriyokorunmuş hücreleri (1 mL) 3 mL taze ortama aktarın. hESC'leri tek hücrelere pipetlemeyin.
   2. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
   3. Hücreleri 2 mL reaktif B ile reaktif A kaplı plakaya tohumlayın ve günde 2 mL reaktif B'yi değiştirin. Pasaj hücreleri yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında (genellikle yaklaşık 4 gün).
2. 0. Gün
   1. hESC'leri ortam I kullanarak tek hücreli bir süspansiyonla ayırın (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak ortam I hazırlayın: %20 (v/v) Nakavt serum replasmanı (KSR), 0,1 mM MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (NEAA), 1 mM piruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL COCO, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol ve Glasgow's Eagle'ın minimal esansiyel besiyeri (GMEM).
      NOT: Ayrışmaya başlamadan önce, ortam I hazırlayın ve 20 μM Y-27632 ile 12 mL ortam I'i 10 cm'lik bir Petri kabına, 0,05 mg/mL reaktif D (Malzeme Tablosu) içeren 500 μL reaktif C'ye (Malzeme Tablosu) ve 1,5 mL'lik bir tüpte 20 μM Y-27632'ye aktarın. Yukarıdaki adımları karanlıkta gerçekleştirin, çünkü ortam I'deki IWR1e bileşeni ışığa duyarlıdır.
   2. hESC'leri önceden ısıtılmış 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) tamponuyla yıkayın.
   3. Hazırlanan 500 μL reaktifi (1,5 mL) tüpe ekleyin ve hESC'leri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 3,5 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Plakanın yan ve alt kısmını birkaç saniye boyunca hareket ettirerek hücreleri ayırın ve Petri kabından hESC plakasına 500 μL hazırlanmış ortam I ekleyin.
      NOT: 900 μL 1x DPBS içeren 1,5 mL'lik bir tüp hazırlayın ve hücre sayımı için bir hemositometre kullanın.
   5. Hücreleri yeni bir 1,5 mL tüpte toplayın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından tüpten 100 μL çıkarın ve ardından hücre sayımı için 900 μL DPBS ile tüpe ekleyin.
   6. Sol 900 μL hücre süspansiyonunu dağıtın ve ardından Petri kabında hazırlanan ortam I ile hücreleri 9 x 10⁴ hücre / mL'ye seyreltin.
      NOT: Ortamın tüm hacmi 12 mL'dir; Toplamda 1.08 x 10⁶ hücre gereklidir.
   7. Yapışmayan, V tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin (Malzeme Tablosu).
      NOT: Süreyi kısaltmak ve her bir kuyucuğun eşdeğer bir hücre numarası içerdiğinden emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanın. 100 μL porsiyonları çıkarmadan önce Petri kabını her seferinde çalkalayın. Hücrelerin eşit olarak dağılmış olması önemlidir.
   8. 96 delikli plakayı düşük hızlı bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca hafifçe döndürün ve ardından 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübe_edin.
      NOT: Plakayı karanlıkta tutun. Günü 0. gün olarak ayarlayın.
3. 2. Gün
   1. % 1 reaktif A (Malzeme Tablosu) ekleyin. 2 mL orta I'e 133.4 μL reaktif A ekleyerek reaktif A'yı (10 mg / mL'lik protein konsantrasyonu) hazırlayın.
      NOT: Tam ve düzgün eritme elde etmek için kullanmadan önce A reaktifini gece boyunca 4 ° C'de tutun. Lütfen ürün bilgilerine dikkat edin ve her bir reaktif A şişesi farklı bir protein konsantrasyonunda olduğu için A reaktifinin protein konsantrasyonuna sahip olmak için şirketin resmi web sitesindeki katalog numarasını ve lot numarasını arayın. Protein konsantrasyonu düşükse, artan miktarda reaktif A yardımcı olacaktır.
   2. Her bir oyuğa 20 μL hazırlanmış reaktif A ekleyin ve ölü hücreleri dağıtmak için merkezde iki kez pipet ekleyin.
      NOT: A reaktifini ve 96 delikli plakayı serin koşullar altında saklayın ve buz üzerindeki tüm adımları tamamlayın. Plakayı karanlıkta yerleştirin.
4. Gün 2-12
   1. 96 delikli plakanın tabanını temizleyin ve 6. güne kadar 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin. 6. günde, her bir kuyucuktan ortamın 58 μL'sini çıkararak ve 60 μL ortam I ekleyerek ortamın yarısını değiştirin.
      NOT: Yarım ortam değişimini tamamlamak için çok kanallı pipet kullanın. Kuyudan hiçbir hücre peletinin çıkarılmadığından emin olmak için bu adımı nazikçe uygulayın. Ortamı temiz bir 10 cm Petri kabına aspire edin. İçinde hücre peletleri varsa, bunları 96 kuyucuklu plakaya geri ekleyin.
5. 12- 18. Gün
   1. 12. günde ortamı orta II'ye değiştirin (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak %1 (v/v) reaktif A kullanarak II. Maddeyi hazırlayın: %10 fetal sığır serumu (FBS), 0.1 mM NEAA, 1 mM piruvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 100 nM SAG dihidroklorür ve GMEM. Serin ve karanlık koşullar altında saklayın.
   2. Hücre peletlerini 96 delikli plakadan 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve peletlerin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca doğal olarak yerleşmesine izin verin.
      NOT: Kabarcıkları önlemek için ortamı ve peletleri yüzeyin altından yavaşça çıkarın.
   3. Organoidlerle ilgilenirken süpernatantı çıkarın. Hücre agregalarını, reaktif A ile 18 mL hazırlanmış ortam II içeren 10 cm'lik bir süspansiyon kabına aktarın.
      NOT: Hazırlanan ortam II'yi 10 cm'lik kaba önceden eklemeyin, çünkü A reaktifi 4 °C'de olmalıdır.
   4. 18. güne kadar 37 °C'de ve %5 CO_2'de inkübe edin.
6. 18. günden itibaren
   1. Ortamı orta III olarak değiştirin (Tablo 1). Aşağıdakileri karıştırarak karanlık koşullar altında ortam III'ü hazırlayın:% 10 FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM retinoik asit (RA), 100 μM taurin, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 1: 1 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) / besin karışımı F-12 karışımı.
   2. 18. günde, yarı saydam bir optik vezikül oluşturulduğunda, organoidleri mikrocerrahi bir bıçak kullanarak kesin.
      NOT: Organoidi, genellikle dört parçaya, orta II'li bir Petri kabında parçalayın. Her parça sonraki haftalarda sağlam bir optik kaba dönüşmelidir.
   3. Tüm peletleri yemeğin merkezine toplayın. Hücreleri 15 mL'lik bir konik şahin tüpüne toplayın ve doğal yerleşmeye izin verin. Sonra süpernatanı yavaşça çıkarın.
      NOT: Organoidler, boyutlarından dolayı, Petri kabını yatay bir düzlemde birkaç kez 90° için bir yönde döndürerek merkezde toplanabilir.
   4. Peletleri, çanak başına 18 mL orta III ile iki adet 10 cm Petri kabına askıya alın ve dağıtın ve hücre kümelenmesini önlemek için bulaşıkları yavaşça inkübatöre aktarın. Orta III'te 37 °C ve% 5 CO_2'de kültürlemeye devam edin ve ortayı haftalık olarak değiştirin. CRX, 45. günden sonra ve 120. güne kadar, fotoreseptörün dış segmentini tespit edebildik.

2. İnsan RO'larını analiz etmek

1. FACS analizi
   1. Kesilmiş 1 mL uçları kullanarak bulaşıklardan üç CRX-tdDomates ve üç H9 ES türevi organoid monte edin. Organoidleri 1 mL önceden ısıtılmış (oda sıcaklığında) DPBS ile yıkayın.
   2. % 0.25 tripsin-EDTA Çözeltisini 0.05 mg / mL reaktif D ile karıştırarak sindirim tamponunu hazırlayın.
   3. Hazırlanan sindirim tamponunu 37 ° C'de 8 dakika boyunca kullanarak organoidleri tek hücrelere ayırın. Daha sonra reaksiyonu inaktive etmek için% 10 FBS ve 0.05 mg / mL reaktif D ile aynı hacimde DPBS ekleyin.
   4. Hücreleri hafifçe askıya alın ve dağıtın ve ardından 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak filtreleyin ve CRX-tdDomates pozitif sinyallerini analiz etmek için 561 nm uyarma lazer hattında ve 780/60 filtrede bir Floresan Aktive Edilmiş Hücre Sıralama (FACS) sistemi kullanın.
      NOT: CRX başlangıçta 45. günde ifade eder ve organoidlerin olgunlaşmasıyla artar. Her test için on bin hücre kullanılır, her zaman noktası için en az üç tekrar tamamlanır.
2. RO'ların floresan yoğunluk ölçümü
   1. Canlı organoidleri görüntüleme için rastgele hazırlayın.
      NOT: Parametreleri ayarlayın ve tüm floresan yoğunluk monitörleri için aynı filtreleri ve parametreleri kullanın.
   2. Görüntüleri yakalayın ve uygun yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin.
   3. Görüntüleri içe aktarın ve ardından Görüntü | kullanarak 8 bit'e dönüştürün Türü.
   4. Image | varsayılan parametreleri kullanarak eşiği ayarlama | ayarlama Eşik.
   5. Ölçülen alanı belirleyin ve ardından Çözümle | kullanarak gri değeri değerlendirin Ölçün.
      NOT: Sonuç panelindeki ortalama değerler, ölçülen alanın ortalama floresan yoğunluğudur.

Sonuçlar

Şematik çizim, COCO ile öncü hücreleri geliştirmek için farklılaşma protokolünü göstermektedir (Şekil 1). PSC'den RO'lara kadar çok sayıda ayrıntı sonuç farklılıklarına neden olabilir. Tüm prosedürü izlemek için her adımın ve hatta her ortamın katalog numarasının ve lot numarasının kaydedilmesi önerilir.

Burada, 6, 12, 18 ve 45. günler için parlak alan görüntüleri sağlıyoruz (Şekil 2). 6. günd...

Tartışmalar

Retinal organoid farklılaşması, bol fonksiyonel retina hücrelerinin oluşumu için arzu edilen bir yöntemdir. RO, pluripotent kök hücreler tarafından nöral retinaya doğru üretilen gangliyon hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler gibi farklı retinal hücrelerin bir bileşimidir 4,5,8,9. Akıcı RO'lar hasat edilebilse de, uzun kültürleme süreleri (180 güne kadar) gerek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049