Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

Resumen

Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Resumen

Un protocolo de extracción de ADN recientemente publicado utilizando perlas magnéticas y un instrumento automatizado de extracción de ADN sugirió que es posible extraer ADN de alta calidad y cantidad de un mosquito individual bien conservado suficiente para la secuenciación del genoma completo aguas abajo. Sin embargo, la dependencia de un costoso instrumento automatizado de extracción de ADN puede ser prohibitiva para muchos laboratorios. Aquí, el estudio proporciona un protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico, que es adecuado para un rendimiento bajo a medio. El protocolo descrito aquí se probó con éxito utilizando muestras individuales de mosquitos Aedes aegypti. Los costos reducidos asociados con la extracción de ADN de alta calidad aumentarán la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.

Introducción

El desarrollo reciente de un protocolo mejorado de extracción de ADN¹ ha permitido muchos estudios posteriores de alto impacto que involucran la secuenciación delgenoma completo^2,3,4,5,6. Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas proporciona un rendimiento de ADN confiable de muestras individuales de mosquitos, lo que a su vez reduce el costo y el tiempo asociados con la adquisición de un número suficiente de muestras de colecciones de campo.

Los avances recientes en la genómica de la población y el paisaje están directamente correlacionados con la disminución de los costos de la secuenciación del genoma completo. Aunque el protocolo de extracción de ADN¹ anterior aumenta las eficiencias asociadas con la secuenciación de alto rendimiento, los laboratorios / estudios más pequeños sin los fondos pueden optar por no usar estas nuevas y poderosas herramientas de genómica de poblaciones y paisajes debido a los costos de implementación del protocolo (por ejemplo, los costos de los instrumentos especializados).

Aquí, se presenta un protocolo de extracción de ADN modificado que utiliza un paso de extracción de perlas magnéticas similar al de Neiman et al.¹ para obtener ADN de alta pureza, pero no depende de instrumentos de alto costo para la lisis tisular y la extracción de ADN. Este protocolo es adecuado para experimentos que requieren >10 ng de ADN de alta calidad.

Protocolo

1. Almacenamiento general de muestras y preparados antes de la extracción de ADN

1. Hidratar la muestra en 100 μL de agua de grado PCR durante 1 h (o durante la noche) a 4 °C si la muestra se ha almacenado en alcohol >70% para ablandar el tejido.

2. Interrupción de la muestra

1. Establezca una incubadora o un bloque de calor de agitación a 56 °C.
2. Haga la mezcla del almacenador intermediario/de la enzima de la proteinasa K (PK). Se requieren 2 μL de proteinasa K (100 mg/mL) y 98 μL de tampón de proteinasa K (total 100 μL) para cada extracción individual de mosquitos. Para preparar una mezcla maestra para múltiples especímenes, aumente la cantidad total (combinada para todos los especímenes individuales) en ~ 15% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.
3. Si las muestras se hidrataron antes de la extracción, deseche el agua de cada tubo de muestra.
4. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga tejido de mosquito, agregue 100 μL de tampón PK/mezcla de enzimas.
5. Homogeneizar el tejido usando el tubo de microcentrífuga pestle.
6. Centrifugar las muestras durante 1 min a 9.600 x g a temperatura ambiente.
7. Incubar la muestra durante 2-3 h a 56 °C.
8. Durante la incubación, prepare los otros reactivos utilizando la etapa de extracción de ADN (paso 3).

3. Extracción de ADN

1. Hacer una mezcla maestra de cuentas magnéticas. Para cada muestra, mezcle 100 μL de tampón de lisis, 100 μL de isopropanol y 15 μL de perlas magnéticas (total 215 μL). Para preparar una mezcla maestra para múltiples reacciones, aumente la cantidad total (combinada para todas las muestras individuales) en ~ 20% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.
2. Después del tiempo de incubación (paso 2.7), transferir cada lisato a un tubo de microcentrífuga limpio o a un pozo de microplacas utilizando pipeta.
3. Agregue 100 μL de lisato y 215 μL de la mezcla maestra de perlas magnéticas a cada muestra.
4. Use una pipeta para mezclarla bien durante 10-20 s y luego déjela reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agite suavemente el tubo de vez en cuando para maximizar la unión de las perlas magnéticas y el ADN.
5. Coloque el tubo/placa en el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.
6. Deseche el líquido del tubo/placa usando pipeta. Al retirar el sobrenadante, trate de no tocar ni perturbar las perlas magnéticas que sostienen el ADN.
7. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 325 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.
8. Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
9. Repita los pasos 3.5-3.6.
10. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.
11. Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
12. Repita los pasos 3.5-3.6.
13. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada muestra.
14. Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
15. Repita los pasos 3.5-3.6.
16. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada pozo.
17. Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
18. Repita los pasos 3.5-3.6.
19. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 100 μL de tampón de elución a cada pozo.
20. Mezclar bien e incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
21. Mueva el tubo/placa sobre el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.
22. Pipetee el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga limpia de 0,5 o un pozo de microplaca.
23. Almacene las muestras de ADN a 4 °C (hasta 1 semana) o -80 °C.  Si se está utilizando una microplaca, cúbrala con parafilm.
24. Determine los rendimientos de ADN utilizando cualquier método apropiado.
    NOTA: En este estudio, la lectura y la absorbancia del fluorómetro de la DNA en 260/280 nanómetro fueron utilizadas.

Resultados

El rendimiento promedio de ADN por cabeza de mosquito individual/tejido de tórax fue de 4.121 ng/μL (N = 92, desviación estándar 3.513) medido usando un fluorómetro cuando se elutía usando 100 μL de tampón de elución. Esto es suficiente para los requisitos de entrada de ADN genómico de 10-30 ng necesarios para la construcción de la biblioteca del genoma completo^1,7. La cantidad de ADN puede variar entre 0.3-29.7 ng/μL dependiendo del tamaño corporal ...

Discusión

El protocolo descrito aquí se puede adaptar para otras especies de insectos. La versión original del protocolo introducido en Nieman et al.¹ ha sido probada en múltiples especies, incluyendo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, y Keiferia ly...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer